LC-MS/MS法測定人血漿中卡絡(luò)磺鈉的濃度趙華，宋敏，杭太俊(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，南京 210009)摘要 目的：建立人血漿中卡絡(luò)磺鈉濃度的LC-MS/MS測定法，并用于卡絡(luò)磺鈉的人體藥代動力學(xué)研究。方法：24名健康志愿者單劑量口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊，于服藥前及后0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0和8.0h分別采集血樣，APCI正離子化LC-MS/MS法測定血漿中卡絡(luò)磺鈉的濃度。結(jié)果：卡絡(luò)磺鈉LC-MS/MS測定法在0.5 ngmL-150 ngmL-1范圍呈現(xiàn)良好線性，方法回收率為92.0%101.0%。批內(nèi)、批間精密度RSD分別為1.18%1.52%和5.51%9.84%。主要血漿藥動學(xué)參數(shù)Cmax為(20.92 8.35) ngmL-1，Tmax為(1.16 0.51) h，t1/2為(2.51 0.95) h，MRT為(4.11 1.09) h，AUC0-8為(65.87 25.31) hngmL-1，AUC0-為(75.53 28.63) hngmL-1，Vz/F為(5071.68 2713.88) L，CL/F為(1311.10 386.55) Lh-1。結(jié)論：健康志愿者單劑量口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊后，卡絡(luò)磺鈉血漿濃度-時間曲線符合二房室模型。Cmax在9.77 ngmL-138.88 ngmL-1范圍，Tmax在0.5 h3 h范圍，個體差異較大。關(guān)鍵詞：卡絡(luò)磺鈉；藥代動力學(xué)；LC-MS/MS Determination of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma by LC-MS/MSZHAO Hua*作者簡介: 趙華，女，藥物分析碩士研究生 Tel: (025)83271090 E-mail: , Song Min, HANG Tai-jun(Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, NanJing, 210009，China)Abstract Objective: To establish an LC-MS/MS method for the determination of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma and study its pharmacokinetics. Methods: A single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules was given to each of 24 Chinese healthy volunteers. Blood samples were collected before and 0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0, 8.0 h after the administration. The drug plasma concentrations were determined by a validated LC-MS/MS method in APCI positive ion mode. Results: The calibration curve of the LC-MS/MS method was linear in the range of 0.5 ngmL-1-50 ngmL-1 with the accuracy from 90% to 105%. The intra-day and inter-day precession (RSD) were 1.18%-1.52% and 5.51%-9.84%, respectively. The main pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium sulfonate after a single oral dose 90mg were as follows, Cmax (20.92 8.35) ngmL-1，Tmax (1.16 0.51) h，t1/2 (2.51 0.95) h，MRT (4.11 1.09) h，AUC0-8 (65.87 25.31) hngmL-1，AUC0- (75.53 28.63) hngmL-1，Vz/F (5071.68 2713.88) L，CL/F (1311.10 386.55) Lh-1. Conclusion: The plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate fits two compartment models after oral dose of 90 mg capsules. The ranges of Cmax and Tmax were 9.77 ngmL-1 - 38.88 ngmL-1 and 0.5h -3h that means there was great individual difference in the absorption and distribution process of carbazochrome sodium sulfonate.KEY WORDS: carbazochrome sodium sulfonate; pharmacokinetics; LC-MS/MS卡絡(luò)磺鈉(Carbazochrome Sodium Sulfonate)是新一代止血劑，為卡巴克洛(安絡(luò)血)的衍生物(圖1)，它在分子結(jié)構(gòu)上引入磺酸鈉基團，克服了卡巴克洛溶解度小、必須由水楊酸助溶的缺點，使這一化合物產(chǎn)生了明顯的止血效果。臨床主要用于泌尿系統(tǒng)、上消化道、呼吸道和婦產(chǎn)科疾病出血，亦可用于外傷和手術(shù)出血1等的治療。目前還未見國內(nèi)外有關(guān)卡絡(luò)磺鈉血漿藥物濃度測定及其藥動學(xué)研究的報道。國外文獻報道主要集中于卡絡(luò)磺鈉藥理學(xué)研究2及新劑型的研究上3。體液中卡絡(luò)磺鈉濃度測定的難點在于濃度低、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾大。本文分別考察了卡絡(luò)磺鈉在不同色譜柱以及在不同pH條件下的色譜保留行為；優(yōu)化了卡絡(luò)磺鈉血漿樣品的處理條件；采用大氣壓化學(xué)離子化(APCI)方式 選擇性反應(yīng)離子監(jiān)測(SRM)模式檢測卡絡(luò)磺鈉特征碎片離子，最大程度上避免了內(nèi)源性物質(zhì)干擾，建立了卡絡(luò)磺鈉血漿濃度的專屬靈敏度的LC-MS/MS測定方法，并對24名健康志愿者口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊后的藥動學(xué)進行了研究。圖1卡絡(luò)磺鈉(A) 與鹽酸阿米洛利(B,內(nèi)標(biāo)) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig1 Chemical structures of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride hydrochloride (B, internal standard)1 儀器、試藥Finnigan TSQ Quantum Ultra三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀, Xcalibur 1.2工作站, Thermo Surveyor 液相色譜儀(美國熱電公司)?？ńj(luò)磺鈉膠囊(南通久和藥業(yè)有限公司，10mg每粒)；卡絡(luò)磺鈉對照品(南通久和藥業(yè)有限公司；純度99.3%)，內(nèi)標(biāo)鹽酸阿米洛利(購自中國生物制品鑒定所；純度99.5%)；甲醇(色譜純，美國TEDIA產(chǎn)品)，超純水(自制)。2 試驗條件2.1 色譜條件LiChrospher ODS-2(150 mm4.6 mm，5 mm) 色譜柱；甲醇(A)-0.2%甲酸水溶液(B)流動相，采用梯度洗脫：0 min(10%A)2 min(10%A)4 min(60%A)6 min(60%A) 6.1 min(10%A)7 min(10%A)；流速1.0 mL.min-1；進樣量20 mL。2.2 質(zhì)譜條件 正離子大氣壓化學(xué)離子化(APCI)，選擇性反應(yīng)離子監(jiān)測(SRM)，檢測卡絡(luò)磺鈉的離子反應(yīng)為m/z 148.030 eV m/z 107.0；檢測鹽酸阿米洛利(內(nèi)標(biāo))的離子反應(yīng)為m/z 230.020eV m/z 171.0。放電電流10 A，毛細管溫度350，鞘氣壓力2.41105 Pa，離子吹掃氣壓力6.90 103 Pa；輔助氣壓力6.90 104 Pa。2.3 統(tǒng)計方法 測得的志愿者血漿中卡絡(luò)磺鈉濃度-時間數(shù)據(jù)使用DAS 2.0統(tǒng)計軟件處理。3 試驗方法3.1 志愿者及給藥方案 24名年輕健康男性志愿者，經(jīng)體檢證實心、肝、腎功能正常，試驗前2周及試驗期間未用其他任何藥物，試驗前經(jīng)倫理委員會審批和簽署知情同意書。服藥前志愿者禁食過夜(10小時以上)，于次日早晨8:00空腹服用試驗用卡絡(luò)磺鈉膠囊(10 mg/粒)9粒，用200 mL溫開水送服。每例志愿者均于服藥前5 min在前臂靜脈安置留置針,抽取空白血樣5 ml。并分別于服藥后0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0和8.0h各采血5 mL，血樣標(biāo)本收集于干燥、潔凈并經(jīng)過肝素抗凝處理的玻璃管內(nèi)，離心分離血漿，血漿樣本置- 20 冰箱保存待測。服藥后1 h可飲水，4 h進統(tǒng)一清淡飲食。3.2 溶液的配制 卡絡(luò)磺鈉標(biāo)準溶液：取卡絡(luò)磺鈉對照品約5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，以甲醇-水(50:50)為溶劑溶解并定容至刻度，搖勻，得儲備液，并定量稀釋配制成5,10, 25, 50, 100, 200, 250和500 ngmL-1的系列標(biāo)準溶液。鹽酸阿米洛利(內(nèi)標(biāo))溶液：取鹽酸阿米洛利對照品約5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，以甲醇-水(50:50)為溶劑溶解定容至刻度，搖勻，并定量稀釋配制成50 ngmL-1溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。3.3 血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品0.5 mL，置1.5 mL聚塑離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液液50 mL，加入14高氯酸100 mL，沉淀蛋白，渦旋2 min，12500 g離心10 min，分取上清液作為供試液，取20 mL進行LC-MS/MS分析。4 方法學(xué)評價4.1 專屬性 測得卡絡(luò)磺鈉和鹽酸阿米洛利APCI正離子全掃描質(zhì)譜及其母離子的CID二級質(zhì)譜分別如圖2和圖3所示，質(zhì)譜裂解過程如圖4。上述色譜條件下測得空白血漿、空白血漿添加卡絡(luò)磺鈉和內(nèi)標(biāo)、及志愿者服藥1.0 h后血漿樣品的典型色譜如圖5所示。由圖可見卡絡(luò)磺鈉的保留時間約為6.14 min，內(nèi)標(biāo)的保留時間約為6.03 min。內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，能準確測定血漿中卡絡(luò)磺鈉的濃度，本方法具有較高的專屬性。圖2 卡絡(luò)磺鈉(A) 和阿米洛利(B) 全掃描質(zhì)譜圖Fig. 2 Positive APCI full scan mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)圖3 卡絡(luò)磺鈉(A) 和阿米洛利(B)的二級質(zhì)譜掃描圖Fig. 3 Positive APCI product ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)圖4 卡絡(luò)磺鈉(A)與阿米洛利(B)的質(zhì)譜裂解過程Fig. 4 Proposed APCI-MS fragmentation processes for carbazochrome sodium sulfonate and amiloride圖5 卡絡(luò)磺鈉血漿樣品濃度LC-MS/MS測定典型圖A.空白血漿； B.空白血漿添加卡絡(luò)磺鈉(tR=6.14 min, C=2.5 ng.mL-1)，內(nèi)標(biāo)(tR=6.01 min, C=5.0 ng.mL-1)；C.志愿者服藥1.5 h后血漿樣品卡絡(luò)磺鈉(tR=6.14 min, C=33.5 ng.mL-1，內(nèi)標(biāo)(tR=6.03 min, C=5.0 ng.mL-1).Fig. 5 Representative chromatograms(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 2.5 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min) and 5.0 ngmL-1of amiloride hydrochloride (tR=6.01 min); (C) sample plasma collected 1.5 hours after oral administration of carbazochrome sodium sulfonate capsule (90 mg) carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min, C 33.5ngmL-1; internal standard tR=6.03 min, C 5.0 ngmL-1)4.2 線性范圍和定量下限 精密吸取各濃度“卡絡(luò)磺鈉標(biāo)準溶液”50 mL，分別置1.5 mL聚塑離心管中，精密加入空白血漿0.5 mL，配制成卡絡(luò)磺鈉濃度為0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 25和50 ngmL-1的血漿樣本。按上述“血漿樣品處理方法”，自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 mL”起同樣操作，并進行色譜分析，記錄卡絡(luò)磺鈉色譜峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積(Ar)。以峰面積比R(R= As/Ar)對濃度(C, ngmL-1)進行線性回歸分析，回歸方程為：R =0.05033C+0.005430， r=0.9999 (0.50-50.0 ngmL-1)?？ńj(luò)磺鈉最低定量限(LLOQ)為0.5 ngmL-1，靈敏度良好。4.3 回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗 配制濃度分別為1.0 , 10和20 ngmL-1的血漿樣本各5份。按“3.4”項下自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 L”起操作，測定卡絡(luò)磺鈉與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積(As)。取甲醇-0.2%甲酸水(60:40)代替血漿，配制濃度分別為1.0 , 10和20 ngmL-1的溶液，各精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 L和加入適量甲醇-0.2%甲酸水(60:40)配制為對照品溶液，測定卡絡(luò)磺鈉與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積(Ar)。取空白血漿0.5mL加14高氯酸0.1mL沉淀蛋白后分取上清液，再分別加入配制濃度為1.0 , 10或20 ngmL-1血漿樣品0.5mL相同量的標(biāo)準溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，測定卡絡(luò)磺鈉與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積(Am)。按As/Am100計算，即得絕對回收率；Am/Ar100計算，即得基質(zhì)效應(yīng)。將各濃度樣本與內(nèi)標(biāo)的面積比R代入血漿隨行標(biāo)準曲線，計算測定濃度，并與加入濃度比較，即得卡絡(luò)磺鈉的相對回收率。結(jié)果見表1。方法回收率良好，基質(zhì)效應(yīng)不明顯89.4104.4，表明本方法準確度良好。表1 血漿中卡絡(luò)磺鈉回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果 Tab.1 Summary of assay recovery and matrix effect of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma4.4 批內(nèi)、批間精密度試驗 多批次(n=3)配制濃度分別為1.0 , 10和20 ng.mL-1的血漿樣本各5份，并分別進行測定。測定結(jié)果(表2)，批內(nèi)和批間測定精密度良好(RSD%分別1.181.52%，5.5113.6%)。表2 血漿中卡絡(luò)磺鈉精密度試驗結(jié)果Tab 2 The intra- and inter- day precision and accuracy for carbazochrome sodium sulfonate 4.5 穩(wěn)定性考察 對照品溶液在5冰箱中放置12 h及24 h、含藥血漿在室溫下放置12 h、含藥血漿反復(fù)凍融3次及含藥血漿-20冰箱長期放置5 d、15 d、30 d等條件下穩(wěn)定性均良好，10 ngmL-1濃度測定值的RSD均小于15。5 藥動學(xué)參數(shù)計算結(jié)果24名健康志愿者單劑量口服90 mg卡絡(luò)磺鈉膠囊，測得平均血藥濃度-時間曲線見圖6。主要藥動學(xué)參數(shù)見表3。表3 24名志愿者口服9粒卡洛磺鈉膠囊(10mg/粒)后的卡絡(luò)磺鈉主要藥代動力學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium sulfonate after a single oral administration of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules in 24 Chinese healthy male volunteers圖6 24名健康志愿者單劑量口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊后血漿卡絡(luò)磺鈉平均濃度-時間曲線Fig. 6 Mean plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate in 24 healthy volunteers after single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules6 討論卡絡(luò)磺鈉含有弱堿性的縮氨脲基團和與強堿成鹽的磺酸根基團，在水中顯兩性，液相色譜保留行為多樣。分別比較了酸性和堿性條件下卡絡(luò)磺鈉在SAX柱，C18柱，PFP柱和C8柱上的保留行為。結(jié)果卡絡(luò)磺鈉在酸性條件下C18柱上保留較強4，并且質(zhì)譜檢測時離子化效率較高。為了獲得良好的反相色譜保留強度、與內(nèi)源性成分較好分離、抑制基質(zhì)效應(yīng)，選擇甲醇-0.2%甲酸水流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫?？ńj(luò)磺鈉極性大、水溶性強，考慮采用蛋白沉淀法處理血漿樣品。比較了甲醇、乙腈、14高氯酸及7高氯酸等沉淀劑對卡絡(luò)磺鈉回收率的影響。結(jié)果，14高氯酸的絕對回收率在90左右，而且在酸性條件下，血漿樣品內(nèi)源性物質(zhì)干擾的影響可有效得到控制，血漿處理過程簡單，沉淀劑用量少，不影響測定靈敏度。試驗考察了卡絡(luò)磺鈉的電噴霧離子化(ESI)和大氣壓化學(xué)離子化(APCI)方式，以及正、負離子檢測模式。結(jié)果顯示，采用ESI正離子檢測，樣品內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，無法準確測定；采用ESI負離子檢測，內(nèi)源性物質(zhì)干擾小，但樣品測定靈敏度低，無法滿足低濃度點測定要求；采用APCI負離子檢測，無特征離子；采用APCI正離子檢測特征碎片離子，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，靈敏度高。優(yōu)化并確定了正離子APCI選擇性離子反應(yīng)檢測(SRM)參數(shù)，獲得了專屬性強、分析時間短、靈敏度高的卡絡(luò)磺鈉血漿樣品測定條件，最低定量限為0.5 ngmL-1?？ńj(luò)磺鈉為縮氨基脲類衍生物，母環(huán)為吲哚環(huán)。根據(jù)質(zhì)譜檢測條件、測得質(zhì)譜并參考文獻5推斷相應(yīng)的離子反應(yīng)裂解途徑如下：在APCI源中，樣品受高溫作用，磺酸根與吲哚環(huán)相連價鍵斷裂，離子化產(chǎn)生m/z 219的離子，其縮氨基脲上的質(zhì)子可進一步發(fā)生源內(nèi)重排裂解后主要產(chǎn)生m/z 148離子。經(jīng)CID作用m/z 148離子特征性地裂解丟失中性分子乙腈并可擴環(huán)生成穩(wěn)定的m/z 107氮雜桌環(huán)離子。本試驗采用選擇性反應(yīng)檢測(SRM)測定特征離子反應(yīng)m/z 148.0 30 eV m/z 107.0，專屬性強，檢測靈敏度高，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾，實現(xiàn)了血漿中卡絡(luò)磺鈉濃度的高靈敏準確測定。而選用m/z 219離子對卡絡(luò)磺鈉進行SRM (m/z 21918 eV m/z 146) 測定時，內(nèi)源性空白干擾嚴重，無法準確測定（圖7）。健康志愿者單劑量口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊后，卡絡(luò)磺鈉血漿濃度-時間曲線符合二房室模型。Cmax在38.889.77 ngmL-1范圍，Tmax在0.53h范圍，個體差異較大。圖7 選擇m/z 219離子測定卡絡(luò)磺鈉時空白血漿(A)及標(biāo)曲中濃度點(10 ng.mL-1 )(B)色譜圖Fig.7 chromatograms of carbazochrome sodium sulfonate with select of m/z 219 ion(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 10 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=4.60 min)圖1卡絡(luò)磺鈉(A) 與鹽酸阿米洛利(B,內(nèi)標(biāo)) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig1 Chemical structures of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride hydrochloride (B, internal standard)AB圖2 卡絡(luò)磺鈉(A) 和阿米洛利(B) 全掃描質(zhì)譜圖Fig. 2 Positive APCI parent ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)AB圖3 卡絡(luò)磺鈉(A) 和阿米洛利(B)的二級質(zhì)譜掃描圖Fig. 3 Positive APCI product ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)圖4 卡絡(luò)磺鈉(A)與阿米洛利(B)的質(zhì)譜裂解過程Fig. 4 Proposed APCI-MS fragmentation processes for carbazochrome sodium sulfonate and amilorideABC圖5 卡絡(luò)磺鈉血漿樣品濃度LC-MS/MS測定典型圖A.空白血漿； B.空白血漿添加卡絡(luò)磺鈉(tR=6.14 min, C=2.5 ng.mL-1)，內(nèi)標(biāo)(tR=6.01 min, C=5.0 ng.mL-1)；C.志愿者服藥1.5 h后血漿樣品(卡絡(luò)磺鈉tR=6.14 min, C=33.5 ng.mL-1，內(nèi)標(biāo)tR=6.03 min, C=5.0 ng.mL-1)Fig.5 Representative chromatograms(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 2.5 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min) and 5.0 ngmL-1of amiloride hydrochloride (tR=6.01 min); (C) sample plasma collected 1.5 hours after oral administration of carbazochrome sodium sulfonate capsule (90 mg) carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min, C 33.5ngmL-1; internal standard tR=6.03 min, C 5.0 ngmL-1)圖6 24名健康志愿者單劑量口服90mg卡絡(luò)磺鈉膠囊后血漿卡絡(luò)磺鈉平均濃度-時間曲線Fig. 6 Mean plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate in 24 healthy volunteers after single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsulesAB圖7 選擇m/z 219離子測定卡絡(luò)磺鈉時空白血漿(A)及標(biāo)曲中濃度點(10 ng.mL-1 )(B)色譜圖Fig.7 chromatograms of carbazochrome sodium sulfonate with select of m/z 219 ion(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 10 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=4.60 min)表1 血漿中卡絡(luò)磺鈉回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果 Tab 1 Summary of assay recovery and matrix effect of carbazochrome sodium sulfonate in human plasmaadded concentrationRelative recoveryAbsolute recoverymatrix effectng.mL-1XSD/%RSD%XSD/%RSD%XSD/%1.0101.04.84.989.42.21099.25.05.1101.40.782090.63.2表2 血漿中卡絡(luò)磺鈉精密度試驗結(jié)果Tab 2 The intra- and inter- day precision and accuracy for carbazochrome sodium sulfonate theoretical concentration ng.ml-11.001020batch one1.099.0120.950.989.0119.730.939.2119.271.049.3318.701.039.1220.57batch two1.0810.0820.770.989.7120.541.019.2620.441.0210.6720.851.0510.6720.30batch three1.179.8919.041.1410.7119.081.0810.4321.321.0310.1619.611.1010.0019.16Mean1.059.8220.02DIF%4.79-1.820.11inter-day RSD%9.8413.65.51intra-day RSD%1.521.261.18表3 24名志愿者口服9?？寤氢c膠囊(10mg/粒)后的卡絡(luò)磺鈉主要藥代動力學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium s