學(xué)校編碼： 10384 分類號(hào) _ 密級(jí) _ 學(xué) 號(hào)： 200426073 廈 門 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 on 導(dǎo)教師姓名： 教授 專 業(yè) 名 稱： 論文提交日期： 論文答辯 日期： 學(xué)位授予日期： 2007年 月 日 答辯委員會(huì)主席： 教授 評(píng) 閱 人： 教授 教授 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 指導(dǎo)教師 廈門大學(xué) 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 2 廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 茲呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考的其他個(gè)人或集體的研究成果，均在文中以明確方式標(biāo)明。本人依法享有和承擔(dān)由此論文而產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。 聲明人（簽名）： 年 月 日 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 3 廈門大學(xué)學(xué)位論文著作權(quán)使用聲明 本人完全了解廈門大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。廈門大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和 電子版，有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏利目的的少量復(fù)制并允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。 本學(xué)位論文屬于 1、保密（ ），在 年解密后適用本授權(quán)書。 2、不保密（ ） （請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)括號(hào)內(nèi)打“”） 作者簽名： 日期： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 4 目 錄 中文摘要 英文摘要 1 前言 物青枯病的發(fā)生與危害 枯病原菌的分類地位 主范圍 害特性 枯雷爾氏菌 多態(tài)性研究 染特性多態(tài)性 主分布多態(tài)性 態(tài)特征多態(tài)性 傳特性多態(tài)性 枯雷爾氏菌的種下分類 理小種 化型 清型 源型 病型 因型 肪酸甲酯 (圖分析方法的研究現(xiàn)狀 理 法 用 圖分析方法在微生物鑒定中的應(yīng)用 圖 分析方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用 論文的研究?jī)?nèi)容、目的及意義 2 材料與方法 驗(yàn)材料 株 養(yǎng)基 品試劑 備儀器 生物學(xué)試驗(yàn)基礎(chǔ)方法 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 5 原菌的分離、純化與鑒定 株平板培養(yǎng) 株液體搖床培養(yǎng) 體血球板計(jì)數(shù) 落計(jì)數(shù) 體保存 驗(yàn)方法 枯雷爾氏菌的分離與形態(tài)觀察 枯雷爾氏菌的分離 本的采集 離方法 枯雷爾氏菌形態(tài)多態(tài)性觀察 枯雷爾氏菌菌落形態(tài)觀察 枯雷爾氏菌單細(xì)胞形態(tài)觀察 枯雷爾氏菌種下分類的研究 理小種測(cè)定 化型測(cè)定 病型測(cè)定 枯雷爾氏菌脂肪酸 的檢測(cè)與 分析 枯雷爾氏菌脂肪酸 的測(cè)定 肪酸的提取 肪酸的檢測(cè) 同培養(yǎng)條件對(duì)青枯雷爾氏菌脂肪酸分布的影響 養(yǎng)基的影響 養(yǎng)溫度的影響 養(yǎng)時(shí)間的影響 的影響 枯雷爾氏菌 脂肪酸 多態(tài)性分析 一寄主分離的青枯雷爾氏菌的脂肪酸分布多態(tài)性 同寄主分離的青枯雷爾氏菌的脂肪酸分布多態(tài)性 枯雷爾氏菌 脂肪酸多態(tài)性的 聚類分析 肪酸 型 與青枯雷爾氏菌種下分 類 的關(guān)系 肪酸 型 與 生理小種 的關(guān)系 肪酸 型與 生化型 的關(guān)系 肪酸 型 與致 病型的關(guān)系 枯雷爾氏菌 脂肪酸型 判別模型的建立 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 6 3 結(jié)果與分析 枯雷爾氏菌形態(tài)特征 落形態(tài)特征 細(xì)胞形態(tài)特征 枯雷爾氏菌種下分類 枯雷爾氏菌 生理小種 的測(cè)定結(jié)果 枯雷爾氏菌 生化型 的測(cè)定結(jié)果 枯雷爾氏菌致病型的測(cè)定結(jié)果 枯雷爾氏菌脂肪酸 的檢測(cè)與 分析 枯雷爾氏菌脂肪酸 模式圖 (圖 )分析 同培養(yǎng)條件對(duì)青枯雷爾氏菌脂肪酸分布的影響 養(yǎng)基的影響 養(yǎng)溫度的影響 養(yǎng)時(shí)間的影響 的影響 枯雷爾氏菌 脂肪酸 多態(tài)性分析 一寄主分離的青枯雷爾氏菌的脂肪酸分布多態(tài)性 同寄主分離的青枯雷爾氏菌的脂肪酸分布多態(tài)性 枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性的 聚類分析 肪酸 型 與青枯雷爾氏菌種下分 類 的關(guān)系 肪酸 型 與 生理小種 的關(guān)系 肪酸 型 與 生化型 的關(guān)系 肪酸 型 與致病型的關(guān)系 枯雷爾氏菌脂肪酸型判別模型的建立 4 結(jié)論與討論 枯雷爾氏菌種下分類 枯雷爾氏菌脂肪酸分布特征 同培養(yǎng)條件對(duì)青枯雷爾氏菌脂肪酸分布的影響 枯雷爾氏菌 脂肪酸 多態(tài)性分析 肪酸 型 與青枯雷爾氏菌種下分 類 的關(guān)系 枯雷爾氏菌脂肪酸型判別模型的建立 論與展望 參考文獻(xiàn) 致謝 附錄 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 7 摘 要 細(xì)菌性青枯病是一種由青枯雷爾氏菌 (起的毀滅性土傳病害， 是最重要的作物病害之一。 在寄主范圍、地理分布、致病特征、流行特征、種下分類 等方面存在較大的差異，具有明顯的多態(tài)性。 本論文研 究 40 個(gè)菌株的生理小種、生化型和致病型； 利用 氣相色譜技術(shù)檢測(cè)菌株細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多態(tài)性；研究青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與青枯雷爾氏菌現(xiàn)有種下分 類 方法之間的關(guān)系 ；并利用統(tǒng)計(jì)分析方法初步探討脂肪酸型判別模型的建立。 研究結(jié)果表明， 青枯雷 爾氏菌在 菌體形態(tài)、 致病性、生理生化等方面都存在 較大 的差異，呈現(xiàn)出明顯的多態(tài)性分布 。 青枯雷爾氏菌生理小種 1 的菌株在致病力上存在著分化，屬于不同的致病型；生化型的劃分與其致病型的劃分不存在相關(guān)性。 在一定范圍內(nèi)，青枯雷爾氏菌生理小種和生化型對(duì)于標(biāo)記菌株特性具有一定的意義 ，但是， 其分析結(jié)果對(duì)致病力分化的分析作用，值得進(jìn)一步探討。 脂肪酸多態(tài)性研究結(jié)果表明， 同一寄主分離的青枯雷爾氏菌和不同寄主分離的青枯雷爾氏菌，其脂肪酸都存在著明顯的多態(tài)性；對(duì) 40 株青枯雷爾氏菌的脂肪酸進(jìn)行聚類分析，可以聚成三類，即 脂肪酸 I 型 、 脂肪酸 和 脂肪酸 ；青枯雷爾氏菌生理小種 1 存在著不同的脂肪酸 型 ，青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與其生化型之間不存在相關(guān)性，但是脂肪酸和致病 型 之間存在一定的相關(guān)性： 脂肪酸 I 型 為無(wú)致病性菌株， 脂肪酸 為過(guò)渡性菌株， 脂肪酸 為強(qiáng)致病性菌株。 青枯雷爾氏菌 脂肪酸型 判別模型 的建立 ： 于一個(gè)未知脂肪酸型的青枯雷爾氏菌菌株，首先測(cè)定脂肪酸譜圖，取出 14:0)、 17:0)、 18:0)，代入方程，計(jì)算 1 2 時(shí)，歸為脂肪酸 I 型，當(dāng) 2 3 時(shí) ,歸為脂肪酸 ，當(dāng) 時(shí) ,歸為脂肪酸 ， 模型的 判別準(zhǔn)確率達(dá) 達(dá)到了實(shí)用水平，說(shuō)明了該建模方法思 路合理。 脂肪酸 已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌 鑒定 中 ，但是 對(duì) 同一種細(xì)菌脂肪酸多態(tài)性的分析尚未見(jiàn)報(bào)道。 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性與致病性之間的相關(guān)性有望成為青枯雷爾氏菌小種鑒 定的新指標(biāo)。 青枯雷爾氏菌的脂肪酸型的研究，為其種下分 類 建模的標(biāo)準(zhǔn)化和計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析方法的建立，提供可靠的基礎(chǔ)。脂肪酸型的模型建立也為其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。 關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌；脂肪酸；多態(tài)性 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 8 on is a of as as . 0 . in by . to to to of to up . It no to . In to . is to . on by of of . of to to I in II to It of no to . to to of to up 4:0( 17:0( 18:0(to as up on of . 枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 9 be by of to be in . of . up to 枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 10 1 前言 物青枯病的發(fā)生與危害 枯病原菌的分類地位 青枯病從發(fā)現(xiàn)至今已有 140 多 年的歷史 ， 美國(guó) 其病原物定名為青枯假單胞桿菌 ( 研究表明 ， 假單胞桿菌(為 5 個(gè) 源群，青枯假單胞桿菌包括在 源群 1。根據(jù) 子雜交，以同源性分析為基礎(chǔ)，建議將其列入 2。通過(guò)對(duì) 16S 因序列測(cè)定 和 聚類分析 等 大量工作，青枯病 原菌 被列入 雷爾氏 屬 ( 與 同一屬 ，名為 青枯雷爾氏菌 (et 3,4。青枯病原菌的中文名稱也經(jīng)歷了變化，起初稱為青枯假單胞桿菌，隨著其分類地位的變化，而后稱為青枯雷爾氏菌 5，本研究中采用的青枯病原菌的中文名為青枯雷爾氏菌。 青枯雷爾氏菌 屬變形菌門 (、 - 變形菌綱(伯克氏菌目 (伯克氏菌科 ( 雷爾氏 屬 ( 主范圍 青枯雷爾氏菌引起的 植物 青枯病， 主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū) 。 青枯雷爾氏菌可危害 44 個(gè)科的 300 多種植物 6， 表現(xiàn)出高度的侵染寄主的多態(tài)性，被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有種子植物和被子植物，有雙子葉植物和單子葉植物等。 危害較重、分布較廣的主要寄主有馬鈴薯、番茄、煙草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、 甘薯 、麻等 7。近年又陸續(xù)有報(bào)道在油橄欖、桑、木麻黃、木薯、番荔枝、澳洲松、桉樹等木本植物，以及蠶豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、蘿卜、茴香、棉花、三葉草、聚合草、草莓等草本植物上也發(fā)生青枯病 ，可以說(shuō)青枯病是危害最大、分布最廣、造成損失最重的植物病害之一 8。 害特性 鄭繼法等 (1997)研究指出，青枯雷爾氏菌侵害寄主 (特別是茄科寄主 )后，寄主植物 (如番茄、辣椒、茄子等 )在發(fā)病時(shí)出現(xiàn)青枯癥狀，即植物的葉子萎蔫下垂，但葉子仍呈綠色。發(fā)病初期，部分葉子發(fā)生萎蔫；發(fā)病中期，大部分葉子在陽(yáng)光下發(fā)生萎蔫，在早晚恢復(fù)正常；發(fā)病后期，萎蔫的葉子無(wú)法恢復(fù)。青枯萎蔫作為青枯雷爾氏菌危害寄主植物的重要致害特征。橫切病株莖部可見(jiàn)到維管束變褐，用手?jǐn)D壓，有白色菌膿從切口處溢出，此法可作為田間快速診斷青枯 病的方法之一 9。 結(jié)合各地生姜、番茄、辣椒、茄子、煙草、花生作物的生長(zhǎng)期，在各作物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)初期，氣溫在 28 以上，晴雨交替的日子，青枯病較為多發(fā)。青枯病對(duì)茄科植物的危害尤為嚴(yán)重。我國(guó)南方各省茄科作物上都有青枯病發(fā)生危害，對(duì)南京地區(qū)茄科作物青枯病調(diào)查結(jié)果表明，一般田塊發(fā)病率為 25%嚴(yán)重田塊可達(dá) 80%10。馬鈴薯青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 11 對(duì)青枯病十分敏感，通常導(dǎo)致產(chǎn)量損失 20%嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá) 75%以上 11。番茄生長(zhǎng)過(guò)程經(jīng)常受到青枯病的危害，特別在番茄結(jié)果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起毀滅性的 危害 12。福建煙草的青枯病 發(fā)病率一般為 10%嚴(yán)重田塊 為 100，以至全田煙草枯死 絕收， 此病已成為福建煙草生產(chǎn)的主要障礙之一 13。此外，在花生、生姜、甘薯等作物上，青枯病發(fā)生亦很嚴(yán)重，易感病作物面積近 044。隨著研究的進(jìn)展，青枯病原菌新寄主不斷發(fā)現(xiàn) 15。全球氣溫變暖等因素，在世界范圍內(nèi)，青枯病發(fā)生危害越來(lái)越嚴(yán)重 16。近年來(lái)，我國(guó)南方桉樹、木麻黃、桑樹等林木青枯病害發(fā)生爆發(fā)，造成林業(yè)生產(chǎn)巨大經(jīng)濟(jì)損失 17。 枯雷爾氏菌多態(tài)性研究 青枯雷爾氏菌是一個(gè)比較 復(fù)雜的細(xì)菌，適應(yīng)性強(qiáng)，寄主范圍很廣 18，青枯雷爾氏菌在寄主范圍、地理分布、致病特性、流行特征、生理小種分化上存在較大的差異 19， 具有明顯的多態(tài)性 。 染特性多態(tài)性 青枯雷爾氏菌可危害 44 個(gè)科的 300 多種植物 6， 被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有種子植物和被子植物，有雙子葉植物和單子葉植物等，表現(xiàn)出高度的侵染寄主的多態(tài)性； 不同植物、不同地點(diǎn)、不同季節(jié)青枯病流行規(guī)律表現(xiàn)出多態(tài)性。對(duì)生 姜青枯病 而言， 始發(fā)病期是 5 月中下旬 ； 7 月中旬至 9 月中旬為主發(fā)病期，此階段土溫 在 28C 左右，土壤高溫，病害易發(fā)生流行 ； 9 月中旬后病勢(shì)下降， 10 月中旬停止，發(fā)病期達(dá) 140d 左右 20。 主分布 多態(tài)性 青枯雷爾氏菌在不同寄主植株體內(nèi)的分布及致病力存在顯著差異，番茄和茄子病株體內(nèi)青枯雷爾氏菌的平均含菌量顯著高于煙草、花生和生姜，青枯雷爾氏菌的致病性大小依次為生姜 番茄 花生 煙草 茄子。青枯雷爾氏菌在不同侵染狀態(tài)植株體內(nèi)的分布及致病力存在顯著差異，以茄子、花生和生姜健康與病株分析為例，僅有花生的健康與發(fā)病植株同時(shí)存在著青枯雷爾氏菌，而茄子和生姜健株無(wú)青枯雷爾氏菌侵染。 青枯 雷爾氏菌在不同發(fā)病階段植株體內(nèi)的分布及致病力差異顯著，在茄子發(fā)病初期，植株下部莖青枯雷爾氏菌的含菌量均顯著高于中上部莖；當(dāng)病程發(fā)展到中期時(shí)，植株體內(nèi)不同部位青枯雷爾氏菌的含菌量均顯著下降，從發(fā)病中期到后期含菌量未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，但是，隨著發(fā)病進(jìn)程，青枯雷爾氏菌弱化指數(shù)下降，致病性則大大增強(qiáng) 14,21。 態(tài)特征多態(tài)性 不同作物上分離的青枯雷爾氏菌形態(tài)存在著多態(tài)性，同一作物的不同時(shí)間、不同地點(diǎn)病株上分離的青枯雷爾氏菌形態(tài)存在著多態(tài)性，同一病株分離的青枯雷爾氏菌形態(tài)也存在著多態(tài)性，同一青枯雷爾氏 菌分離產(chǎn)生的青枯雷爾氏菌形態(tài)同樣存在著多態(tài)性 21。對(duì)青枯雷爾氏菌基本形態(tài)的描述有短桿狀、橢圓形、短橢圓形、長(zhǎng)橢圓形等等，其大小也有近兩三倍的差異 22。青枯雷爾氏菌的大小和形狀與寄主植物、菌株同源性、菌落特青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 12 性、致病性等無(wú)必然的聯(lián)系。對(duì)青枯雷爾氏菌不同條件下形態(tài)多態(tài)性的研究， 提示了青枯雷爾氏菌的不同株系可以同時(shí)存在， 其多態(tài)性 與特定的寄主、時(shí)間、空間 等因素變化有關(guān)，不同的菌系對(duì)外界條件的適應(yīng)性不同，表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)的差異性，形成 了 菌系 的 多態(tài)性。這種多態(tài)性對(duì)于研究致病性變化具有重要意義。 傳特性多態(tài) 性 用 究青枯雷爾氏菌 遺傳物質(zhì)的異質(zhì)性，能很好揭示其多態(tài)性。 1996 年日本學(xué)者從發(fā)生青枯病的茄子和番茄分離了 18 株青枯雷爾氏菌，用 法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同寄主的青枯雷爾氏菌菌株存在著較高的遺傳多態(tài)性，不同地區(qū)的菌株遺傳多態(tài)性差異顯著。不同寄主青枯雷爾氏菌存在著不同的菌系 23。 何自福等從 200 個(gè)隨機(jī)引物中篩選出 17 個(gè)引物用于上述 31 個(gè)菌株 析，共擴(kuò)增出 523 條帶，其中 468 條為多態(tài)性帶，占 聚類分析這 31 個(gè)菌株，又可聚為 4 個(gè)簇群：第 的豐順、金豐等抗病番茄品種上；第 群分離自抗病的番茄新品種新星、年豐和石碣紫紅茄上；第 群主要分離自辣椒和茄子；而第 子和辣椒這 3 種寄主植物。上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，廣東茄科青枯菌的致病力存在明顯的分化現(xiàn)象，其 在較高的遺傳多樣性 24。 枯雷爾氏菌的種下分類 青枯雷爾氏菌的種下分 類 復(fù)雜， 前人主要從生理小種 (25、生化型 (26、血清型 (27、溶源型 (28、 致病型 (29、 基因型 (30等方面對(duì)種下分 類 進(jìn)行研究 。 理小種 生理小種 (據(jù)青枯雷爾氏菌對(duì)不同寄主致病性的表現(xiàn)進(jìn)行劃分。 生理小種分為 3 個(gè)類型，選用茄子與香蕉作為鑒別寄主，采用排除法，即若不侵染香蕉則非生理小種 2，若可侵染茄子則非生理小種331。 國(guó)際上對(duì)青枯雷爾氏菌種下分類研究較多 ，盧同 (1998)綜述了國(guó)際上對(duì)青枯雷爾氏菌 生理小種分類標(biāo)準(zhǔn) ： 能侵染煙草及多種茄科植物，浸潤(rùn)于煙葉上能產(chǎn)生壞死枯斑反應(yīng)，在含 ；能侵染香蕉和海力康 (浸潤(rùn)煙葉產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，在 ；侵染馬鈴薯和番茄，對(duì)煙草弱侵染，在煙葉上形成黃化斑，在 ；能侵染馬鈴薯和茄子、浸潤(rùn)煙葉產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，酪氨酸酶活性中等的定為生理小種 432。 我國(guó)一些植病學(xué)者對(duì)木麻黃、甘薯、馬鈴薯、花生、聚合草、油橄欖、姜、桑等作物青枯雷爾氏菌的生理小種進(jìn)行研究，結(jié)果表明：桑青枯雷爾氏菌屬于生理小種 1 和 4，馬鈴薯青枯雷爾氏菌屬于生理小種 1 和 3，而木麻黃、花生、聚合草、油橄欖、姜、番茄、甘薯等作物的青枯雷爾氏菌均屬于生理小種 117,25,32 化型 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 13 生化型 (據(jù)青枯雷爾氏菌對(duì)生化物質(zhì)的利用進(jìn)行劃分。自 60 年代以來(lái)，國(guó)際上對(duì)不同寄主的青枯雷爾氏菌株的生化型進(jìn)行了研究，澳大利亞的 據(jù)青枯雷爾氏菌株對(duì) 3 種雙糖 (乳糖、麥芽糖、纖維二糖 )和 3 種六碳醇 (甘露醇、甜醇、山梨醇 )的利用情況，把青枯雷爾氏菌區(qū)分為 4 個(gè)生化型 36。張廣民等對(duì)山東省姜瘟病株進(jìn)行了 生化型研究，表明山東省姜瘟病菌存在 個(gè)生化型 37。曾憲銘等分析了 13種作物上的青枯雷爾氏菌的生化型，發(fā)現(xiàn)來(lái)自茄子的青枯雷爾氏菌屬于生化型 同地點(diǎn)采集的青枯雷爾氏菌的生化型存在著差異 26。林美琛等分析了浙江省番茄青枯雷爾氏菌的生化型，表明屬于生化型 占 生化型 I 的占 生化型 占 還有 新型 ，無(wú)法劃入現(xiàn)有的生化型分類標(biāo)準(zhǔn) 38。同一菌株在無(wú)菌水中保存一段時(shí)間后，其生化型會(huì)發(fā)生變異，這表明青枯雷爾氏菌的生化型并不是一個(gè)穩(wěn)定的分 類特征，因此生化型的劃分在分類學(xué)是否有意義值得進(jìn)一步探討。 清型 血清型 (根據(jù)青枯雷爾氏菌對(duì)血清的交互凝集反應(yīng)進(jìn)行劃分。從 80 年代開(kāi)始，我國(guó)研究青枯雷爾氏菌的學(xué)者，采用交互凝集反應(yīng)法和瓊脂雙向擴(kuò)散法，對(duì)桑和木麻黃的血清型進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：桑和木麻黃青枯雷爾氏菌分屬于血清型 I、 以代表不同生化型的 4 個(gè)青枯雷爾氏菌的膜蛋白為免疫原制備了 4 個(gè)相應(yīng)的抗血清，對(duì)我國(guó)植物青枯雷爾氏菌的血清分型進(jìn)行了研究，瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明：來(lái)自我國(guó) 6 個(gè)省的 19 種寄主植物的 212 個(gè)青枯雷爾氏菌株可分為 8 個(gè)血清型，其中血清型 I 為優(yōu) 勢(shì)類群，包括茄科主要植物等 13 種寄主的 147 個(gè)菌株，占全部供試菌株 6939,40。 90 年代福建省農(nóng)科院采用酶聯(lián)免疫吸附法 (應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，用甘薯青枯雷爾氏菌免疫的 小鼠脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，建立了 4 株分泌抗甘薯青枯雷爾氏菌的特異性、有鑒別力的雜交瘤細(xì)胞株： 中雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)范圍為 98 測(cè)定 156 株甘薯青枯雷爾氏菌的血清型，結(jié)果表明：甘薯青枯 雷爾氏菌可分為 7 型 (27。 源型 溶源型 (利用青枯雷爾氏菌對(duì)植物病原菌噬菌體的專化性反應(yīng)進(jìn)行劃分。采用單層平板法，用分離自桑青枯雷爾氏菌的噬菌體 定 19 個(gè)桑青枯雷爾氏菌株，結(jié)果表明：桑青枯雷爾氏菌噬菌體 侵染桑青枯雷爾氏菌株而不侵染番茄、花生、木麻黃、馬鈴薯、辣椒、煙草、姜和甘薯的青枯雷爾氏菌株，用兩個(gè)噬菌體可將 19 個(gè)桑青枯雷爾氏菌株區(qū)分為 6 個(gè)溶源型 28。 由于溶源型分化檢測(cè)方法的測(cè)定過(guò)程復(fù)雜，噬菌體的分離保存難度大，目 前很少應(yīng)用于青枯雷爾氏菌種下分類的研究。 病型 致病型 (根據(jù)青枯雷爾氏菌 對(duì)寄主的致病性差異進(jìn)行劃分。植病工作者根據(jù)青枯雷爾氏菌對(duì)寄主的致病性差異劃分為不同致病型：分為強(qiáng)、弱或強(qiáng)、中、弱或更多的致病類型。 盧同等 (1998)對(duì)作物青枯雷爾氏菌致病型的研究進(jìn)行了綜述 32，認(rèn)青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 14 為對(duì)作物青枯雷爾氏菌致病型的確定，關(guān)鍵在于鑒別品種的選擇。 在研究中，對(duì)鑒別寄主的選擇上，有的學(xué)者是選擇對(duì)青枯雷爾氏菌抗感反應(yīng)敏感的，鑒別性能穩(wěn)定的，室內(nèi)抗感反應(yīng)與大田實(shí)際鑒別結(jié)果相一致的代表性品種 作為鑒別寄主 41。有的學(xué)者是把青枯雷爾氏菌的數(shù)百個(gè)菌株與同一作物的數(shù)百個(gè)品種致病反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，用相關(guān)系數(shù)作為聚類的相似性指標(biāo)，用類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，把經(jīng)過(guò)聚類分析選定的品種作為鑒 別 寄主 42。 黃福新等 1998 年對(duì)廣西 21 個(gè)產(chǎn)煙縣收集的 65 個(gè)菌株進(jìn)行了分析，以煙草、馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、花生、香蕉為鑒別品種，結(jié)果表明強(qiáng)致病性菌株占 不同地方存在差異很大 29。王國(guó)平等 (1996)以煙草 鑒別品種，分析分離自湖南省煙草上的青枯雷爾氏菌菌株，結(jié)果表明強(qiáng)致病性菌株占 采用不同的鑒別品種，對(duì)青枯雷爾氏菌致病力類型劃分有很大的影響 43。 因型 對(duì)基因型 (研究報(bào)道，目前多見(jiàn)于國(guó)外 。 1992)設(shè)計(jì)了兩對(duì)不同的引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (測(cè)青枯雷爾氏菌，引物 青枯雷爾氏菌具有高度特異性；另一對(duì)引物 6S 物 6S 青枯雷爾氏菌是非特異性的 30,44。 1999)采用特異性 引物 7株不同的青枯雷爾氏菌進(jìn)行檢測(cè) 45；所用引物 4個(gè)堿基的片段，在不同的菌株組之間顯示該片段存在許多點(diǎn)突變。 肪酸甲酯 (圖分析方法的研究現(xiàn)狀 脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 是生物體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在細(xì)胞中絕大部分脂肪酸以結(jié)合形式存在，構(gòu)成具有重要生理功能的脂類，它是構(gòu)成生物膜的重要物質(zhì)；是 有 機(jī)體代謝所需燃料的貯存形式；作為細(xì)胞表面物質(zhì)與細(xì)胞識(shí)別、種族特異性和細(xì)胞免疫等密切 相關(guān) 46,47； 具有結(jié)構(gòu)多樣性和高的生物學(xué)特異性，是特別有效的生物標(biāo)記物 48。目前脂肪酸作為一類重要的生物活性物質(zhì)，已經(jīng)引起了 國(guó)內(nèi)外同行的相當(dāng)重視 。 脂肪酸甲酯 (圖分析方法是鑒于脂肪酸可作為生物標(biāo)記物而發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)。 過(guò)分析微生物細(xì)胞膜上磷脂脂肪酸 (組分來(lái)鑒定微生物的種屬、分析微生物多樣性，是一種簡(jiǎn)便、可靠的分析方法。由于用于 以該方法又稱為 理 圖分析方法的原理是基于脂類幾乎是所有生物細(xì)胞膜的重要組成部分 ,不同微生物體內(nèi)往往具有不同的磷脂脂肪酸組成和含量水平，其含量和結(jié)構(gòu)具有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān)，能夠標(biāo)志某一類或某種特定微生物的存在，是一類最常見(jiàn)的生物標(biāo)記物 49,50,51。但是古生菌不能使用 圖進(jìn)行分析 ,因?yàn)樗臉O性脂質(zhì)是以青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 15 醚而不是酯鍵的形式出現(xiàn) 52。此外 ,磷脂不能作為細(xì)胞的貯存物質(zhì) ,一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化 合物就會(huì)馬上消失 ,因此，磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中 存活 的那部分群體 53。 法 利用有機(jī)溶劑將樣品中的脂肪酸浸提出來(lái)，然后進(jìn)行分離純化，將磷脂脂肪酸甲基化轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯，最后利用標(biāo)記脂肪酸，通過(guò)氣相色譜等儀器分析，得到樣品的磷脂脂肪酸組成圖譜，進(jìn)而得到不同脂肪酸的含量和種類，即所謂的 圖 1)。根據(jù)譜圖中脂肪酸甲酯的多樣性，利用相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)的計(jì)算機(jī)分析軟件，便可鑒定出樣品中微生物的種類或得到樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成多樣性、比 例以及微生物生物量等方面的信息。對(duì)于該研究，主要是通過(guò)氣相色譜 (以及氣相色譜 用實(shí)現(xiàn)的，由于脂肪酸本身?yè)]發(fā)性較小，所以要將脂肪酸甲基化轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯以增加脂肪酸的揮發(fā)性，供 圖 1 he 應(yīng)用 圖分析方法在微生物鑒定中的應(yīng)用 脂類是最常見(jiàn)的生物標(biāo)志物， 現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與微生物 種微生物具有其特征性的細(xì)胞脂肪酸指紋圖譜 54，脂類 作為標(biāo)志物用于細(xì)菌鑒定早在 60年代就開(kāi)始了 48。 利用 從細(xì)胞組分水平上鑒定微生物的重要內(nèi)容，開(kāi)辟了一個(gè)微生物檢測(cè)和鑒定的新途徑。不同微生物的脂肪酸在組成和含量上有較大差異，它和微生 物的遺傳變異、耐藥性等有極為密切的關(guān)系。大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌 (G+)中支鏈 脂肪酸豐度很高，而在大多數(shù)革蘭氏陰性菌 (菌中 豐度較高 55。一些細(xì)菌如考克斯氏體屬、土拉弗朗西絲菌屬 56、假單胞菌屬和結(jié)核分枝桿菌屬細(xì)菌 57有其特殊的脂類，可經(jīng)磷脂脂肪酸分析實(shí)現(xiàn)鑒定。短鏈脂肪酸已經(jīng)用于陸源厭氧細(xì)菌的鑒定。 成功的測(cè)定了分枝桿菌屬 4株菌的脂肪酸，確定其主要由 16種脂肪酸組成，并分析了它們之間的差異 58。張文君等報(bào)道海洋細(xì)菌不同屬的脂肪酸甲脂鏈的長(zhǎng)短、雙鍵位置及取代長(zhǎng)度會(huì) 各有差異，這意味著甲脂化可以作為海洋細(xì)菌的分類和鑒定的一種方法 59。張國(guó)賞等用氣相色譜 功地堅(jiān)定了 7個(gè)屬的 12株菌 46。 根據(jù)微生物細(xì)胞脂肪酸的組成，一般可通過(guò)單次實(shí)驗(yàn)比較準(zhǔn)確的將微生物鑒定到脂肪酸提取 脂肪酸純化 他類酯化合物 析 樣品 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 16 種，但是脂肪酸是一種可隨著培養(yǎng)條件變化而發(fā)生改變的細(xì)胞組分，并且氣相色譜、質(zhì)譜等是高精密度的分析儀器，因此，分析過(guò)程的條件選擇和質(zhì)量控制則顯得非常重要，必須對(duì)培養(yǎng)基成分、微生物培養(yǎng)條件、微生物純化、菌齡、色譜條件等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，否則會(huì)嚴(yán)重影響方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。 目前已有一種商業(yè)化 的微生物 生物鑒定系統(tǒng) (美國(guó) ， 落的收集、微生物細(xì)胞皂化釋放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗滌，到最后的鑒定、結(jié)果的判斷都有一套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序，可以避免上述不利條件的影響。 微生物在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)和收獲，經(jīng)過(guò)氫氧化鈉和甲醇試劑皂化和甲基化，通過(guò)正己烷和叔丁基乙醚的萃取，再經(jīng)氫氧化鈉洗滌后，注入 統(tǒng)中分析。系統(tǒng)根據(jù)各脂肪酸組分保留時(shí)間計(jì)算等鏈長(zhǎng) (確定目標(biāo)組分 的存在、采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，再將二者與系統(tǒng)譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值匹配計(jì)算相似度 (從而給出一種或幾種可能的菌種鑒定結(jié)果。一般以最高 菌種名稱作為鑒定結(jié)果，但當(dāng)其報(bào)告的幾個(gè)菌種的 較接近時(shí)，則根據(jù)色譜圖特征及菌落生長(zhǎng)特性進(jìn)行綜合判斷。 生物鑒定系統(tǒng)分析的脂肪酸碳原子數(shù)是 9間，碳原子數(shù)小于 9 或者大于 20 的脂肪酸不被該系統(tǒng)分析。生物鑒定系統(tǒng)具有分析周期短、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外 已有將 用于微生物鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道 60,61。 圖分析方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用 生物多樣性是當(dāng)今國(guó)際上共同關(guān)注的問(wèn)題，它也因此日益成為學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。土壤微生物多樣性一直是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容?？?菌和放線菌是特異的，且大多數(shù)情況下磷脂脂肪酸的某專一類型在某一土壤微生物分類群中占優(yōu)勢(shì) 62,63，至今，已經(jīng)積累了大量關(guān)于微生物脂類的脂肪酸組成的數(shù)據(jù)。一般來(lái)說(shuō)，生物細(xì)胞膜中所含的 ：真菌大多含有多個(gè)不飽和鍵， 及 細(xì)菌往往不含有多個(gè)不飽和鍵的脂肪酸，它含有的主要是鏈長(zhǎng)為奇數(shù)的、帶支鏈的、主鏈上含有環(huán)丙基或羥基的脂肪酸， 、 、 、 、 、 、 10代表放線菌指標(biāo)；G+含有較大比例的帶支鏈的脂肪酸； 除廣泛的用于土壤微生物多樣性的分析外， 還應(yīng)用于 沉積物、地下水，以及與水處理相關(guān)的生物膜和菌膠團(tuán)等微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究中 64,65。. 989年用 人們提供了一種分析沉積物樣品生物多樣性的簡(jiǎn)便方法 66。 67。 . . 析生物膜上捕食 (應(yīng)對(duì)微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)狀況、新陳代謝活動(dòng)的影響 49。 青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究 17 論文的研究?jī)?nèi)容、目的及意義 細(xì)菌性青枯病是危害嚴(yán)重的植物病害，其分布范圍之廣，為害作物種類之多，引起了各國(guó)植病工作者的關(guān)注。 1976 年，在美國(guó)舉行了第一屆國(guó)際細(xì)菌性青枯病學(xué)術(shù)研討會(huì)68； 1985 年，在菲律賓又舉行了亞太地區(qū)細(xì)菌性青枯病學(xué)術(shù)研討會(huì)； 1992 年在中國(guó)臺(tái)灣舉行了亞洲細(xì)菌性青枯病學(xué)術(shù)研討會(huì) 69； 1994 年在中國(guó)武漢召開(kāi)了花生細(xì)菌性枯萎病害研討會(huì) 70； 1997 年，在法國(guó)舉行了第二屆國(guó)際細(xì)菌性青枯病學(xué) 術(shù)研討會(huì)； 2002 年初，在南非又舉行了第三屆國(guó)際細(xì)菌性青枯病學(xué)術(shù)研討會(huì)，各國(guó)植病工作者都極為關(guān)注青枯病的研究，以期能在世界范圍內(nèi)控制青枯病害。 對(duì)于細(xì)菌性青枯病的防治，前人已做了大量的工作，提出了多種防治措施。農(nóng)業(yè)輪作防治方法是防治青枯病的有效措施 71,72，但是由于我國(guó)人多地少，耕地有限，此措施運(yùn)用受到極大的限制，所以輪作措施也只是在局部地區(qū)起到部分防治作用 73。從理論上講，青枯病防治最根本的防治辦法是培育抗病品種 74，國(guó)外已有這方面報(bào)道，采用培育抗病品種的方法，培育了 80 種抗青枯病的品種 70。但是，青枯雷爾氏菌為土傳病害，其腐生性較強(qiáng)，存在著許多不同的生理小種，抗病育種工作就顯得更為復(fù)雜和艱巨 75。在化學(xué)防治上，雖然室內(nèi)的毒力測(cè)定篩選出不少對(duì)青枯雷爾氏菌有較好抑制作用的藥劑76，由于病原細(xì)菌從土地表層到深層均有分布，由根部侵入植株移到導(dǎo)管而引起青枯病77，所以田間防治效果不穩(wěn)定，難以控制病害 78，迄今為止還沒(méi)有一種化學(xué)農(nóng)藥可以有效地控制青枯病的發(fā)生，青枯雷爾氏菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，大量使用化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染和生產(chǎn)成本的上升，所以化防也不是經(jīng)濟(jì)合理的措施 32。 近年來(lái) ，青枯病的生物防治越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外的重視 79。用于青枯病生物防治的因子主要集中于 霉菌、假單胞桿菌、芽孢桿菌、菌根真菌等。目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)青枯雷爾氏菌有拮抗作用的微生物主要有：多粘芽孢桿菌 (熒光假單胞桿菌 (其它的芽孢桿菌方面的拮抗菌，國(guó)內(nèi)外有不少研究用這些拮抗菌防治細(xì)菌性青枯病，取得不同程度成功的例子，如弱毒力青枯雷爾氏菌的利用80、熒光假單胞桿菌 81等。盡管如此，青枯雷爾氏菌的生物防治還不能適應(yīng)生產(chǎn)需 要，青枯病生防菌仍處于研究階段，防治效果不穩(wěn)定，青枯雷爾氏菌的生物防治仍然存在許多困難。而通過(guò)土壤添加劑改造土壤中微生態(tài)環(huán)境，使之向不利于青枯病的轉(zhuǎn)化，能起到防治青枯