I 密級(jí)： 論文編號(hào)： 碩士 學(xué)位論文 喹烯酮 殘留標(biāo)示物 的 測(cè)方法研究及 半抗原設(shè)計(jì) 與合成 I 要 我國自主研制的喹噁啉類新獸藥 喹烯酮 ， 具有 毒性小 、 活性高的優(yōu)點(diǎn)， 屬高效、安全的飼料添加劑，但 因 作為獸藥使用，仍需考慮其通過食物鏈作用對(duì)人體產(chǎn)生 的 不良影響，故也需建立該化合物在動(dòng)物可食用組織中殘留的快速、靈敏的檢測(cè)方法。本論文通過 抗原和抗體的制備及半抗原的改造，進(jìn)行了在動(dòng)物可食用組織中 喹烯酮 殘留的 速檢測(cè)的方法學(xué)研究。 本論文研究首先以鄰硝基苯胺為起始原料，經(jīng)四步反應(yīng) 獲得了 高 純度的 殘留標(biāo)示物 3啉 。 并利用 其分子結(jié)構(gòu)中已有的羧 基為偶聯(lián)位點(diǎn)，以碳二亞胺法和蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，完成了兩種偶聯(lián)物的制備（ 經(jīng)紫外光譜法鑒定偶聯(lián)成功。以兩種偶聯(lián)物為不同免疫原、采用不同的免疫時(shí)間間隔免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體， 抗體 效價(jià)測(cè)定和特異性鑒定 的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：兩種免疫原均能產(chǎn)生高 效價(jià)的抗體，免疫間隔延長(zhǎng)有利于效價(jià)提高，且以 載體有利于避免針對(duì)蛋白載體的抗體產(chǎn)生。但間接競(jìng)爭(zhēng)性 對(duì)抗體的靈敏度測(cè)定結(jié)果表明 ， 較高，不 能 滿足殘留檢測(cè)的要求。 本論文認(rèn)為 導(dǎo)致 測(cè)靈敏度較低的原因，是 殘留標(biāo)示物 和蛋白偶聯(lián)后的特征結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不能夠?qū)τ坞x 好的識(shí)別，因此，本論文設(shè)計(jì)了能夠最大化保留構(gòu)特征的系列半抗原結(jié)構(gòu)，并對(duì)其合成路線進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，最終以對(duì)甲基鄰硝基苯胺為起始原料，經(jīng)氧化環(huán)化、溴代、水解、 合、還原、水解六步反應(yīng) 制備含羥甲基結(jié)構(gòu)的 生物 73喹噁啉 為 制備 對(duì)游離殘留標(biāo)示物高親和力的抗體 ，高靈敏度的 留檢測(cè) 方法的建立 奠定 基礎(chǔ) 。 關(guān)鍵 詞： 喹烯酮 ， 抗體 ， 半抗原 ， 化學(xué)合成 is a of is as a as an be an to of in be In we a of to a s in In we as it of in by by as by by SA as of of to of to we in by in we as as V 目 錄 第一章 緒論 . 1 藥殘留研究的意義及現(xiàn)狀 . 1 噁啉類藥物物的殘留毒性及殘留檢測(cè)進(jìn)展 . 2 噁啉類藥物的殘留毒性 . 2 噁啉類藥物的殘留檢測(cè)進(jìn)展 . 3 疫分析在殘留檢測(cè)中的應(yīng)用 . 4 分子藥物半抗原設(shè)計(jì)與合成研究進(jìn)展 . 4 抗原的設(shè)計(jì)原則 . 5 接臂的引入 . 5 性基團(tuán)的引入 . 6 用異質(zhì)半抗原 . 7 研究?jī)?nèi)容與目的 . 9 第二章 測(cè)方法的初步研究 . 11 驗(yàn)儀器與材料 . 11 品與試劑 . 11 要儀器 . 11 驗(yàn)動(dòng)物 . 11 驗(yàn)方法 . 12 原制備 . 12 體制備及質(zhì)量評(píng)價(jià) . 14 測(cè)靈敏度的測(cè)定 . 15 驗(yàn)結(jié)果 . 16 原的鑒定 . 16 體制備及質(zhì)量評(píng)價(jià) . 18 測(cè)靈敏度的測(cè)定 . 19 析討論 . 20 原制備 . 20 體制備 . 21 測(cè)靈敏度的測(cè)定 . 21 第三章 半抗原的設(shè)計(jì)與合成 . 23 抗原設(shè)計(jì) . 23 抗原結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) . 23 抗原合成路線選擇 . 24 抗原合成 . 25 驗(yàn)儀器與材料 . 25 驗(yàn)方法 . 26 果與討論 . 28 V 第四章 全文結(jié)論 . 31 參考文獻(xiàn) . 32 附 錄 原始圖譜索引 . 35 附圖一 3喹噁啉 1,4電噴霧電離質(zhì)譜 . 36 附圖二 3喹噁啉 電噴霧電離質(zhì)譜質(zhì)譜 . 37 附圖三 3喹噁啉 電噴霧電離質(zhì)譜質(zhì)譜 . 38 附圖四 3喹噁啉 核磁共振氫譜 . 39 附圖五 5核磁共振氫譜 . 40 附圖六 5核磁共振氫譜 . 41 附圖七 73喹噁啉 1,4紅外圖譜 . 42 附圖八 73喹噁啉 1,4電噴霧電離質(zhì)譜質(zhì)譜 . 43 附圖九 73喹噁啉 1,4核磁共振氫譜 . 44 附圖十 73喹噁啉 紅外圖譜 . 45 附圖十一 73喹噁啉 電噴霧電離質(zhì)譜質(zhì)譜 . 46 附圖十二 73喹噁啉 紅外圖譜 . 47 附圖十三 73喹噁啉 電噴霧電離質(zhì)譜質(zhì)譜 . 48 附圖十四 73喹噁啉 核磁共振氫譜 . 49 致謝 . 50 作者簡(jiǎn)介 . 51 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 藥殘留 研究的意義及 現(xiàn)狀 由于 獸藥（包括藥物添加劑） 在畜牧業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛，藥物在動(dòng)物體內(nèi)的滯留或蓄積而引起食品中藥物殘留問題已相當(dāng)普遍。 獸藥殘留 (指給動(dòng)物使用藥物后蓄積或貯存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的藥物原 型 、代謝產(chǎn)物和藥物雜質(zhì)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的亞治療劑量藥物、 非法使用禁用獸藥及其它化合物、不遵 守休藥期的規(guī)定、違背有關(guān)標(biāo)簽的規(guī)定是導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)的主要原因 （ 張宏偉 ,2004） 。 獸藥殘留在國內(nèi)外已成為一個(gè)影響廣泛且頗具爭(zhēng)議的問題，其與公眾的健康息息相關(guān)。對(duì)殘留的監(jiān)測(cè)與控制已經(jīng)是目前國內(nèi)外獸藥研究、開發(fā)、使用和管理中的重要內(nèi)容。 尤其我國加入 來，長(zhǎng)期制約我國畜禽產(chǎn)品出口的關(guān)稅壁壘已被打破，而所謂“綠色貿(mào)易壁壘”將成為制約我國畜禽產(chǎn)品出口的主要因素，因此加強(qiáng) 對(duì)食品中藥物 殘留的監(jiān)控 對(duì)提高我國的公共衛(wèi)生水平 、食品安全以及 畜禽產(chǎn)品的國際競(jìng)爭(zhēng)力均具有重要意義。 獸藥殘留分析技術(shù)是復(fù)雜混合物中的痕量分析技術(shù) , 其特殊性和復(fù)雜性在于痕量、動(dòng)態(tài)的待測(cè)物存在于復(fù)雜的生物樣品中，分析手段需要與獸藥的理化性質(zhì)、體內(nèi)過程、存在狀態(tài)以及藥理毒理相結(jié)合。 殘留分析既需要精細(xì)的微量操作手段 ， 又需要高靈敏的痕量檢測(cè)技術(shù) ， 分析質(zhì)量控制和分析策略 (如篩選性分析、確證性分析 )也 有特殊要求 （ et 1983） 。 獸藥 的 殘留分析 最初 僅限于化學(xué)分析法、比色法和微生物法 , 化學(xué)分析法和比色法缺乏專一性和敏感性 , 而微生物法雖然普遍適用于抗菌藥物的殘留測(cè)定 , 但不易篩選到特別敏感的菌株 , 方法常受到其它抗菌藥物的影響。薄層色譜 (出現(xiàn)使分析方法有所改進(jìn) , 但仍需要復(fù)雜的樣品前處理 , 且 靈敏度不高。 20 世紀(jì) 60 年代后的氣相色譜 ( 70、 80 年代后的高效液相色譜(及 S、 S 等聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展大大地提高了分析的靈敏度和分辨率 , 尤其通過聯(lián)用技術(shù)可提供待測(cè)殘留組分的結(jié)構(gòu)信息或?qū)ξ粗獨(dú)埩艚M分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，而大大 拓寬了殘留分析范圍 。 雖然 儀器分析方法 具有無與倫比的靈敏度和分辨率， 但其 設(shè)備昂貴 、 對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求 較高、 分析費(fèi)時(shí) 、 復(fù)雜煩瑣的樣品前處理 過程和難以進(jìn)行 同時(shí) 大量樣品的 篩選 的缺點(diǎn) ， 對(duì)藥物殘留的及時(shí)監(jiān)控?zé)o疑是不適的。 而 九十年代免疫檢測(cè)技術(shù) (借其特異性高、簡(jiǎn)單、靈敏、快速的特點(diǎn)而在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域得以飛速發(fā)展， 一系列免疫檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)與應(yīng)用加快了獸藥殘留分析的標(biāo)準(zhǔn)化 （ 蔡勤仁， 2002） 。 美國化學(xué)會(huì) (將免疫分析與氣相色譜、液相色譜同列為殘留 檢測(cè) 的三大支柱技術(shù)。美國環(huán)境保護(hù)署 (美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)司 (美國化學(xué)會(huì)制定了農(nóng)藥殘留免疫檢驗(yàn)商品試劑盒評(píng)定和認(rèn)可的建議準(zhǔn)測(cè)（ et 995; 陳新建 ， 1998） 明確了測(cè)定結(jié)果的法 律效應(yīng)。 現(xiàn)在及將來相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi) ， 色譜法 、 光譜法及其聯(lián)用技術(shù)仍是獸藥殘留分析技術(shù)的主流 ， 并圍繞高分辨 (分離 )和高靈敏兩大精髓發(fā)展 ， 以期能簡(jiǎn)化分析過程 ， 提高分析效能 ， 特別是多殘留分析能力和分析過程自動(dòng)化智能化。 與此同時(shí)，以酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ 代表的免疫分析方法也將會(huì) 憑借其 特異性強(qiáng)、靈敏性高、樣品通量大、檢測(cè)迅速、檢測(cè)費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì) 在獸中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 藥殘留監(jiān)控和快速殘留 篩選過程中發(fā)揮更大的作用。 噁啉類 藥物 物 的殘留毒性 及 殘留檢測(cè)進(jìn)展 噁啉類 藥 物 的殘留毒性 喹噁啉類化合物（ 一類通過 1,4目前我國使用量最大的飼料添加劑之一。主要包括：喹乙醇 （ 卡巴氧 （ 、 乙酰甲喹 （ 、喹 烯酮 （ 等，它們均具有提高飼料效率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和廣譜抗菌的作用?？咕钚允谴偕L(zhǎng)作用的基礎(chǔ) ， 而且它們的抗菌機(jī)理相同 ， 都是 通過 抑制 細(xì)菌 成 （ 曹隨忠 ， 2001） 。其中喹乙醇 和卡巴氧是該類藥物的代表藥物，因具有良好的廣譜抗菌效果和促生長(zhǎng)作用 ，而被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中。喹烯酮 是 我國研制開發(fā)的一類新獸藥 ， 喹烯酮與喹乙醇等相比具有高效、安全、添加量少等優(yōu)點(diǎn) ,并 可明顯提高畜禽繁殖率及幼仔畜禽的存活率。 圖 1噁啉類藥物 結(jié)構(gòu)式 實(shí)際生產(chǎn)中，因 超劑量使用或飼喂時(shí)間過長(zhǎng)等原因 ， 通常會(huì)引起 喹噁啉類 藥物 在動(dòng)物可食用組織中有一定的殘留 ， 有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致殘留量超標(biāo) 。 驗(yàn)、體外誘變哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘變實(shí)驗(yàn)均證明 喹乙醇和卡巴 氧 對(duì)嚙齒類動(dòng)物表現(xiàn)出基因毒性和致癌性 （ et 2002; et 981;1984） ， 使用穿梭質(zhì)粒 /哺乳動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)在喹乙醇誘變分子機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，喹乙醇引起質(zhì)粒靶基因核苷酸序列改變主要表現(xiàn)為點(diǎn)突變和連續(xù)缺失 （郝利華 ， 2006） ，此外還有過喹乙醇引發(fā)飼養(yǎng)場(chǎng)工人發(fā)生過敏和光敏感性皮炎的報(bào)道（ . et 002） 。 喹烯酮具有同樣的防病和促生長(zhǎng)作用，但 毒性 和致癌性 卻 明顯 低 于喹3 C 2O 333 H C O O C 醇乙 酰 甲 喹喹 烯 酮 卡 巴 氧中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 乙醇和 卡巴氧 （ 王玉春 ， 1995； 王玉春 ， 1993； 嚴(yán)相林， 1998） 。 噁啉類 藥 物 的殘留 檢測(cè)進(jìn)展 由于 喹噁啉類藥物 其良好的抗菌促生長(zhǎng)效果， 該 類藥物 在許多國家仍然被作為飼料添加劑而廣泛使用，為防止食品中殘留的藥物通過環(huán)境或食物鏈對(duì)人體健康造成影響，各個(gè)國家和組織對(duì)該類 藥物 休藥期 的時(shí)間、殘留標(biāo)示物的選擇和最高 殘留限量都有嚴(yán)格的規(guī)定。 有研究結(jié)果表明，喹噁啉類具有喹噁啉類 動(dòng)物體內(nèi)易發(fā)生初級(jí)代謝，生成脫氧化合物，進(jìn)而發(fā)生次級(jí)代謝，生成 喹噁啉 巴氧）和 3喹噁啉乙 醇） （ et 990）， 世界衛(wèi)生組織和世界糧農(nóng)組織已經(jīng)確定喹乙醇和卡巴氧的殘留標(biāo)示物分別為 3喹噁啉 和 喹噁啉 990）。喹烯酮毒理學(xué)研究表明該化合物毒性較小， 屬 高效、安全的飼料添加劑，但該藥物 作為獸藥使用，仍需考慮其通過食物鏈作用對(duì)人體產(chǎn)生不良影響，故也需要建立其食用動(dòng)物組織殘留量監(jiān)測(cè)方法并進(jìn)一步確定其殘留限量，喹烯酮具有 同 喹乙醇類似的結(jié)構(gòu)母核，可能在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生類似的代謝反應(yīng)，生成相同的 代謝產(chǎn)物，因此有研究者將 3喹噁啉 為主要檢測(cè)對(duì)象 （黃玲莉， 2005） ，并在 飼喂過喹烯酮的 動(dòng)物組織中檢測(cè)到其存在 ， 尤其在 停藥后，肝臟中仍然能檢測(cè)到 3喹噁啉 存在， 因此， 有研究者認(rèn)為 3喹噁啉 以 對(duì)該藥物的殘留進(jìn)行監(jiān)控。 歐盟委員會(huì)認(rèn)為喹乙醇的休藥期不能確定 , 其對(duì)人體健康存在可能的不良作用 , 于 1999 年 1月 1 日正式禁止喹乙醇用作促生長(zhǎng)添加劑（ 998）。 我國 目前批準(zhǔn)使用的喹噁啉類的藥物有喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮，其中 對(duì)喹乙醇的休藥期規(guī)定為 35天，其殘留限量根據(jù) 農(nóng)業(yè)部 2002年頒布的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量的要求，對(duì)喹乙醇的殘留檢測(cè)以 其代謝產(chǎn)物 3喹噁啉 規(guī)定 在豬肌肉中的 最高殘留限量為4g/肝臟中 的 最高殘留限量為 50g/農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局 ， 2002） 。 目前，針對(duì) 喹噁啉類藥物 殘留 檢測(cè)方法多為 ， 并且研究的熱點(diǎn)主要集中在喹乙醇和卡巴氧這兩種藥物上。 由于喹乙醇 和卡巴氧 的殘留標(biāo)示物的標(biāo)準(zhǔn)品 不易 獲得，我國對(duì)喹乙醇的殘留檢測(cè)曾多為其原型藥物， 1993 年 制定 的 中華人民共和國 出口肉中喹乙醇 和卡巴氧 殘留檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （ 商務(wù)部， 1993） ,標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口肉中喹乙醇 和卡巴氧 殘留量檢驗(yàn)的抽樣、制樣和液相色譜測(cè)定方法。標(biāo)準(zhǔn)適用于出口雞肉、豬肉、羊肉、兔肉中喹乙醇 和卡巴氧 原型藥物 殘留量的檢驗(yàn) ，該方法的 最低檢測(cè)限為 50g/ 20添加濃度下，回收率在 80 間 。使用 S 聯(lián)用方法 對(duì)豬肝臟中喹乙醇的殘留標(biāo)示物 3喹惡啉 最低檢測(cè)限（ 低定量限 （ 篇文獻(xiàn)同時(shí)也報(bào)道了對(duì)同屬喹噁啉類藥物的卡巴氧的殘留檢測(cè)方法，對(duì)卡巴氧的殘留標(biāo)示物 喹噁啉 et 2005） 。 黃玲莉 等 使用 對(duì)喹烯酮在雞和豬的可食用組織中 3喹惡啉 殘留檢測(cè)方法進(jìn)行了建立， 最低檢測(cè)限 為 25g/低定量限為 50g/玲莉，2005） 。 迄今為止，國內(nèi)外尚無使用免疫分析 方法 法對(duì) 喹噁啉 類藥物在動(dòng)物組織中 的 殘留進(jìn)行檢測(cè)的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 報(bào)道，僅 方法對(duì)飼料中喹乙醇 原型藥物 的含量進(jìn)行過檢測(cè)，使用該方法檢測(cè)飼料中喹乙醇的最低檢測(cè)限為 低定量限為 4-8 mg/加濃度 范圍內(nèi)回收率在 91間，并且交叉反應(yīng)率試驗(yàn)表明針對(duì)喹乙醇的多克隆抗體對(duì)結(jié)構(gòu)類似的同類藥物卡巴氧具有 叉反應(yīng)率 （ et 2005） 。 雖然 報(bào)道的方法完全可以滿足飼料 中喹乙醇含量檢測(cè)的要求，但僅從檢測(cè)靈敏度上看，對(duì)于殘留檢測(cè)的要求還有 數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí) 差距 。 因此，對(duì) 喹噁啉 化合物 這一 類 使用量巨大 ，列入歐盟重點(diǎn)監(jiān)控的違禁藥物，有必要建立對(duì)其殘留進(jìn)行快速、靈敏、高通量檢測(cè)的 測(cè)方法。 疫分析在殘留檢測(cè)中的應(yīng)用 免疫分析技術(shù) (以抗原和抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，抗原抗體的初級(jí)結(jié)合反應(yīng)遵守質(zhì)量作用定律，可用 程來描述，所以，也有學(xué)者認(rèn)為免疫分析不屬于生物測(cè)定的范疇，而是使用生物材料作為試劑的理化分析技術(shù)。 于 1959 年創(chuàng)立的放射性免疫分析方法 (公認(rèn)為有機(jī)痕量分析的重大突破，因此獲得了 1977 年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) （陳新建， 1998） 。隨后相繼發(fā)展起來的酶免疫分析法 ( 蔡勤仁 , 2002） 、熒光免疫分析法 ( et 1997） 和化學(xué)發(fā)光免疫分析法 (韓鶴友 ,2005） 等免疫學(xué)分析方法，憑借其高靈敏性、高特異性、樣品通量大、檢測(cè)迅速、成本低廉的特點(diǎn)，在食品中獸藥農(nóng)藥殘留分析、環(huán)境污染物檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 免疫反應(yīng)涉及抗原抗體分子間的立體化學(xué)、電荷、氫鍵和偶極 間的綜合作用，因而具有高度的選擇性，免疫分析法中應(yīng)用最為廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ 將免疫反應(yīng)的高選擇性和酶促反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大作用相結(jié)合，具有 極高的 選擇性和靈敏度，在諸如藥物殘留分析等復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的檢測(cè)發(fā)揮著越來越大的作用?，F(xiàn)在幾乎所有重要的獸藥都已經(jīng)建立或正試圖建立酶聯(lián)免疫法的殘留測(cè)定方法，如 et 2005） 、喹諾酮類 （ et 2001） 、磺胺類 （ 劉智宏 ,1997） 、阿維菌素類 （ 李俊鎖， 1997） 等藥物的 速檢測(cè) 方法 均以研制成功。 分子 藥物 半抗原 設(shè)計(jì)與合成 研究進(jìn)展 抗體作為各種免疫分析的核心試劑，對(duì)免疫分析的靈敏度、特異性等起著至關(guān)重要的作用，因此高親和力抗體的制備是免疫分析方法建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 大多數(shù) 獸藥 、毒素、環(huán)境污染物分子質(zhì)量小于 1000u，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原，目前制備小分子半抗原的抗體的常規(guī)方法為：選擇具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物或原 型 藥物作為待測(cè)物，設(shè)計(jì)合成保留待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)特征并帶有活性基團(tuán)的半抗原，通過共價(jià)鍵使半抗原與大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，經(jīng)動(dòng)物免疫程序制備針對(duì)半抗原的特異性抗體 。 但對(duì)于分子質(zhì)量較小的半抗原，尤其分子質(zhì)量小于 300 u 的半抗原，有時(shí)難以獲得針對(duì)藥物中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 小分子的高親和力抗體，有多篇文獻(xiàn)對(duì)小分子半抗原不利于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的因素進(jìn)行過研究和綜述 （ et 1994; et 1991; et 1994; et 2000; et 1994） ， 曾對(duì)分子質(zhì)量在 111 到 1202u 的半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的親和系數(shù) (過研究，結(jié)果表明分子質(zhì)量在 334 到 374u 的半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體仍能具有較高的親和系數(shù)，但對(duì)于分子質(zhì)量低于 300u 的半抗原，獲得高親和力抗體的可能性將顯著下降，從而導(dǎo)致以競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ 代表的競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析方法靈敏度的下降 （ et 1994） 。 針對(duì)由于抗體對(duì)小分子半抗原親和力較低而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降這一問題， 國內(nèi)外研究工作者 做了 大量的探索和研究， 許多新型檢測(cè)模式和級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)近年來不斷被孕育而生，使免疫分析所能達(dá)到的靈敏度顯著提高 （楊唐斌， 2005） ，但 同時(shí)也對(duì)檢測(cè)條件和所需檢測(cè)設(shè)備提出了更高的要 求。因此，許多研究者的注意力已轉(zhuǎn)移到通過 半抗原設(shè)計(jì)與合成 來切實(shí)提高抗體對(duì)待測(cè)物的親和力上來。如 提出 的 利用“位阻效應(yīng)”的半抗原設(shè)計(jì)理念 頗具指導(dǎo)意義 ， 通過 在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空間位阻，誘導(dǎo)產(chǎn)生的多克隆抗體可以對(duì)一系列同系物中不同大小的分子選擇性的識(shí)別 （ et 1998） 。 下文對(duì)近年來 有關(guān) 半抗原設(shè)計(jì)與合成的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。 抗原的設(shè)計(jì)原則 半抗原設(shè)計(jì)的目的為使半抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并獲得對(duì)待測(cè)物分子具有高親和力的抗體。 認(rèn)為在半抗原的設(shè)計(jì)中須遵循以下原則：（ 1）免疫原中的半抗原應(yīng)在分子結(jié)構(gòu)、立體化學(xué)和電子分布上與待測(cè)物分子盡可能的相似；（ 2）半抗原結(jié)構(gòu)中的連接臂應(yīng)不易于誘導(dǎo)產(chǎn)生 “臂抗體 ”，最好使用一定長(zhǎng)度的碳鏈；（ 3）半抗原分子應(yīng)具有便于與蛋白載體偶聯(lián)的活性基團(tuán)（如 ），且活性基團(tuán)的存在對(duì)待測(cè)物分子的電子分布應(yīng)沒有影響；（ 4）半抗原與蛋白偶聯(lián)后仍應(yīng)保留待測(cè)物分子的基本結(jié)構(gòu) （ et 1998） 。因此，半抗原設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于：盡可能的保留原待測(cè)物特征結(jié)構(gòu)，并在適當(dāng)?shù)奈恢?引入合適的連接臂和與蛋白載體偶聯(lián)活性基團(tuán) （ 周思祥 ， 2005） 。 接臂的引入 為突出待測(cè)物分子的特征結(jié)構(gòu) , 半抗原設(shè)計(jì)時(shí)常在特征結(jié)構(gòu)和載體蛋白之間引入一定長(zhǎng)度的連接分子 ,即連接臂。引入連接臂是半抗原抗體制備時(shí)較為常用的方案，如 在小分子半抗原 33抗體制備時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用較短的連接臂或不使用連接臂時(shí)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體，而具有較長(zhǎng)連接臂的半抗原卻能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體（ et 2000） 。人們對(duì)這種現(xiàn)象的解釋是 ：當(dāng)連接臂較短或沒有連接臂時(shí)，半抗原有可能被載體蛋白的三維結(jié)構(gòu)掩蓋，而當(dāng)連接臂足夠長(zhǎng)時(shí)，有利于小分子半抗原充分暴露于載體蛋白的表面，便于抗原提呈細(xì)胞（ 其的識(shí)別。通常認(rèn)為連接臂的長(zhǎng)度最適在 3 6 個(gè)碳原子之間，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長(zhǎng)又會(huì)因疏水作用而造成烷基鏈的折疊，導(dǎo)致半抗原分子仍然被載體蛋白所掩蓋，也不利于抗原提呈細(xì)胞的識(shí)別 （ et 1989） 。但是有研究結(jié)果對(duì)連接臂有利于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生這一觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑，如 發(fā)現(xiàn)氨基甲酸酯類中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 農(nóng)藥殘殺威（ 半抗原連接臂長(zhǎng)度在 2 5 個(gè)碳原子時(shí)，獲得的抗體效價(jià)沒有顯著性差異 （ et 2001） 。同樣 在有機(jī)磷農(nóng)藥倍硫磷（ 免疫分析檢測(cè)方法建立過程中，發(fā)現(xiàn)使用連接臂長(zhǎng)度在 2 6 個(gè) C 原子時(shí)制備的抗體效價(jià)無顯著性差異，而且具有不同長(zhǎng)度連接臂的免疫原制備的多克隆抗體和具有不同長(zhǎng)度連接臂的包被原兩兩組合建立的間接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)模式之間檢測(cè)靈敏度也沒有顯著差別 （ et 2003） 。然而 發(fā)現(xiàn)制備免疫原和包被原時(shí)使用不同結(jié)構(gòu)的連接臂、采用不同的偶聯(lián)方法 或改變連接臂的引入位置可以大大提高測(cè)的靈敏度 （ et 2003） 。 我國研究工作者也在連接臂的引入方面做了大量探索，沈建忠等在對(duì)馬度霉素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法建立過程中，在制備免疫原時(shí)以半抗原的羧基為活性位點(diǎn)與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，而包被原的制備則使用引入帶有氨基連接臂半抗原與載體蛋白的羧基偶聯(lián)，通過改變半抗原與免疫原和包被原的鍵合方式，使檢測(cè)靈敏度提高 兩 到 三 倍 （ 沈建忠 ，1999） 。因此，對(duì)于一個(gè)待測(cè)物進(jìn)行半抗原設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)對(duì)連接臂的長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)以及引入位置進(jìn)行全面的考察和比較。 性 基團(tuán) 的 引入 活性基團(tuán)的引入有兩種方式：第一種是利用待測(cè)物上已有的活性基團(tuán)（ H、鹵素等），通過雙功能試劑（如 H2)H2)珀酸酐、戊二醛等）引入連接臂和活性基團(tuán)，使之與載體蛋白偶聯(lián)，具體實(shí)施方法許多專著皆有詳盡介紹 （ 楊利國 ，1998；