密級(jí)： 論文編號(hào)： 碩士 學(xué)位論文 串聯(lián) 抑制素 基因免疫對(duì)小鼠生殖激素 的影響 I 摘 要 豬的抑制素 與牛、羊等家畜的抑制素具有較高的同源性，同時(shí)也與體內(nèi)的多種其它蛋白質(zhì)具有較高的同源性。用抑制素亞基全序列構(gòu)建基因疫苗，產(chǎn)生的抗體可能會(huì)與體內(nèi)其它同源蛋白發(fā)生 免疫 交叉反應(yīng)。 (1 32)和 (100 120)區(qū) 域是抑制素的兩個(gè)抗原決定簇。 經(jīng)綜合分析，抑制素 (1 32)既具有抑制素的免疫原性，又與 體內(nèi)其它蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性，它的編碼序列是構(gòu)建抑制素基因疫苗的理想克隆區(qū)域。用編碼抑制素 (1 32)的基因與 核表達(dá)質(zhì)粒重組構(gòu)建抑制素基因疫苗 組質(zhì)粒在 用來(lái)免疫小鼠 。 為探討抑制素基因免疫對(duì)小鼠生殖 激素 的 影響 ，試驗(yàn)用 0g 、 抑制素 重組 質(zhì)粒 (疫小 鼠 ，隔 15d 以相同劑量加強(qiáng)免疫一次 。通過(guò) 酶聯(lián)免疫法 對(duì) 23 種激素 的 水平 進(jìn)行 檢測(cè) ，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)： 初次免疫后雌鼠血漿 度略有升高，經(jīng)過(guò) 加強(qiáng)免疫后顯著升高（ p ， 但再次加強(qiáng)免疫后 度沒(méi)有顯著的差異（ p 度 在 加強(qiáng)免疫與第一次免疫后變化差異顯著（ p p 兩次加強(qiáng)免疫濃度升高均有顯著差異（ p 注射 大于 ，血漿中 度對(duì)注射空載體差異顯著（ p 注射 于注射空載體差異不顯著（ p 注射 ， 血漿中 度對(duì)注射空載體差異顯著（ p 注射 注射空 載體差異不顯著（ p 注射量為 漿中 度對(duì)對(duì)照組差異顯著（ p 注射量 注射對(duì)照組差異不顯著（ p 以上 結(jié)果表明， 抑制素基因免疫 小 鼠可 以 提高血漿 加加強(qiáng)免疫的次數(shù)血漿中生殖激素的水平得到顯著提高。 抑制素基因免疫 小 鼠可 能 促進(jìn) 小 鼠 卵泡 的發(fā)育。 為使抑制素基因疫苗產(chǎn)生更好的效果，應(yīng)在后續(xù)試驗(yàn)中加強(qiáng)免疫次數(shù)和免疫方法等的研究。 關(guān)鍵詞 ： 串聯(lián)，抑制素，基因免疫， 生殖激素 of in in R so it is 1 32) 1 32) of So 1 32) is an 1 32) to . no in to g ， in 5d of 5d 20 . of is a in SH on 5 of of H up of no p 2 up of p It up on 5d of 2 up of no p In of of of of E2 H, up of on In to be as 錄 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 1 制素常規(guī)免疫 1 制素常規(guī)免疫對(duì) 動(dòng)物繁殖的影響 1 制素常規(guī)免疫存在的問(wèn)題 3 制素基因免疫的優(yōu)點(diǎn) 3 原性強(qiáng) 4 疫應(yīng)答較持久，保護(hù)時(shí)間長(zhǎng) 4 備 簡(jiǎn)便，省時(shí)省力 4 因疫苗改造方便 5 制素基因疫苗的構(gòu)建 5 制素的分子特性 5 制素重組表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 5 制素基因疫苗的構(gòu)建方法 6 制素基因疫苗的接種方法 7 制素基因疫苗免疫的效果 8 響抑制素基因免疫效果的因素 8 疫原 8 疫佐劑 9 疫劑量、免疫間隔及免疫次數(shù) 9 制素基因免疫的安全性 10 癌性 10 畸和毒副作用 11 受性 11 致宿主組織的病理?yè)p傷 11 制素免疫對(duì)動(dòng)物繁殖力的不利影響 11 究的意義 12 第二章 串聯(lián)抑制素的基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 13 料與儀器 13 要工具酶及生化試劑 13 要儀器 13 制素 32)及引物合成 14 法與步驟 14 隆單倍體 32) 14 隆單倍體 32) 17 聯(lián) 32)與 32) 17 聯(lián) 32)與 19 聯(lián)抑制素 (1 32)基因與 組質(zhì)粒的構(gòu)建 21 析與討論 23 第三章 串聯(lián)抑制素基因免疫對(duì)小鼠生殖激素 的影響 25 料與儀器 25 要試劑 25 要儀器 25 驗(yàn)動(dòng)物 25 法與步驟 25 粒的大量培養(yǎng)與純化 25 素檢測(cè) 26 果計(jì)算 29 果與討論 29 疫時(shí)間的影響 29 疫劑量的影響 30 第四章 全文結(jié)論 31 聯(lián)抑制素 32)的基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 31 聯(lián)抑制素基因免疫對(duì)小鼠生殖激素的影響 31 參考文獻(xiàn) 32 致 謝 41 作者簡(jiǎn)歷 42 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐青霉素 產(chǎn)生氨芐抗性的 基對(duì) 補(bǔ) 補(bǔ)決定區(qū) 細(xì)胞病毒 胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 氧核糖三磷酸 1777化乙錠 二胺四乙酸 聯(lián)免疫吸附測(cè)定 卵泡激素 43 丙基硫代 B 培養(yǎng)基 要組織相容性復(fù)合體 黃體素 5050光度 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 糖核酸酶 酸電泳緩沖液 瘤壞死因子 酸 （羥甲基）氨基甲烷 L 升 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 1 第一章 緒論： 抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 基因免疫又叫核酸免疫或 疫，是用一定的方法將帶有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到動(dòng)物活體細(xì)胞內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)抗原遞呈激活免疫系統(tǒng)， 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體并引起相應(yīng)免疫應(yīng)答的一項(xiàng)技術(shù)。在有關(guān)基因免疫的論文中，絕大部分是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中關(guān)于傳染病和腫瘤防治的基因疫苗研究，如 人免疫缺陷病毒 )1,2、狂犬病 3,4、 乙肝型肝炎 5等，還有關(guān)于人類計(jì)劃生育方面基因免疫的研究 6,7,8。用基因免疫的方法對(duì)家畜進(jìn)行生殖調(diào)控的研究目前僅見(jiàn)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳與繁殖實(shí)驗(yàn)室有過(guò)報(bào)道。 本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外目 前有關(guān)卵泡抑制素和基因免疫的文獻(xiàn)，擬從抑制素常規(guī)免疫的效果及存在的問(wèn)題 、抑 制素基因疫苗的優(yōu)點(diǎn)、疫苗的構(gòu)建、影響免疫效果的因素及其安全性 5 個(gè)方面綜述抑制素基因免疫技術(shù)的研究進(jìn)展。 制素常規(guī)免疫 抑制素是主要由 睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞 分泌的糖蛋白激素，主要通過(guò)反饋抑制 垂體卵泡激素 ） 的分泌 ,從而影響動(dòng)物的內(nèi)分泌調(diào)控 ,參與優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇 ,調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育 ,參與精子的發(fā)生 ,進(jìn)而影響動(dòng)物的相關(guān)生殖功能，將動(dòng)物的繁殖力控制在種屬特有的水平。 利用抑制素免疫動(dòng)物后 ,內(nèi)源性 抑制素 被抗體中和 ,血液中 有利于 配子生成 ,提高動(dòng)物繁殖率。 抑制素常規(guī)免疫可使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抑制素抗體，減小抑制素對(duì) 抑制作用，從而增加排卵率，提高繁殖力，這對(duì)抑制素免疫技術(shù)的研究與應(yīng)用具有重要的理論指導(dǎo)意義。抑制素常規(guī)免疫的免疫原主要來(lái)自：組織液中提取、生化合成多肽 片段及重組抑制素 9,10。下 面 將從 這 3 個(gè)方面就 抑制素常規(guī)免疫對(duì)動(dòng)物繁殖的影響 、抑制素免疫 存在的問(wèn)題 進(jìn)行 闡述。 制素常規(guī)免疫對(duì)動(dòng)物繁殖的影響 然抑制素免疫對(duì)動(dòng)物繁殖的影響 O1982)首先報(bào)道用天然抑制素粗提物免疫綿羊可以提 高排卵率 11,12。 報(bào)道，用100羊抗卵泡抑制素抗血清處理 母牛 后 48h、 72h、 96h 檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)牛卵巢上直徑分別為 477 10大卵泡大于 10著高于對(duì)照組。 96h 后大卵泡恢復(fù)到原來(lái)的水平，而小的和中等卵泡數(shù)目仍多于對(duì)照組 13,14,15。 在卵泡期進(jìn)行卵泡抑制素被動(dòng)免疫研究發(fā)現(xiàn)，母牛卵巢上大卵泡的數(shù)目顯著增加，但發(fā)情后 5d 沒(méi)有檢測(cè)到黃體，抑制素抗血清組也沒(méi)有檢測(cè)到黃體，其原因是研究樣本少造成的 16,17。在以往的研究中，有限的抑制素抗體成為抑制素 被動(dòng)免中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 2 疫母牛研究的制約因素。 用部分純化的羊卵泡液免疫青年母牛，部分牛排卵數(shù)增加 1 3 個(gè) 18,19,20。 用單克隆抗體親和層析提純的羊卵泡抑制素，使 7 頭免疫牛平均排卵數(shù)達(dá) 21。 楊利國(guó)等用豬精液抑制素主動(dòng)免疫黃牛，處理的 57 頭母牛中有 15 頭牛產(chǎn)雙胎，孿生率達(dá) 22,23,24。對(duì)270 頭母黃牛在產(chǎn)后 13 個(gè)月用豬精液抑制素進(jìn)行主動(dòng)免疫， 34 周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)排雙卵牛的血清抗抑制素水平顯著高于排單卵牛和不排卵牛的水平，且排卵數(shù)與抗抑制素抗體水平呈 正相關(guān) (r=發(fā)育個(gè)數(shù) 32,33,34。 用不同的豬抑制素合成肽免疫美利奴山羊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些長(zhǎng)的抑制素合成肽 (1 32， 1 26， 7 26， 8 30)在第一次加強(qiáng)免疫后排卵率提高 2倍，第二次加強(qiáng)免疫后排卵率提高 3 5 倍，短肽的排卵反應(yīng)較弱 35,36。 D分別用人工合成的人抑制素和豬抑制素 免疫母 羊，結(jié)果在繁殖季節(jié)，免疫豬抑制素提高了排卵率(降低了胚胎質(zhì)量 (81 83。這是國(guó)內(nèi)外首次用基因免疫的方法研究動(dòng)物繁殖力調(diào)控的實(shí)驗(yàn)。 關(guān)于抑制素基因免疫的報(bào)道不多，報(bào)道效果也不理想。抑制素基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體，理論上可以較長(zhǎng)時(shí)間的降低體內(nèi)抑制素水平，其免疫效果應(yīng)與常規(guī)免疫的效果相當(dāng)，甚至更好。 響抑制素基因免疫效果的因素 關(guān)于抑制素基因免疫的文獻(xiàn)不多，有關(guān)影響基因免疫和抑制素免疫的因素都可能影響抑制素基因免疫的效果。下面從免疫原、免疫方法、免疫佐劑、免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫間隔等 幾方面 介紹影響抑制素基因免疫效 果的因素。 疫原 抑制素基因免疫的免疫原是由抗原編碼基因和真核表達(dá)載體組成的重組質(zhì)粒 ， 因此影響免疫原的因素包括編碼抗原蛋白的抑制素基因及表達(dá)載體的類型。 制素基因表達(dá)載體 抑制素蛋白表達(dá)的多少與基因疫苗的免疫效率有密切的關(guān)系，真核表達(dá)載體是抑制素基因疫苗的主體。細(xì)菌質(zhì)粒本身無(wú)免疫原性，目前尚無(wú)抗質(zhì)粒自身免疫反應(yīng)的報(bào)道，這有助于質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。除了細(xì)菌質(zhì)粒 ，細(xì)菌染色體也可改建成基因載體。 84用細(xì)菌染色體構(gòu)建了一個(gè)具有復(fù)制能力、能包裝缺陷病毒基因的人 工染色體 (新型載體，將抗原基因克隆入一個(gè)大腸桿菌 轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能復(fù)制表達(dá)抗原蛋白，產(chǎn)生 應(yīng)，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。與質(zhì)粒 比， 量大，可攜帶復(fù)雜的較大外源基因，因此有可能發(fā)展成為新中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 9 一代有價(jià)值的基因疫苗。 制素抗原的選擇 免疫應(yīng)答的本質(zhì)是抗原分子中不同的抗原表位作用于多種不同的免疫細(xì)胞。但抗原表位多肽分子量小，免疫原性弱，借助于交聯(lián)蛋白載體可增強(qiáng)免疫反應(yīng)。抑制素常規(guī)免疫時(shí)都要與蛋白載體偶聯(lián)或與蛋白基因等重組 (如血藍(lán)蛋白，血清白蛋白等 )以增強(qiáng)抑制素的免疫原性。 O 35將合成的不同豬抑制素 亞基肽與人血清白蛋白偶聯(lián)免疫美利奴羊。 5等將卵清蛋白 片段前 26 肽組成的重組抑制素免疫兔 后抗抑制素抗體滴度達(dá) 1:10000。以免疫球蛋白分子為載體，以抗原表位為基礎(chǔ)的新型免疫分子設(shè)計(jì)結(jié)合基因免疫是疫苗研究的新方法。 86 88用 B 細(xì)胞抗原表位及一個(gè) 原表位分別克隆于 互補(bǔ)決定區(qū) )和 ， 經(jīng)脾直接免疫后可分別誘導(dǎo)特異性抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，且克隆于同一免疫球蛋白分子中的抗原表位相互有協(xié)同作用。將抑制素抗原決定簇基因克隆進(jìn)帶有免疫球蛋白基因的表達(dá)載體中可望增強(qiáng)免疫反應(yīng)。 疫佐劑 用霍亂毒素與基因疫苗共同經(jīng)鼻粘膜免疫，結(jié)果表明粘膜產(chǎn)生的分泌型 因免疫強(qiáng) 89。 行了另一種嘗試，免疫效果較好。將編碼 丙型肝炎病毒 ） 外殼蛋白的前 58 個(gè)氨基酸編碼序列插入到 型肝炎病毒 ） 主要表面抗原的序列中，免疫小鼠后獲得很高的 體滴度，而用完整外殼蛋白序列構(gòu)建的基因疫苗卻不能引發(fā)抗體反應(yīng) 90。這種融合效應(yīng)可能與增加了 淋巴細(xì)胞識(shí)別表位有關(guān)。 近來(lái)，對(duì)核酸分子的免疫效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 激活巨噬細(xì)胞與 自然殺傷細(xì)胞） 細(xì)胞的作用。其中起主要作用的是以 核心的回文序列 (尤其是91,92。這種 腫瘤壞死因子 ） 和 白細(xì)胞介素 ） ，活化胞分泌 干擾素 ） 。這些細(xì)胞因子可以極大地加強(qiáng) 免疫應(yīng)答。人工合成的或細(xì)菌來(lái)源的包含未甲基化 斷也能激活 B 細(xì)胞增殖和分化，產(chǎn)生抗體。在細(xì)胞質(zhì)粒中以 核心的一些免疫激活序列對(duì)于基因疫苗免疫活性的產(chǎn)生是必不可少的 93,94。 由于 劑沒(méi)有免疫原性，不會(huì)引起自身免疫疾病，這克服了傳統(tǒng)佐劑的一個(gè)重要缺點(diǎn)。為了很好地 激活細(xì)胞免疫，設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒時(shí)最好在目的基因的兩側(cè)插入一段以 核心的回文序列。 疫劑量、免疫間隔及免疫次數(shù) 抑制素基因免疫的劑量取決于抑制素疫苗的轉(zhuǎn)染效率和抗原 遞呈 的效率，而它們又受多方面中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 10 因素的影響。如質(zhì)粒的大小，免疫接種途徑和方法，接種局部細(xì)胞攝取 抗原 遞呈 能力等。理想的免疫劑量取決于特定的抗原和免疫方法。 對(duì)大動(dòng)物 肌肉接種的免疫劑量一般為 10 100g ，基因槍的免疫劑量一般為 1g 。 95,96在小鼠體內(nèi)比較了編碼流感病毒核蛋白的核酸疫苗不同接種劑量 (皮內(nèi)注射 )與誘發(fā)抗體關(guān)系。隨著接種劑量的增加，抗體效價(jià)也逐步上升。但是當(dāng)接種劑量過(guò)少 (如 1g )時(shí)，這種趨勢(shì)不十分明顯，而當(dāng)接種劑量為 3g 時(shí)，產(chǎn)生的抗體量產(chǎn)生質(zhì)的飛躍，峰值約為 1g 接種量的 6 倍。李建榮等用傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因 對(duì)母雞 進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)劑量為 200g 與 500g 產(chǎn)生的抗體水平最高，但兩者差異不顯著，對(duì)梅毒的均保護(hù)率為 10g 與 50g 僅誘導(dǎo)很低的中和抗體，幾乎不產(chǎn)生保護(hù)率，因此認(rèn)為免疫劑量還取決于雞體攝取質(zhì)粒 能力 97。張夢(mèng)華等對(duì)漢灘病毒 S 基因免疫的結(jié)果表明 在 50g 至250g 的范圍內(nèi)的免疫反應(yīng)不呈劑量依賴關(guān)系 98,99。 抑制素常規(guī)免疫一般間隔 20 天免疫再進(jìn)行至少一次加強(qiáng)免疫。抑制素基因疫苗是將真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)并使其在胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，理論上只需一次免疫就可使機(jī)體獲得足夠的免疫保護(hù)作用。實(shí)際上加強(qiáng)免疫可有效提高疫苗的保護(hù)作用，尤其對(duì)大動(dòng)物而言，因?yàn)榇髣?dòng)物的結(jié)締組織比較豐富，大大影響了疫苗的轉(zhuǎn)染效率。李建榮等 100 102用對(duì)傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白的基因免疫研究表明，間隔一定時(shí)間加強(qiáng)免疫可刺激雞體免疫記憶誘導(dǎo)二次免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體水平和保 護(hù)率明顯優(yōu)于一次免疫。竇駿等 103以丙型肝炎 苗免疫小鼠一次、二次、三次免疫后的抗體水平分別為 明免疫次數(shù)的增加能增強(qiáng)免疫反應(yīng)。馮志華等 104 106對(duì)丙型肝炎病毒核心基因免疫的研究發(fā)現(xiàn)一次免疫的抗體水平在第 6周達(dá)到高峰，第 8 周開(kāi)始下降，第 10 周消失。間隔兩周免疫的抗體水平明顯高于初次免疫的抗體水平。通常鼠的免疫周期為 2 4 周，免疫 2 3 次，牛的免疫周期為 1 個(gè)月以上。 107 110最早于 1993 年給牛連續(xù) 5 次注射 粒 次劑量為 果誘導(dǎo)了部分保護(hù)。 12用 苗間隔 2 個(gè)月三次免疫產(chǎn)生的抗體不及間隔 3 周二次耳部皮下注射 500g 產(chǎn)生的抗體滴度高。 制素基因免疫的安全性 抑制素基因免疫作為一種新型免疫方法，其應(yīng)用前景不可估量。隨著基因免疫的不斷擴(kuò)展，基因免疫的安全性問(wèn)題也日益受到廣泛的關(guān)注。安全性的主要問(wèn)題包括 ： (1)抑制素基因是否會(huì)導(dǎo)致宿主組織的病理?yè)p傷； (2)是否會(huì)產(chǎn)生致畸和毒性作用； (3)能否產(chǎn)生免疫耐受性 ； (4)質(zhì)粒能否整合到宿主染色體 上且能否遺傳到下一代。 癌性 質(zhì)粒 否可能整合到受體基因組中。因?yàn)橥庠椿虻恼峡赡軐?dǎo)致原癌基因激活或抑癌基因失活，也可能導(dǎo)致某個(gè)功能基因失活。整合有三類：隨機(jī)插入、同源重組和逆轉(zhuǎn)錄病毒插中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 11 入。后兩者在質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)可以避免。因而，基因疫苗最可能以隨機(jī)整合為主。據(jù)估計(jì)，隨機(jī)整合機(jī)率為萬(wàn)分之一。應(yīng)用 交發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入肌肉內(nèi)的質(zhì)粒很快被清除到檢測(cè)不到的程度 ： 用術(shù)跟蹤，質(zhì)粒在肌肉內(nèi)持續(xù)存在一個(gè)月以上。如此微量的質(zhì)粒存留，其整合機(jī)率微乎其微。 畸和毒副作用 抑制素基因 疫苗可能對(duì)宿主產(chǎn)生的致畸作用主要包括對(duì)宿主后代的胚胎毒性、胎兒出生前后的毒性、一般生殖毒性以及繁殖力的影響，抑制素基因免疫是否會(huì)對(duì)宿主自身的繁殖性能產(chǎn)生毒副作用。己進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，抑制素基因免疫的大鼠和小鼠發(fā)情周期正常，產(chǎn)后仔鼠無(wú)畸形，初生重與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 受性 基因疫苗接種后表達(dá)少量蛋白，并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。因而誘導(dǎo)免疫耐受的問(wèn)題令人關(guān)注。在成年動(dòng)物中，目前尚未觀察到由于接種基因疫苗而誘發(fā)的特異性耐受的例子。相反，有人利用轉(zhuǎn) 型肝炎病毒表面抗原） 基因小鼠進(jìn)行 疫發(fā)現(xiàn)，小鼠己經(jīng)建立的對(duì) 特異性耐受狀態(tài)在接種編碼 質(zhì)粒后被破壞，使小鼠產(chǎn)生抗特異性免疫。 致宿主組織的病理?yè)p傷 抑制素基因在宿主體內(nèi)表達(dá)，導(dǎo)致宿主產(chǎn)生抑制素抗體并引起免疫反應(yīng)。至今未從被免疫的宿主體內(nèi)觀察到由于基因免疫導(dǎo)致的宿主組織產(chǎn)生臨床化學(xué)和血液學(xué)上的副作用，也未曾發(fā)現(xiàn)由于基因免疫導(dǎo)致宿主的任何器官損傷和系統(tǒng)的毒副作用。由于在免疫反應(yīng)的過(guò)程中對(duì)宿主體內(nèi)的組織是否沒(méi)有影響以及對(duì)宿主體內(nèi)各組織的作用機(jī)理尚未完全摸清， 基因免疫導(dǎo)致宿主組織產(chǎn)生病變的可能性始終存在。 制素免疫對(duì)動(dòng)物繁殖力的不利影響 雖然很多實(shí)驗(yàn)在免疫后可提高母畜的排卵率，提高雙胎或多胎率，但 113 115人用抑制素 N 端肽 免疫處女羊，得出結(jié)論認(rèn)為 ， 免疫作用降低了綿羊的繁殖力，對(duì)抑制素免疫的作用提出了異議。 人用豬亞單位 N 端合成肽片段免疫處女牛 ， 顯示免疫顯著破壞了牛機(jī)體控制排卵的機(jī)制，但對(duì)繁殖力沒(méi)有損害 116 120。還有其他科學(xué)家對(duì)此作了研究 ， 結(jié)論也有較大差異。如果從長(zhǎng)遠(yuǎn)一點(diǎn)的利益看，一次免疫到底對(duì)以后母畜 繁殖機(jī)能有多大影響，產(chǎn)仔數(shù)的增加是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論：抑制素基因免疫技術(shù)研究進(jìn)展 12 否會(huì)影響初生重、初生仔畜的哺乳、生長(zhǎng)及其發(fā)育，仍是個(gè)問(wèn)題。 究的意義 繁殖力是家畜重要的經(jīng)濟(jì)性狀，用免疫學(xué)方法調(diào)控家畜繁殖力已成為生殖免疫的一個(gè)重要部分。其中，用抑制素主動(dòng)或被動(dòng)免疫的方法改變家畜繁殖力受到畜牧獸醫(yī)界的廣泛重視，并在牛、羊等大中家畜中取得了較為理想的結(jié)果。生殖免疫研究的總目標(biāo)是 通過(guò) 免疫應(yīng)答對(duì)生殖過(guò)程的調(diào)節(jié)，最終達(dá)到動(dòng)物多胎多產(chǎn)的目的。 用免疫調(diào)控的方法提高家畜的繁殖力主要是基于以下的理論基礎(chǔ)。家畜的繁殖力主要由下丘腦一垂體一性腺軸精確調(diào)控。繁殖力 之以能保持在種屬特有的水平，在排卵數(shù)控制的環(huán)節(jié)上，主要是促進(jìn)排卵的激素與相應(yīng)抑制排卵的激素保持在恰當(dāng)?shù)纳硭?。?dāng)用免疫中和的方法使抑制排卵的激素水平降低，打破這種生理平衡，可能使家畜的排卵率增加，如果其它條件適合，則可以由此增加家畜的繁殖力。例如，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧 與獸藥 研究所研制出的“雙羔素”可以使 25%左右的綿羊產(chǎn)雙羔。 抑制素由卵巢顆細(xì)胞合成和分泌后，主要通過(guò)反饋抑制垂體促卵泡素 ( 的合成和分泌，同時(shí)抑制素在卵巢局部可能 存在旁分泌或自分泌作用，調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，最終影響家畜的排卵率和 產(chǎn)仔數(shù)。抑制素在哺乳動(dòng)物中具有較高的同源性，抗人抑制素抗體能有效地中和牛 、 羊等動(dòng)物內(nèi)源性抑制素，從而去除抑制素對(duì)垂體分泌 抑制作用，間接地提高內(nèi)源性 平，促進(jìn)多個(gè)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育成熟。用純化的牛卵泡抑制素、合成的抑制素亞基和亞基合成肽片段主動(dòng)免疫牛、綿羊等均可以增加 母 畜的 平和排卵率 (121； 122)。 抑制素常規(guī)免疫雖然能提高家畜的繁殖力，但目前抑制素的來(lái)源面臨困境 ，限制了抑制素免疫技術(shù)的發(fā)展 。 基因免疫的方法是從 1990 年開(kāi)始探索的全新免疫方法，至今僅有 15 年歷史。主要是將目的基因與真核表達(dá)質(zhì)粒重組，目的基因在體內(nèi)表達(dá)后，通過(guò)抗原遞呈激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗體。目前主要是將病原微生物基因與真核表達(dá)載體重組后免疫動(dòng)物，探索用于疾病控制。 抑制素基因免疫是 將抑制素基因與真核表達(dá)載體重組后免疫家畜，使抑制素在體內(nèi)表達(dá) 激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抑制素抗體，中和內(nèi)源性抑制素，提高動(dòng)物的排卵率，最終提高動(dòng)物的產(chǎn)仔率。 用 牛卵泡抑制素 片段 (8 20)、 (153 167)、 (8 30)、 (63 72)、 (107 122)主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫 動(dòng)物，各抗原肽免疫后的結(jié)果不 一 致，只有抑制素 (8 20)和抑制素 (107 122)兩個(gè)片段具有免疫效果（ et 1995123； 楊燦鋒 ， 20