密級(jí)：無 論文編號(hào)： 學(xué)位論文 人 胸腺素 1基因及 乳鐵蛋白 基因 在 番茄 中表達(dá) 的研究 F 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 i 摘 要 胸腺素 1(人體中樞免疫器官胸腺所分泌的一種免疫活性極強(qiáng)的多肽激素， 其主要功能是促進(jìn) T 細(xì)胞功能，促進(jìn)特異性抗體和細(xì)胞素的產(chǎn)生，起著加強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的作用，可以治療自身免疫疾 病如紅斑 狼瘡 、慢性乙肝、丙肝等，還可作為治療癌癥的輔助藥物 。但是，人體胸腺 到 20 歲前后即開始萎縮， 量也隨之下降，因此本研究將 因?qū)敕?，以期開發(fā)通過口服方式增加人體免疫力的新型保健產(chǎn)品。同時(shí) ，我們還將大量存在于人初乳中， 具有廣譜抗菌 、 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫 機(jī)能、 抑制人體腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)等多種功能的人乳鐵蛋白（ 碼基因也導(dǎo)入了番茄。 本研究首先 根據(jù)植物偏愛密碼子優(yōu)化了人 后人工合成了 由于 因非常小，為了增加其在植物中的表達(dá)量，我們嘗試將它首尾相連形成四聯(lián)體 ，每個(gè)單體之間由腸激酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列隔開，表達(dá)出的四聯(lián)體小肽通過口服進(jìn)入腸道后會(huì)被腸激酶分解成單體小肽而發(fā)揮作用。 因 、 基因及經(jīng)過密碼子優(yōu)化的 因被克隆到雙元 載體 ，構(gòu)建了植物表達(dá)載體 時(shí)我們還根據(jù)已報(bào)道的番茄果實(shí)成熟過程中受乙烯調(diào)控的果實(shí)特異性表達(dá)的 因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)了引物，克隆了番茄中蔬 5 號(hào)的 動(dòng)子，并構(gòu)建了由 動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 因表達(dá)的載體 及分別由 動(dòng)子 驅(qū)動(dòng) 因 和 因基因表達(dá)的雙價(jià)植物表達(dá)載體 建好的植物表達(dá)載體利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株 ，并侵染了番茄子葉外植體，經(jīng)過卡那霉素篩選，最終得到了再生植株 67 株。 再 生植株經(jīng) 測(cè)，確定了轉(zhuǎn)基因植株。除了使用 動(dòng)子的植株由于果實(shí)尚未成熟不能檢測(cè)以及 分子量太小不能進(jìn)行電泳分析外，對(duì)其它轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)進(jìn)一步進(jìn)行了 測(cè)，證明有多株植株分別表達(dá)了 和 茄果實(shí)的 量分析顯示，轉(zhuǎn)化了 果實(shí)中 量 為 g 果實(shí)鮮重 ，轉(zhuǎn)化了和 果實(shí)中 量為 g 果實(shí)鮮重 。串聯(lián)的 因不 但在番茄中表達(dá)了，而且平均表達(dá)量比含單體 因的番茄高出 g 果實(shí)鮮重 。 轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)的 和 別經(jīng)過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和抑菌實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)初步檢測(cè)到了生物活性，為 開發(fā) 增加人體免疫力的 保健食品 苗打下了良好的墓礎(chǔ)，具有 一定的 理論意義和實(shí)踐意義。 關(guān)鍵詞：番茄，胸腺素 1，乳鐵蛋白，轉(zhuǎn)基因 植物 ， 遺傳轉(zhuǎn)化 ，生物反應(yīng)器 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 is an 8 of of in , to 1 in to a in So we 1 of At we LF s us It is s In we 1 a in to 1 in a 1 , by lf an to We in lf of 8 by CR 1 lf of by in of of of in of F .9 g 1 .0 g We 1 in is 1 F by of of to is an 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 1; 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 錄 第一章 緒論 物生物反應(yīng)器研究進(jìn)展 . 1 物生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì) . 2 物 生物反應(yīng)器 存在的問題與展望 . 3 腺素 究進(jìn)展 . 3 述 . 3 腺素 1的結(jié)構(gòu) . 5 腺素 1 的受體 . 5 腺素 1的生物學(xué)活性 . 6 腺素 1的臨床應(yīng)用 . 6 腺素 1的生產(chǎn) . 6 鐵蛋白的研究進(jìn)展 . 7 述 . 7 鐵蛋白的功能 . 7 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)及鐵結(jié)合位點(diǎn) . 8 鐵蛋白的提取純化方法 . 9 鐵蛋白的檢測(cè)方法 . 10 因工程方法生產(chǎn)乳鐵蛋白 . 10 基因番茄研究進(jìn)展 . 10 基因植物的生物安全性 . 12 于轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性的爭(zhēng)論 . 12 基因生物環(huán)境釋放風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基 本原則 . 14 茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子 . 14 8 基因啟動(dòng)子 . 15 4 啟動(dòng)子 . 15 G 啟動(dòng)子 . 15 動(dòng)子 . 15 物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展 . 16 物遺傳轉(zhuǎn)化方法 . 17 物遺傳轉(zhuǎn)化存在的問題與對(duì)策 . 21 研究的目的、意義及研究方案 . 24 研究的目的、意義 . 24 究方案 . 24 第二章 因番茄表達(dá)載體的構(gòu)建 26 料與方法 26 料 26 法 27 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 v 果與分析 33 1基因的設(shè)計(jì)合成及克隆 . 33 實(shí)特異性 動(dòng)子的克隆 . 34 礎(chǔ)質(zhì)粒的酶切圖譜及鑒定 . 35 粒載體的構(gòu)建及其鑒定 . 38 結(jié) 46 第三章 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 將人 因及 47 料與方法 47 料 47 法 49 果與分析 60 茄外植體的轉(zhuǎn)化及再生植株的獲得 60 生植株的 測(cè) 63 生植株的 交鑒定 66 基因植株的 測(cè) 68 源蛋白的 量檢測(cè) 70 源蛋白活性檢測(cè) 72 結(jié) 74 第四章 討論和結(jié)論 75 論 . 75 外源目的基因在番茄中的表達(dá)量 . 75 價(jià)轉(zhuǎn)基因番茄 . 75 動(dòng)子的選用 . 75 碼子的優(yōu)化 . 76 1基因的串聯(lián) . 76 基因植物產(chǎn)品的生物安全性及應(yīng)用前景 . 77 論 . 77 研究的創(chuàng)新點(diǎn) . 78 參考文獻(xiàn) . 79 附錄 . 91 致謝 . 92 作者簡(jiǎn)歷 . 93 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士 學(xué)位論文 縮略詞表 略詞表 腺素 1 鐵蛋白 35s P 5S 椰菜病毒 35S 啟動(dòng)子 芐青霉素抗性 那霉素抗性 福平 硫酸鏈霉素 魚堿合成酶基因終止子 I 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 光值 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 乙二醇 -(4,52,5甲基偶氮唑鹽 牛血清 二烷基磺酸鈉 聯(lián)免疫吸附測(cè)定 苯二胺 落數(shù) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 一 章 緒論 1 第一章 緒 論 近代的生物技術(shù) ， 尤其是 70年代初重組 展非常迅速，已經(jīng)在醫(yī)藥、農(nóng)林、輕工、環(huán)境保護(hù)等方面起到重要的作用。不少人認(rèn)為生物技術(shù)將是未來 10年高新技術(shù)發(fā)展的十大重點(diǎn)之一，更有人認(rèn)為生物技術(shù)是解決 21世紀(jì)不斷膨脹的人口 所帶來的 糧食問題 及醫(yī)療保健問題 的關(guān)鍵技術(shù)。 自從 生物技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室研究走向產(chǎn)業(yè)， 已經(jīng) 經(jīng)歷了 幾次發(fā)展高潮 ： 生物技術(shù)最初應(yīng)用在 醫(yī)藥領(lǐng)域 ，并創(chuàng)造了大量的利潤(rùn) ，被稱為生物技術(shù)的第一次浪潮 ； 在 20世紀(jì) 90年代中期，生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用迅猛發(fā)展，被稱為生物 技術(shù)的第二次浪潮。隨著時(shí)間的推移，生物技術(shù)在環(huán)境、能源、材料、信息等領(lǐng)域的運(yùn)用和結(jié)合將不斷擴(kuò)大和加強(qiáng)，還會(huì)出現(xiàn)一個(gè)又一個(gè)新的浪潮。 到目前為止，世界生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的最大板塊仍然是醫(yī)藥生物技術(shù) 產(chǎn)業(yè) （ 占 70%以上） 。 我國(guó)人口眾多，城市化進(jìn)程迅速，正在逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)， 因此開發(fā)廉價(jià)、高效的疾病治療及加強(qiáng)自身免疫能力的醫(yī)藥產(chǎn)品 顯得愈來愈重要。 植物生物反應(yīng)器技術(shù)就是滿足了這種社會(huì)需要而迅速發(fā)展起來的新型生物技術(shù)。植物生物反應(yīng)器可以大規(guī)模、低成本的生產(chǎn)外源蛋白，而且像馬鈴薯、番茄、香蕉、胡蘿卜等植物的可食部位可以直接食 用，省去了外源蛋白的分離純化過程，有廣闊的應(yīng)用前景。本研究將利用番茄作為生物反應(yīng)器，表達(dá)對(duì)人體免疫發(fā)揮重要作用的胸腺素和乳鐵蛋白，從而為開發(fā)新型保健食品奠定基礎(chǔ)，以下綜述將圍繞相關(guān)研究領(lǐng)域展開。 物生物反應(yīng)器研究進(jìn)展 植物 生物反應(yīng)器 （ 技術(shù)是上世紀(jì) 90年代初才出現(xiàn)的一種利用植物個(gè)體作為生物工廠來大規(guī)模生產(chǎn)可供人類疾病治療和保健使用的藥用蛋白的生物技術(shù) 。由于它高效、廉價(jià)的特點(diǎn)，現(xiàn)在已成為轉(zhuǎn)基因植物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前利用植物生物反應(yīng)器已經(jīng)表達(dá)出多種外源蛋白，如霍亂毒素（ 苗 （ 1998） , 結(jié)核病疫苗（李忠明， 2001；楊國(guó)峰等， 2001），痢疾疫苗 (李軼女等， 2002)， 乙型肝炎疫苗 ( ,1992； ,1999； 995)， 苗（ ,1996； ,2000），口蹄疫病毒 (苗 ( ,1998； ,1999)，狂犬病毒 (苗（ 1995； 等， 1998）等細(xì)菌病和病毒病疫苗 ，現(xiàn)在人們還在研制避孕疫苗（ ， 1995），糖尿病疫苗（ 004）等。 20世紀(jì) 90年代后 ,為加大我國(guó)植物生物反應(yīng)器研究力度 ,國(guó)家 863計(jì)劃已經(jīng)把“植物生物反應(yīng)器”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。 越來越多的 科學(xué)家和企業(yè)家 堅(jiān)信 ，生物反應(yīng)器將在 21世紀(jì)末 成為 低投入、高產(chǎn)出的巨大產(chǎn)業(yè)，是生物技術(shù)中充滿活力和前景最為燦爛的高技術(shù)領(lǐng)域之一。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 一 章 緒論 2 物生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì) 相對(duì)于微生物發(fā)酵系統(tǒng)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器而言，利用植物生產(chǎn)重組蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)： 準(zhǔn)確翻譯、加工重組蛋白質(zhì) 植物是高等生物 ，它能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯及糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，使蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)更趨于自然狀態(tài)，表達(dá)產(chǎn)物具有與動(dòng)物抗原相似的免疫原性和生物活性。它不僅能夠表達(dá)和組裝低分子量 (小于 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單鏈肽或肽片段，如抗 2003），還能表達(dá)和組裝大分子量 (大于 80結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多聚體蛋白質(zhì)（ 2002）。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)完整結(jié)構(gòu)的重組抗體分子的表達(dá)和組裝（ 1999），如 功能的分泌型免疫球蛋白，這充分說明了植物細(xì)胞對(duì)外源蛋白的加工能力。相比之下，細(xì)菌等微生物對(duì)外源蛋白的表達(dá)和組裝能力較低。即使用表達(dá)能力較強(qiáng)的大腸桿菌，欲表達(dá)雙鏈結(jié)構(gòu)的重組抗體分子，也十分困難，目前尚未有重組多聚體蛋白質(zhì)用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)的報(bào)道。 高效、廉價(jià)地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 生產(chǎn)口服疫苗的植物表達(dá)系統(tǒng)與傳統(tǒng)作物種植并無差異，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品系大規(guī)模種植就可以生產(chǎn)大量的口服疫苗，它不需要技術(shù)、設(shè)備和種植條件上的巨大投資 ； 農(nóng)作物可以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)，還易于貯存和運(yùn)輸，而且植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經(jīng)形 成產(chǎn)業(yè)化。相比之下，原核生物反應(yīng)器與動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)時(shí)需要昂貴的設(shè)備、大量的人力物力，表 1一方面轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)展成一個(gè)種群，與得到遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物相比，需要花費(fèi)更多的時(shí)間。 表 1同表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)生物藥品的費(fèi)用比較 of to a s ) ) in of ) in ) WP of 625/250000 500615/25自： 食用安全 近年來，口蹄疫、瘋牛病、霍亂、禽流感等畜禽傳染病在一些國(guó)家的再度流行，使人們認(rèn)識(shí)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 一 章 緒論 3 到利用植物生產(chǎn)口服疫苗也許是一種更為安全可靠的方法。植物不是肝炎、艾滋病病毒等許多人類和動(dòng)物致病性病原體的天然宿主，這就避免了通過疫苗傳播病原。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的口服疫苗還可以避免落后地區(qū)注射疫苗時(shí)因注射器消毒不徹底而產(chǎn)生的交叉感染，為疾病的治療和預(yù)防提供了一個(gè)更為安全方便的模式，可以在醫(yī)療設(shè) 施不完備以及醫(yī)護(hù)人員缺乏的發(fā)展中國(guó)家安全應(yīng)用。 物生物反應(yīng)器存在的問題與展望 利用植物生物反應(yīng)器，人們已經(jīng)成功的表達(dá)了多種外源蛋白，并且得到了一些蛋白免疫活性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些研究成果令人歡欣鼓舞。但是，用植物生產(chǎn)口服疫苗目前還處于研究階段，對(duì)于應(yīng)用還有一些需要繼續(xù)研究的課題。表達(dá)量低。在現(xiàn)有的研究中，外源基因所表達(dá)的重組蛋白大約只占植物中可溶性蛋白的 (1995)，即使以高表達(dá)量者為標(biāo)準(zhǔn)，此表達(dá)量作為疫苗仍然很低。這是植物表達(dá)系統(tǒng)普遍存在的問題，解決這一問題對(duì)于 植物口服疫苗的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。免疫耐受性 （ 。是 指免疫活性細(xì)胞接觸抗原性物質(zhì)時(shí)所表現(xiàn)的一種異性的無應(yīng)答狀態(tài)（ a of ，口服疫苗也有可能導(dǎo)致人和動(dòng)物產(chǎn)生口服耐性，從而不再對(duì)疫苗抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，疫苗失去了作用。因此必須系統(tǒng)研究口服疫苗的有效劑量和服用時(shí)間表，從而最大限度發(fā)揮口服疫苗的作用?？诜呙邕€面臨著在消化道被降解，不能發(fā)揮作用的問題。 雖然植物表達(dá)系統(tǒng)還存在一些有待改進(jìn)之處，但是它安 全、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)還是會(huì)吸引越來越多的研究者與開發(fā)商的目光，在未來的疫苗市場(chǎng)上有著廣闊的應(yīng)用前景。 腺素 究進(jìn)展 述 胸腺 (機(jī)體的中樞免疫器官，是 與 節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。 1966年 之為胸腺素，又稱胸腺素組分 3（ 在 972年分離出了分子量為 于 1975年又進(jìn)一步提 純得到了供臨床試用的胸腺素組分 5 ( 一種有效的免疫增強(qiáng)劑，它的純化流程如下：胸腺組織 10000 800C( 一丙酮沉淀 ( 25酸胺沉淀 ( 7)三組，每組中的成分按分離的 先后順序命名為 1 、 2， 1、 2等。從 和 4活性最強(qiáng)，其中 10 1000倍。表 1 表 1種胸腺素成分的性質(zhì)及功能 or of (of in in in a of 12 8 to a1 in 8 .2,IF,dT 5 8 to to a1 in 4 3 W 4396, dT in in in in dT in of H 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 一 章 緒論 5 對(duì)于 來源問題，目前還存在著一些分歧。大部分人認(rèn)為它并非是一個(gè)天然肽，而是前體物胸腺素 端的蛋白裂解產(chǎn)物 (. ， 1987)，由 等， 1993)，人的 10個(gè)氨基酸殘基，其 8 個(gè)氨基酸殘基是 35個(gè)則為 的細(xì)胞中都有高水平的表達(dá)，其表達(dá)水平隨細(xì)胞增殖狀態(tài)的改變而變化，對(duì)細(xì)胞增殖起著重要作用 (997)。 腺素 1 的結(jié)構(gòu) 70年代末期由 過胰蛋白酶解、糜蛋白酶解、 一級(jí)結(jié)構(gòu)已被確定 (1983)(圖 1 一種由 28 個(gè)氨基酸殘基組成的酸性多肽，富含酸性氨基酸，在 80熱穩(wěn)定 (2003)。 論分子量為 二硫鍵與糖基化修飾 ,惟一的修飾就是 1999）。人和牛的 有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu) (1982)。 1腺素 的一級(jí)結(jié)構(gòu) of 對(duì)于 級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道甚少。