分類號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： 1081711 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 植病 生防菌 哈茨木霉 ( 研究 學(xué) 科 門 類：理學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱：生物學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 研 究 方 向：應(yīng)用微生物 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 完 成 時(shí) 間：二 0 一一年四月 s as a on 2011 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位 (畢業(yè) )論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的 地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位 (畢業(yè) )論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位 (畢業(yè) )論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱，學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán) 書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位 (畢業(yè) )論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 目 錄 中文摘要 . 1 . 2 第一章 綜 述 . 1 1 哈茨木霉在植物病害防治中的應(yīng)用 . 1 2 哈茨木霉生防機(jī)理的研究進(jìn)展 . 2 生作用 . 2 爭(zhēng)作用和重寄生作用 . 2 導(dǎo)植物對(duì)病菌的抗性 . 3 3 哈茨木霉的生物學(xué)研究 . 3 養(yǎng)條件 . 3 養(yǎng)條件 . 4 4 哈茨木霉的脂肪酸生態(tài) 學(xué) . 4 5 木霉的綠色熒光蛋白標(biāo)記研究 . 5 色熒光蛋白的研究 . 5 霉的綠色熒光蛋白標(biāo)記和應(yīng)用 . 5 6 在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用 . 6 7 本論文的研究基礎(chǔ)和研究意義 . 7 第二章 哈茨木霉的分離、篩選與鑒定 . 9 引言 . 9 1 材料與方法 . 9 驗(yàn)材料 . 9 驗(yàn)方法 . 9 2 結(jié)果與分析 . 10 壤標(biāo)本中木霉菌的分離 . 10 萎病生防功能木霉菌初步篩選 . 10 霉菌的形態(tài)學(xué)及 定 . 11 3 討論 . 12 第三章 哈茨木霉的生物學(xué)特性 . 13 引言 . 13 1 材料與方法 . 13 驗(yàn)材料 . 13 驗(yàn)方法 . 13 2 結(jié)果與分析 . 15 同營(yíng)養(yǎng)對(duì)哈茨木霉 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 . 15 養(yǎng)時(shí)間對(duì)哈茨木霉 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 . 20 種量對(duì)哈茨木霉 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 . 21 度對(duì)哈茨木霉 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影 響 . 21 始 對(duì)哈茨木霉 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 . 22 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 茨木霉 適抑菌條件研究 . 22 3 討論 . 24 第四章 哈茨木霉的脂肪酸生態(tài)學(xué)特性 . 26 引言 . 26 1 材料與方法 . 26 驗(yàn)材料 . 26 驗(yàn)方法 . 26 2 結(jié)果與分析 . 28 茨木霉脂肪酸特征指紋圖譜構(gòu)建 . 28 養(yǎng)條件對(duì)哈茨木霉菌脂肪酸的影響 . 29 同處理哈茨木霉脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè) . 32 同處理間哈茨木霉脂肪酸生物標(biāo)記的分布特性分析 . 34 同處理脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)比較 . 35 3 討論 . 37 第五章 哈茨木霉對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用 . 38 引言 . 38 1 材料與方法 . 38 驗(yàn)材料 . 38 驗(yàn)方法 . 38 2 結(jié)果與分析 . 39 板對(duì)峙法測(cè)定哈茨木霉 枯萎病病原菌的抑制效果 . 39 菌圈法測(cè)定哈茨木霉 枯萎病病原菌的抑制效果 . 40 微鏡下觀察哈茨木霉 枯萎病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 . 41 3 討論 . 42 第六章 哈茨木霉的 因轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)化子生物學(xué)特性 . 44 引言 . 44 1 材料與方法 . 44 驗(yàn)材料 . 44 驗(yàn)方法 . 45 2 結(jié)果與分析 . 47 茨木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 . 47 茨木霉轉(zhuǎn)化子菌株 野生型菌株 生物學(xué)性質(zhì)的比較 . 49 3. 討論 . 52 第七章 哈茨木霉在不同土壤中的定殖特性 . 54 引言 . 54 1 材料與方法 . 54 驗(yàn)材料 . 54 驗(yàn)方法 . 54 2 結(jié)果與分析 . 54 茨木霉轉(zhuǎn)化子 不同類型土壤中的定殖 . 54 茨木霉轉(zhuǎn)化子 有無(wú)植株的土壤中定殖隨時(shí)間變化情況 . 55 3 討論 . 56 第八章 哈茨木霉對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響 . 58 引言 . 58 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 1 材料與方法 . 58 驗(yàn)材料 . 58 驗(yàn)方法 . 58 2 結(jié)果與分析 . 59 不同土壤中脂肪酸標(biāo)記總量和種類的影響 . 59 不同土壤中的微生物群落的影響 . 60 3 討論 . 67 第九章 結(jié)論與展望 . 69 參考文獻(xiàn) . 70 致 謝 . 76 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 中文摘要 本文從臺(tái)灣地區(qū)不同市縣的 13 份土壤標(biāo)本中分離到一株對(duì) 鐮刀菌 有較強(qiáng)抑制作用的木霉生防菌，經(jīng)鑒定為哈茨木霉， 命名為 本文 研究了不同碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽以及不同培養(yǎng)條件如培養(yǎng)時(shí)間、接 種 量、初始 、溫度等 對(duì) 絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響， 探討了 絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢與其菌體脂肪酸種類及含量的之間的相關(guān)性， 測(cè)定了哈茨木霉菌株四株不同寄主的 鐮刀菌 的抑制作用， 構(gòu)建了哈茨木霉的 因遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功獲得了一個(gè) 因標(biāo)記的哈茨木霉菌株，命名為 究了該菌株在不同的土壤類型中的定殖特性及其對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如下： 最佳碳源為葡萄糖、最適氮源為牛肉浸膏 ， 碳氮比以 3:1 為最好， 最適 無(wú)機(jī)鹽 為 硫酸鎂 。 經(jīng)正交優(yōu)化確定 最適固體培養(yǎng)基組成 合 為 ： 葡萄糖 18 g、 6.6 g、 g、 g、水 1000 最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng) 3 天最利于菌絲生長(zhǎng)， 4 天產(chǎn)孢量最大，接種量以 1%為最好；初始 為 4菌絲生長(zhǎng)好， 為 6，產(chǎn)孢 量 最大； 25 為最適菌絲生長(zhǎng)溫度，最佳產(chǎn)孢溫度為 30 。 不同的營(yíng)養(yǎng)條件能夠引起哈茨木霉脂肪酸種類 和含量的改變，但 四種主要脂肪酸的含量均表現(xiàn)為： 6,9c/18:0 9c 。 不同營(yíng)養(yǎng)條件下的哈茨木霉經(jīng)聚類分析聚成五個(gè)類群，結(jié)果表明不同類群的處理之間平均脂肪酸含量、種類、及主要脂肪酸的含量差異與哈茨木霉的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢情況具有一定的相關(guān)性。 6,9c/18:0 肪酸的含量在菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的過(guò)程中起重要作用。 哈茨木霉菌株 四株枯萎病病原菌 制率均在 80%間。當(dāng)鐮刀菌孢子濃度為 107 個(gè) /，抑菌圈直徑分別為 27.9 代謝液造成了鐮刀菌菌絲發(fā)生扭曲、 變細(xì)、 原生質(zhì) 體 膨大、濃縮、菌絲內(nèi)出現(xiàn)大液泡等畸形。 抑菌 作用 主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和抗生作用實(shí)現(xiàn) 的 。 通過(guò) 導(dǎo)的原生質(zhì)體法 構(gòu)建了哈茨木霉的 化體系 ， 成功地將攜帶潮霉素 B 抗性基因和 記基因的質(zhì)粒 合到哈茨木霉的染色體上，獲得 一株 熒光強(qiáng)度高，遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化 菌株 菌絲生長(zhǎng)的生物量和產(chǎn)孢量與野生型相比略有降低， 抑菌 能力略有降低，但抑菌效果仍顯著。 采用 因標(biāo)記的 茨木霉菌株研究了在不同土壤中的定殖特性，結(jié)果表明， 哈茨木霉菌株 不同類型的土壤中的定殖情況不同，定殖難易程度依次為沙土 營(yíng)養(yǎng)土 黃土 菜園土 。木霉定殖的前 15 天，在有植株的情況下定殖數(shù)量顯著高于無(wú)植株的， 16 天后這種優(yōu)勢(shì)力逐漸降低， 32 天后趨于穩(wěn)定，數(shù)量約為 105 個(gè) /析結(jié)果表明： 夠明顯地抑制土壤中細(xì)菌、真 菌、放線菌 等微生物 的生長(zhǎng)，從而改變土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。 關(guān)鍵詞 ：哈茨木霉、生物學(xué)特性、綠色熒光蛋白、 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 of 3 in to In on of of as pH on . of . to a . in of on as . . :1, in By . 8 g, 6.6 g, g, g, 000 . pH 25 0 . of be in of 18:2 6,9c/18:0 9c . By . to . to of 18:2 6,9c/18:0 an in of of . 0% 0%. 07 of 27.9 mm . a a T. s FP . we FP a to a to of in to of 5 in no in 05 2 in of 1 第一章 綜 述 木霉是一類普遍存在的真菌，常見(jiàn)于土壤中，是土壤微生物的重要群落， 也見(jiàn)于植物殘?bào)w及動(dòng)物糞便上，從植物根圍 (葉圍 (種子、球莖表面經(jīng)常可以分離到 1。木霉被認(rèn)為是最有希望的生物防治因子，在植物病害生物防治中扮演著重要角色，生防潛力也日益受到重視 2。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全世界 25 個(gè)國(guó)家以及美國(guó) 43 個(gè)州的有關(guān)生物防治課題中，其中大約有 34%是關(guān)于木霉的。而木霉屬中應(yīng)用最多的為哈茨木霉 (常用劑型為麥麩制劑 3。目前，已知木霉屬的 9 個(gè)種中，除了哈茨木霉外，另外常見(jiàn)的還有 4 種具有生防潛力，綠木霉 (康