武漢大學病理教研室 免疫組織化學技術的定義 免疫組織化學技術 Immunohistochemistry IHC 是用標記的特異性抗體 或抗原 對組織內的抗原 或抗體 的分布進行定位 定性 定量檢測 經(jīng)過組織化學呈色反應在組織原位顯示抗原 或抗體 如各種蛋白質 多肽 磷脂和多糖等成分的一門新技術 武漢大學病理教研室 免疫組織化學的應用 IHC通過檢測細胞內 細胞表面或細胞間的正?；虍惓５奈镔| 以研究組織細胞的正常生理 代謝及疾病的病因 發(fā)病機理 廣泛用于各種蛋白質或肽類物質表達水平的檢測 細胞屬性的判定 淋巴細胞的免疫表型分析 細胞增殖和凋亡的研究 以及細胞周期和信號轉導的研究等 武漢大學病理教研室 實驗名稱 鏈霉菌親和素 過氧化物酶連結法 Streptavidin PeroxidaseConjugatedMethod 簡稱S P法 檢測胃癌組織CK Vimentin的蛋白表達 武漢大學病理教研室 S P法原理示意圖 過氧化物酶 鏈酶親和素 生物素 生物素化二抗 特異性一抗 待測抗原 武漢大學病理教研室 免疫組織化學基本實驗流程 武漢大學病理教研室 具體步驟如下 1 石蠟切片二甲苯脫蠟 梯度酒精水化 以0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 2 所有組織均采用微波修復抗原 3 室溫冷卻后 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 4 滴加50 l過氧化物酶阻斷液 試劑A 37 濕盒孵育10min 5 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 6 滴加非免疫性動物血清 試劑B 37 濕盒孵育10min 武漢大學病理教研室 7 甩去多余血清 分別滴加 種抗體 4 濕盒孵育過夜 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 8 滴加生物素標記的二抗 試劑C 37 濕盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 9 滴加鏈親和素 過氧化物酶溶液 試劑D 37 濕盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 10 每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺 DAB 顯色液 光鏡下控制反應時間 約為1 5min 自來水充分沖洗 蘇木素復染 11 常規(guī)脫水 透明 中性樹膠封片并鏡檢分析 12 陽性對照采用已知陽性片為標準 陰性對照采用PBS取代第一抗體 其余步驟相同 武漢大學病理教研室 實驗流程中的注意事項 內源性過氧化物酶的滅活血清封閉沖洗抗體選擇及一抗孵育時間檢測及顯色系統(tǒng)復染 武漢大學病理教研室 染色前處理 取材 脫水 浸蠟 組織及時固定固定劑選擇 10 中性緩沖福爾馬林4 多聚甲醛常規(guī)下固定8 24小時取材厚度 2mm 武漢大學病理教研室 染色前處理 預防脫片 常選用多聚耐氨酸 poly L lysine 注意 1 應嚴格控制使用次數(shù)2 玻片潔凈度 武漢大學病理教研室 染色前處理 包埋與切片 包埋 選擇低熔點石蠟 溫度不超過62 切片 厚度3 4 m烤片 溫度60 時間1小時 或60 2小時 邁新 或60 過夜 武漢大學病理教研室 染色前處理 切片保存 切片不宜長時間在常溫下保存 武漢大學病理教研室 染色前處理 脫臘 原則 免疫組化的脫蠟試劑應與常規(guī)HE脫蠟分開 武漢大學病理教研室 實驗操作中的應用 抗原修復實驗操作中的注意事項 武漢大學病理教研室 抗原修復 影響染色結果的最關鍵因素抗原修復方法分類1 酶消化法2 加熱法 高壓法 水煮法 微波法 抗原修復液的選擇1 檸檬酸鹽緩沖液 PH7 2 7 4 2 Tris PH7 8 3 EDTA PH8 0 武漢大學病理教研室 內源性過氧化物酶的滅活 存在部位 紅細胞 橫紋肌細胞 粒細胞 單核細胞 肝細胞及腎細胞消除方法 3 H2O2浸泡10分鐘 武漢大學病理教研室 血清封閉 目的 減少非特異性著色時間 一般在加載一抗之前使用 武漢大學病理教研室 沖洗 一般采用PBS PH7 4 7 6 充分沖洗增加效果可加入Tween20 武漢大學病理教研室 一抗孵育時間及抗體選擇 應選擇信譽高 質量好的試劑公司抗體切忌反復凍融一抗為濃縮液時 需選擇最佳稀釋濃度按說明書可采用37 1 2小時或4 冰箱過夜 武漢大學病理教研室 檢測及顯色系統(tǒng) 一般采用以生物素標記的辣根過氧化物酶為基礎的檢測方法 如SP LSABC ABC等顯色方法 經(jīng)常采用辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測 武漢大學病理教研室 顯色系統(tǒng) 常用的酶1 辣根過氧化物酶 HRP A 顯色底物DAB 棕黃色敏感度高 定位清晰 易于觀察 保存B 顯色底物AEC 磚紅色2 堿性磷酸酶 AP 顯色底物 BCIP NBT 藍紫色 武漢大學病理教研室 復染 原則 注意兩者之間對比 突出陽性信號 武漢大學病理教研室 實驗對照設計 原則 所有檢測指標均設陽性對照 陰性對照 武漢大學病理教研室 結果分析 1 特定的定位胞膜型 胞漿型 全漿型或胞核型 局限性或彌散性 武漢大學病理教研室 免疫組化標準化照片 武漢大學病理教研室 2 染色的不均一性陽性切片的染色應分布不均 片狀或點