密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 基因的表達及其功能初步分析 of of in .) of of in .) I 摘要 近 20 年來，隨著設(shè)施蔬菜栽培在我國的迅速發(fā)展，番茄根結(jié)線蟲的發(fā)生區(qū)域不斷擴大（如在遼 寧省沈陽市郊區(qū)露地已發(fā)生北方根結(jié)線蟲?。：θ遮厙乐?，其 產(chǎn)量損失達 30 50，嚴重的 50以上。 由于缺乏番茄高抗 根結(jié) 線蟲的品種，生產(chǎn)上主要采用甲基溴土壤熏蒸或高毒、高殘留化學(xué)殺線劑防治線蟲的危害，對產(chǎn)品和環(huán)境均造成嚴重的污染 ， 根結(jié)線蟲的危害已成為制約我國無公害番茄生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的突出問題， 亟待研究開發(fā)可持續(xù)、環(huán)保型控制技術(shù)。近年來研究表明， 有高效的誘導(dǎo)抗病作用，在抗線蟲方面，已有多篇文章報道了 有誘導(dǎo)農(nóng)作物或蔬菜防御線蟲病效力，但有關(guān) 導(dǎo)植物抗線蟲的作用機理還 不清楚，若能從基因表達調(diào)控的角度研究分析植物應(yīng)答 導(dǎo)的分子機制，則有助于認識 誘導(dǎo)抗病作用，為開發(fā)利用 導(dǎo)植物抗病潛能，創(chuàng)新有害生物綜合治理途徑與技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。 本研究以番茄為材料，利用 一基因轉(zhuǎn)錄譜分析技術(shù)研究番茄根部組織應(yīng)答導(dǎo)后基因轉(zhuǎn)錄譜 。 從顯示出的約 5000 個轉(zhuǎn)錄基因片斷（ ，發(fā)現(xiàn)了 23 個轉(zhuǎn)錄上調(diào)基因片段， 6 個轉(zhuǎn)錄下調(diào)基因片斷。經(jīng)過克隆測序，最終獲得了 12 個 導(dǎo)上調(diào)基 因片斷的序列，其中有 3 個差異明顯的 序列長度一致，序列同源性達 99。用 此序列進行表達分析， 結(jié)果顯示此序列確是 導(dǎo)特異性基因，水處理不能誘導(dǎo)該基因表達，而 大量誘導(dǎo)其表達。對此序列進行 終獲得部分 3列。在此基礎(chǔ)上，利用 公共數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測。 研究結(jié)果表明： 導(dǎo)植物根部抗病機制涉及植物多方面生理生化反應(yīng)，多個功能不同基因參與控制。本研究所得的 10 個基因片斷經(jīng)過生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測 ,相 當(dāng)一部分序列的同源基因是植物體在抗病、抗逆反應(yīng)中的表達標簽序列，根據(jù)功能可將其分為五類。第一類是防御反應(yīng)基因， 3， 4 預(yù)測為病程相關(guān)蛋白基因 族成員，它們具有蛋白水解酶功能，所占比例 20；第二類是轉(zhuǎn)運蛋白基因， ， 、 6、 17， ，負責(zé)細胞內(nèi)外離子、水和小分子物質(zhì)的跨膜運輸，所占比例 30；第三類是信號傳導(dǎo)蛋白， ，綁定蛋白，它結(jié)合游離 是 信號傳導(dǎo)途徑上重要的功能蛋白，所占比例 10；第四類，分子伴侶蛋白 助蛋白 質(zhì)的復(fù)性，所占比例 10；第五類即功能未知基因， 1、 12，所占比例 30。 以 列為基礎(chǔ)，用 法，得到部分 列，長度為 962析顯示此基因可能是 運 因（質(zhì)膜型）， 在茄科類植物中此序列沒有同源序列，可能是首次發(fā)現(xiàn)的茄科植物質(zhì)膜型 運 因。 關(guān)鍵詞： 番茄， 誘導(dǎo)抗病性 of of 0 to an a of in in of so at If on at of of be be to is of to ) ,000 23 By 2 of 9%. of a 3of of by in A of in to to of 0 be as R), 14 of a PR 69. , 3, 6, 17, 4 to of 2O, is to a is an of no to 11, 12. we 962DD is in no M in 錄 摘要 . I . 錄 . 略詞表 . 一章 文獻綜述 . 1 1 導(dǎo)植物抗病作用的研究進展 . 1 植物的誘導(dǎo)抗病作用 . 1 使用方法及在植株體內(nèi)的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝 . 4 導(dǎo)植物抗病的生理、生化作用機制 . 5 構(gòu)與功能的關(guān)系 . 8 用前景及展望 . 8 2 術(shù)及其研究進展 . 9 2.1 術(shù)的基本原理 . 9 主要過程 . 10 2.3 術(shù)的特點評價 . 12 2.4 術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 . 12 第二章 實驗設(shè)計 . 13 1 立題意義 . 13 2 技術(shù)路線 . 14 第三章 材料與方法 . 15 1 供試材料 . 15 物材料 . 15 要生化試劑 . 15 2 實驗設(shè)計與方法 . 15 導(dǎo)處理 . 15 取 . 16 合成 . 16 2.4 . 18 別表達片斷回收、克隆 與測序 . 21 關(guān) 定量 證 . 22 得全長 . 26 物信息學(xué)分析 . 29 第四章 結(jié)果與分析 . 30 1 植物的培育 . 30 V 2 提取 . 30 3 雙鏈 合成、酶切連接和預(yù)擴增結(jié)果 . 30 4 錄圖譜 . 31 5 受 導(dǎo)轉(zhuǎn)錄上調(diào)基因片段 分析 . 33 序列測定 . 33 列同源性分析 . 34 列的表達模式 . 36 6 受 導(dǎo)轉(zhuǎn)錄下調(diào)基因片段的分析 . 37 7 相關(guān)序列的 析 . 37 8 驗克隆基因全長 . 38 增實驗 . 38 列分析 . 39 第五章 討論 . 44 1 術(shù)的利用 . 44 2 序列 導(dǎo)抗病性 . 44 3 對 導(dǎo)植物根部抗病分子機理的探討 . 46 結(jié)論 . 49 展望 . 50 參考文獻 . 51 附錄 . 57 附錄 A: 養(yǎng)基配方 . 57 附錄 B： 列 . 57 致謝 . 60 略詞表 T: 乙烯（ A：茉莉酸（ 光密度值（ 程相關(guān) （ of NA 分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（ A ：水楊酸（ 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 1 導(dǎo)植物抗病作用的研究進展 從經(jīng)暴曬的番茄根系中分離得到的一種次生代謝非蛋白氨基酸。1960年， 抗性（ J P, et 1960），隨后 又觀察到 有高效誘導(dǎo)豌豆抗黑根病（ 的活性，其誘抗效果高于 C, et 1963)；進一步研究還發(fā)現(xiàn) 誘導(dǎo)多種作物產(chǎn)生對多種病害的抗性。近年來利用擬南芥突變體作為試驗材料開展 導(dǎo)植物抗病性的研究，越來越顯示出 為一種高效、廣譜的非蛋白氨基酸植物誘抗劑的潛能，成為人們注視的焦點。本文主要介紹 氨基酸生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)利用提供依據(jù)。 圖 1 它的兩個同分異購體 植物的誘導(dǎo)抗病作用 廣譜誘抗活性 多年研究表明， 有廣譜的誘抗活性，對茄科、葫蘆科、菊科、豆科、十字花科、禾本科、錦葵科、薔薇科等一年生或多年生、單子葉或雙子葉植物均具有很強的誘抗作用，可誘導(dǎo)這些植物抵抗由卵菌、真菌、細菌、病毒和線蟲引起的病害（表 1保護植物的葉部、根部和果實免受病害為害（ , et 2001, et 2002）。 溫室 和田間的應(yīng)用效果證明了 許多作物上的廣譜誘導(dǎo)抗病作用。如以色列連續(xù) 3年對 間控制葡萄霜霉病 (效果進行了檢測，結(jié)果表明用濃度為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 2 制葡萄霜霉病的效果分別達到 60和 92%，與常用殺菌劑甲霜銅(防效相似，顯著優(yōu)于三乙膦酸鋁 (滅菌丹 (苯并噻唑類制劑（ (, et , 2001)； 在比較 楊酸 ( 2,6 (室誘導(dǎo)花生抗葉斑?。?試驗中，發(fā)現(xiàn) 這幾種誘抗劑中唯一一種有效控制葉斑病的化合物 (, et 2001)；另外在田間結(jié)合滴灌每隔 2 周用1mg/理植株 1 次，可有效控制西瓜枯萎病（ 的危害 (., 2002)；還有研究表明， 僅具有持久誘抗能力，而且還能促進植物的營養(yǎng)生長和生殖生長 (, et 2001)。這些結(jié)果都說明了 一種能夠誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生廣譜抗病反應(yīng)的化合物。 植物線蟲的誘抗活性 在一些常見的植物誘抗劑中， 氨基丁酸對線蟲病害的誘抗效果突出。 研究發(fā)現(xiàn)，用氨基丁酸 、 、 三種異構(gòu)體、水楊酸、茉莉酸和茉莉酸甲酯等誘導(dǎo)番茄對爪哇根結(jié)線蟲（ 性，證明 氨基丁酸是唯一高生物活性物質(zhì)， 氨基丁酸、茉莉酸甲酯僅具有較低的生物活性，植物抗病信號傳導(dǎo)信號分子水楊酸和茉莉酸無誘導(dǎo)抗線蟲活性（ Y,999）。隨后， 又研究了 氨基丁酸對小麥線蟲的誘導(dǎo)抗病性，結(jié)果證實 小麥根結(jié)線蟲病和胞囊線蟲病都有明顯誘抗作用。（ 001）。 其他化合物的互作增效作用 多種殺菌劑、植物激活劑 ( , 2001)和促進植物生長的根瘤菌 (6混用具有互作增效的作用。據(jù)報道 氫氧化銅（ 霜脲氰 (三乙膦酸鋁 (烯酰嗎啉 (代森錳鋅 (百菌清 ( 滅菌丹 (甲霜靈 ( 混用能明顯提高番茄抗晚疫病，煙草、葡萄、黃瓜抗霜霉病的能力 (., 2002)；與三唑類殺菌劑混用抗白粉病的能力顯著提高 (., 2002, ., 1998)。如在控制小麥白粉病的試驗中，單獨施用丙環(huán)唑 ( 250g/白粉病的侵染率僅分別降低 25%和 17%，若將兩種 成份混合使用，則侵染率降低達 87%；同樣將 不同比例同甲霜靈、 合后用于防治煙草霜霉?。?在混劑施用濃度小于單劑單獨施用濃度的情況下，防治效果遠遠超出了單劑的防效，高達 90%( ., 2002)。另外 脫乙酰幾丁質(zhì)（ 用對控制馬鈴薯塊莖腐敗病 (增效的作用 ( A, et 1998)；與亞磷酸鉀 (作 則可有效控制番茄和黃瓜根結(jié)線蟲 (為害 , ., 2001, , et 2001)；由此可見， 化合物的協(xié)同增效防病作用具有廣闊的應(yīng)用前景，但互作的機理尚未探明，有待進一步研究。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 3 表 1 導(dǎo)植物抗病性的抗菌譜 植物種類 原 鈴薯 病疫霉 ; 鏈格孢 ; 骨木鏈孢菌 番茄 病疫霉 ; 葡萄孢 ; 病黃單胞桿菌 ; 茄尖鐮孢菌番茄?；?; 執(zhí)安棒桿菌 ; 辣椒 茄刺 盤孢 ; 椒疫霉 黃瓜 巴假霜霉菌 ; 絲殼白粉菌 ; 蘆科刺盤孢 ; 香假單胞桿菌黃瓜角斑病致病變種 ; 哇根結(jié)線蟲 ; 葡萄孢 花椰菜 生霜霉菌 ; 緣假單胞菌 ; 光假單胞菌 ; 萵苣 苣盤梗霉 椰菜 大頭菜苔鏈格孢 ; 生霜霉菌 甜瓜 巴假霜霉菌 ; 鐮孢菌甜瓜專化型 ; 諾單胞菌 西瓜 瓜尖鏈孢菌 擬蘭芥 生霜霉菌 ; 葡萄孢 ; 茄假單胞菌 煙草 草霜霉 ; 生疫霉 ; 草華葉病毒 向日葵 日葵單軸霉 ; 日葵柄銹菌 康乃馨 鐮刀菌 谷類 麥 麥 麥 囊線蟲 ; 谷類胞囊線蟲 玉米 珠鐮孢菌 小米 生指梗霉 豌豆 腐絲囊霉 花生 座尾孢 葡萄 萄生單軸霉 蘋果 交鏈孢 棉花 椒鐮孢霉 ;麗花輪枝孢 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 4 使用方法及在植株體內(nèi)的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝 理時間、方式及有效使用濃度 處理方式多種多樣，常見的有噴霧、灌根和浸種，也可將 劑直接撒入土壤，或采用莖部注射，或?qū)⒙懵兜母?、剪切的莖、葉直接浸于 液中。將葉片漂浮在液中也是一種有效便捷的方 法，可用于研究各種 生物的有效性和各種化合物對 導(dǎo)抗性的可逆程度。 同的處理方式對抗性的持續(xù)期有不同的影響，采用葉面噴霧法處理番茄， 1 次噴霧誘導(dǎo)番茄抗晚疫病的持效期達 12 天 (., 1994)；采用浸種法，誘導(dǎo)玉米抗霜霉病的有效期達 30 天 (, et 2001)。 導(dǎo)獲得的保護效果與使用濃度相關(guān)，低濃度只誘導(dǎo)局部抗性，高濃度可誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。如用高于 1000g/ 導(dǎo)辣椒抗疫病、番茄抗晚疫病，其誘抗效果達 91%97%，處理植株的病斑小且發(fā)展緩慢； 度低于 500g/，番茄植株上下部葉片受到保護，但中部葉片發(fā)病嚴重，在辣椒上使用則誘抗效果更低。在可控的條件下，要獲得高效的誘導(dǎo)抗性（ 90%），所需的 用濃度還取決于寄主、病原物及施用方式 29。通常噴葉處理的濃度（ 2501000g/灌根處理的濃度（ 20100g/高，這可能因為根部吸收能力大于葉部吸收的原因；而浸種處理需要的濃度要求最高，通常達到 1%( , et 2001, ., 1996)。 理時間與其他植物誘抗劑有所不同， 哚 只有在病原物入侵前處理才能使植物獲得抗病能力 (, et 1994, , et 1997)，而接種前或接種后 1到 3天使用均表現(xiàn)出推遲發(fā)病的效果 (., 1994, , et 1999, ., 1994 , , et 2002 )。不過接種病菌后時間太長，使用 抗的效果亦不明顯。如擬南芥在接種寄生霜霉菌 1 或 2 天后用 行處理，其孢子形成受到明顯的抑制，孢子量分別減少了 但在接種后 5 天、 7 天再施用 效力喪失 (., 2002, , et 2000) 。大量研究表明， 導(dǎo)植物獲得有效抗病性的使用時間為接種前或接種后 23 天以內(nèi)。 物組織對 吸收 植株對 吸收取決于處理后間隔的時間、處理的部位、處理環(huán)境及植株成熟度等。 14C 標 記的 理番茄葉片，發(fā)現(xiàn)施用后 1 天僅有 9%的 植株吸收， 4 天后吸收率提高到 13%，但僅占全部用量中的很小一部分；若使噴在葉面上霧滴的揮發(fā)速度減慢，則植物體對 吸收率提高，如將經(jīng) 理的葉盤密封在培養(yǎng)皿中， 723% (, .,1994)。處理部位對 吸收影響也很大，一般葉部吸收率大于根部，幼嫩部位較成熟部位易于吸收，如離體葉片通過葉柄末端吸收 2 個小時后，吸收率達 100%，而根部對 吸收在 2 天內(nèi)僅達 36%( , .,1994)；用葡萄作為實驗材料，觀察到植株基部、中部、頂部葉片對 吸收率分別為 5%、 30%，再次證明了幼嫩部位為最易吸收部位。究其原因，也許與植株體表角質(zhì)層厚薄有關(guān)。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 5 運轉(zhuǎn) 不同的植物體內(nèi)運轉(zhuǎn)的方式不同，既可通過木質(zhì)部輸導(dǎo)，也可同其他氨基酸一樣，借助于韌皮部從葉片轉(zhuǎn)移到莖部，在那里完成更大范圍的向上或向下的傳送，根尖和莖尖是其集中聚集的地方 ( R., 1999)； 可借助于吸收作用從頂部向根部或塊莖運轉(zhuǎn)完 成向下傳送， 14C 同位素示蹤證明了 葉部向根部傳導(dǎo)的結(jié)論，在一定程度上解釋了噴葉和灌根處理均能誘導(dǎo)植株對線蟲產(chǎn)生抗性的原因 (, .,1994)；向上運轉(zhuǎn)則借助于蒸騰作用，當(dāng) 用于根、葉柄末端或注射到莖部后，會隨著蒸騰作用的液流向上移動(, et 1999)。 番茄和馬鈴薯吸收、系統(tǒng)運轉(zhuǎn)方式不同，番茄用 14理葉片后，在 2 天內(nèi)輸送到植物生長最活躍的根尖和芽頂 (, .,1994)，馬鈴薯則可 能通過韌皮部傳送到塊莖中積累，相同的是兩種作物內(nèi)的 不會從嫩葉轉(zhuǎn)移到老葉中 (., 2002)。 葡萄內(nèi)的傳送亦是如此，從中部葉片向上部嫩葉運轉(zhuǎn)，而不是向下部老葉傳遞；但將 于葡萄基部葉片時，則發(fā)現(xiàn) 根部運轉(zhuǎn)更明顯 (, et 1999)。將 入煙草的莖基部，發(fā)現(xiàn) 基部、中部和頂部葉片中呈梯度分布，分別為 1%， 3%和 20%。所有研究都表明， 不同植株體內(nèi)運轉(zhuǎn)存在一定的差異，但對 收程度越高的組織 對病害的抗性越強 (, .,1994)，由此認為其運轉(zhuǎn)與抗性呈正相關(guān) (, et 2001, ., 1994 )。 新陳代謝 在植物體內(nèi)， 乎不會被代謝掉。 研究證明了這點，他們發(fā)現(xiàn)被番茄、煙草和擬南芥吸收的絕大部分 可通過采用常用的氨基酸提取法，用 醇：氯仿：水）提取回收，只有一小部分（ 3%5%）留存于植物組織內(nèi)不能被提取出來 (, et 2000, K, et 1997)。 導(dǎo)植物抗病的生理、生化作用機制 誘導(dǎo)抗病性，又稱獲得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，對后續(xù)侵染產(chǎn)生的抗性。 導(dǎo)植物抗病不是因為其本身對病原物具有毒性，而是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種生理、生化防衛(wèi)反應(yīng)。 理屏障的產(chǎn)生 研究表明， 誘導(dǎo)植株細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生胼胝質(zhì)、形成乳突或?qū)е录毎举|(zhì)化等具有防止侵染和增強抗病性作用的結(jié)構(gòu)。如 在 理的番茄葉片上觀察到胼胝質(zhì) 或木質(zhì)素和胼胝質(zhì)同時發(fā)生，接種晚疫病菌 72h 后，在被誘導(dǎo)的葉片上很難發(fā)現(xiàn)菌絲吸器形成，僅在外皮細胞間觀察到被破壞的菌絲，而在對照葉片上則形成大量的吸器 (., 1994, ., 1994)； 用 導(dǎo)處理辣椒后接種辣椒疫霉病菌（ 在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用 理過的植株，其細胞壁上有乳突的形成及胼胝質(zhì)的沉積，病原菌的吸器被限制在這些又厚又密的乳突中難以擴展，從而導(dǎo)致病原菌入侵受阻 (, et 1994)；同樣在 導(dǎo)擬南芥、花椰菜、葡萄抗霜霉病的研究中，也有類似結(jié)果報道 (國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 6 Y, et 1999)。但也有研究結(jié)果與此不一致，如用 理煙草后接種霜霉菌，雖能誘導(dǎo)對病原物的抗性，但并未發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)和木質(zhì)素的形成 (., 1994)。可見 導(dǎo)產(chǎn)生的生理屏障在寄主 敏反應(yīng)和活性氧物質(zhì)的生成 過敏反應(yīng)是一種快速防衛(wèi)反應(yīng)，其重要特征表現(xiàn)為小范圍內(nèi)細胞迅速壞死，從而對活體營養(yǎng)和死體營養(yǎng)的寄生物產(chǎn)生有效的抑 制作用。 研究 導(dǎo)番茄抗晚疫病的作用方式時，觀察到用 理的葉片出現(xiàn)過敏反應(yīng)現(xiàn)象，并且由于過敏反應(yīng)的發(fā)生，抑制了晚疫病在植株內(nèi)的擴展 (., 1994)，說明 導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)后進入了一種對病原菌的防衛(wèi)狀態(tài)，使病原菌的侵入和擴展受到抑制，從而達到減輕病害的目的；但用 葉或灌根處理煙草 (., 1994 )、擬南芥 (., 2000)、番茄 (.,1994 )和花椰菜 (, et 2002)， 雖均可誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性（ 但發(fā)現(xiàn)只有噴葉處理在葉片上形成微小的過敏性壞死斑，說明過敏反應(yīng)只是 導(dǎo)植物抗病的機制之一，其抗病反應(yīng)是多種機理協(xié)同作用的。 對 導(dǎo)煙草抗 研究發(fā)現(xiàn)， 導(dǎo)細胞壞死現(xiàn)象的同時伴隨著活性氧物質(zhì)（ 如過氧化物、 迅速產(chǎn)生，并發(fā)