密級(jí) : 論文編號(hào) : 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 青海血蜱 達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和“隱藏抗原”基因的篩選、克隆與表達(dá) of s of 海血蜱 達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和“隱藏抗原”基因 的篩選、克隆與表達(dá) 摘 要 青海血蜱 （ 及其傳播的血液原蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。目前對(duì)蜱的防治主要以藥物防治為主。但隨著蜱耐藥性的產(chǎn)生以及環(huán)境污染和藥物殘留等嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題的出現(xiàn)迫使人們尋求防治的新途徑。在眾多控制蜱的方法中，免疫學(xué)防制是前景最誘人的方法。本研究采用兩種不同的免疫途徑制備了羊抗青海血蜱唾液腺蛋白陽(yáng)性血清和羊抗青海血蜱唾液蛋白陽(yáng)性血清。應(yīng)用 法，將上述兩種血清分別與青海血蜱唾液腺蛋白提取物雜交以進(jìn)行蛋白的差異 顯示。結(jié)果表明 羊抗青海血蜱唾液腺蛋白陽(yáng)性血清能識(shí)別青海血蜱唾液腺更多的蛋白帶。這些差異蛋白的分子量分 別為 4931 通過(guò)制備性電泳，將所發(fā)現(xiàn)的差異條帶切取回收并免疫家兔，獲得兔抗青海血蜱差異蛋白陽(yáng)性血清。以 半飽血青海血蜱的唾液腺、馬氏管和卵巢等器官為材料，構(gòu)建青海血蜱的 達(dá)文庫(kù) ,庫(kù)容量約為 2 106 利用兔抗青海血蜱差異蛋白陽(yáng)性血清對(duì)青海血蜱 達(dá)文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選 ,共獲得 5 個(gè)陽(yáng)性克隆 。經(jīng)鑒定這 5 個(gè)基因均為青海血蜱所固有的新發(fā)現(xiàn)基因，它們的大小 依次為 1085726617847 1178在大腸桿菌中分別對(duì) 因進(jìn)行了表達(dá)，利用表達(dá)產(chǎn)物免疫 羊所得陽(yáng)性血清能與青海血蜱天然蛋白發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。這為研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ：青海血蜱 ,兔抗青海血蜱差異蛋白陽(yáng)性血清 ,達(dá)文庫(kù) ,免疫學(xué)篩選 ,誘導(dǎo)表達(dá) he of to is of a of as of as as of by In by By to by of of 931by A a 06 as . of 085726617847bp 178bp to to be by of be a of V 目 錄 第一章 緒論 1 究目的和意義 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 2 能性抗原的選擇 2 商業(yè)化的抗蜱疫苗 6 蜱免疫的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 7 究?jī)?nèi)容和方法 7 第二章 青海血蜱唾液腺及其分泌物中蛋白組分的差異顯示及兔抗青海血蜱差異蛋白陽(yáng)性血清的制備 9 10 料 10 驗(yàn)方法 11 驗(yàn)結(jié)果 20 20 20 20 21 第三章 青海血蜱 達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建 23 料與方法 24 料 24 驗(yàn)方法 25 果 33 33 鏈 測(cè)結(jié)果 34 片段 選擇 34 庫(kù)基礎(chǔ)庫(kù)容量 34 增文庫(kù)庫(kù)容量 35 論 35 第四章 青海血蜱 達(dá)文庫(kù)的免疫學(xué)篩選和陽(yáng)性克隆的克隆與鑒定 39 方法 40 料 40 法 40 果 47 陽(yáng)性克隆的篩選結(jié)果 47 性克隆的鑒定 48 用 48 論 49 第五章 陽(yáng)性克隆的誘導(dǎo)表達(dá)及其免疫原功能的初步分析 52 料與方法 53 料 53 法 53 果 56 組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果 56 組蛋白的免疫活性分析 56 論 56 第六章 結(jié)論 59 參考文獻(xiàn) 60 附錄 66 致謝 76 作者簡(jiǎn)歷 77 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究目的和意義 蜱 (于節(jié)肢動(dòng)物門（ 蛛形綱（ 蜱螨目 (蜱亞目（ 蜱總科（ 該總科又分為三個(gè)科，即硬蜱科（ 軟蜱科 (納蜱科 ( 孔 繁瑤， 1981；汪明， 2003）。目前世界已知蜱總科的種類約 800 余種，其中硬蜱科 (最大多數(shù)，包括 3 個(gè)亞科共 13 屬約 650 種，其次為軟蜱科，包括 4 屬共約 100 種，納蜱科種類最少，截止目前，只記錄了一屬一種（ 鄧國(guó)藩， 1978）。在我國(guó)，已記錄的蜱有 101 個(gè)種和亞種，分別隸屬于 9 個(gè)屬，其中以血蜱屬的種類最多，共 43 種，約占總數(shù)的 2 5，硬蜱屬 20 種，約占總數(shù)的 1 5，牛蜱屬種類最少，只有一種（ 鄧國(guó)藩等， 1991）。蜱是家畜體表的一種吸血外寄生蟲(chóng)，少數(shù)寄生于鳥(niǎo)類、爬蟲(chóng)類，個(gè)別寄生于兩棲類。其生 活史為不完全變態(tài)，可分為卵、幼蟲(chóng)、若蟲(chóng)和成蟲(chóng)四個(gè)時(shí)期（ 孔繁瑤， 1981）。蜱是許多脊椎動(dòng)物的吸血寄生蟲(chóng)，它能引起被感染動(dòng)物貧血、食欲減退、體重下降、血液成分變化等。如日本和澳大利亞學(xué)者(et 1993)的研究表明微小牛蜱（ 使被感染牛的外周血淋巴細(xì)胞中的 T 淋巴細(xì)胞減少，而重度感染的牛的 B 淋巴細(xì)胞也會(huì)減少，也能抑制牛的免疫應(yīng)答。正是由于這種免疫抑制才使得蜱的存活及蜱傳病的發(fā)生成為可能。蜱及其傳播的血液原蟲(chóng)病是人和家畜疾病的重要來(lái)源，同時(shí)它還傳播多種 病毒、立克次氏體、原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、螺旋體及細(xì)菌類疾病。其中大多數(shù)是重要的自然疫源性疾病和人畜共患病，嚴(yán)重危害人畜健康，制約著畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。青海血蜱（ 1978 年由鄧國(guó)藩命名的一個(gè)新種，分布于青海、甘肅、寧夏、四川、云南等海拔高度在 1， 600 4， 200 米的區(qū)域，國(guó)外未有記錄。該蜱主要寄生于綿羊、山羊。成蜱和若蜱 4 7 月份活動(dòng)， 5 月份最多，隨后逐漸消失， 9 月份又出現(xiàn)， 11 月份消失。該蜱生活于山區(qū)草地或灌木叢，屬三宿主蜱，在自然界（高寒地區(qū)） 3 年完成 1 個(gè)世代 ，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi) 1 年能完成一個(gè)世代（袁改玲等， 2002）。已證實(shí)青海血蜱是羊泰勒蟲(chóng)（ 和中華泰勒蟲(chóng) (及羊的巴貝斯蟲(chóng)（ 的傳播媒介 (et 2002；et 2002a, 2002b, 2004)，同時(shí)也能傳播一種感染牦牛的泰勒蟲(chóng)（ （ et 2002c）。 傳統(tǒng)防治蜱的方法是化學(xué)防治，由于化學(xué)藥物需恰當(dāng)使用加之成本昂貴使得該法耗資巨大，許多小農(nóng)場(chǎng)主也因不能 接受防治成本是該病長(zhǎng)期反復(fù)感染的原因之一。然而，更主要的問(wèn)題是蜱不斷出現(xiàn)抗藥性及藥物造成的環(huán)境污染。例如，在澳大利亞，微小牛蜱已對(duì)砷、有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸等多種藥物產(chǎn)生抗藥性（ et 1994）。從社會(huì)和科學(xué)關(guān)注的角度看，完全依賴化學(xué)藥物預(yù)防不是長(zhǎng)久之計(jì)，需研制一種能替代化學(xué)防治的方法，這樣才能符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。而且隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，使對(duì)蜱實(shí)施可持續(xù)控制（綠色控制）成為可能。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 蜱宿主病原間存在著復(fù)雜的免疫反應(yīng)（ 薄新文等， 1998；袁改玲， 2002）。其 一，蜱及其傳播的病原體對(duì)抗宿主的免疫應(yīng)答。蜱通常通過(guò)繞行、偏離或者抑制等手段來(lái)對(duì)抗宿主的免疫防御系統(tǒng)。蜱傳播的病原體為了生存、擴(kuò)散和防御宿主對(duì)其的消除作用直接導(dǎo)致了病原體對(duì)宿主先天或后天特異性獲得性免疫的多種防御機(jī)制的產(chǎn)生。其中免疫逃避機(jī)制包括：抗原變異、抑制某些分子對(duì)微生物的殺傷作用、對(duì)主要組織相容性復(fù)合物分子的負(fù)調(diào)節(jié)和破壞抗原提呈、調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)、偏離 T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)、改變由細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用和產(chǎn)生偽裝趨化因子及細(xì)胞因子等。而且，通常一種病原體常能形成多重免疫逃避機(jī)制（ et 2001）。其二，宿主對(duì)蜱感染的免疫，包括非特異免疫和特異免疫，兩者經(jīng)常協(xié)同作用。非特異性免疫又稱天然免疫，是動(dòng)物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中所形成遺傳特征，它在一定程度上反映了動(dòng)物被感染后迅速提高免疫反應(yīng)水平的能力，品種不同，甚至個(gè)體不同，其在天然條件下對(duì)感染的反應(yīng)能力也不同。例如，2002）通過(guò)對(duì)非洲的大量羚羊進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，雖然在野外受到很多蜱的侵襲，但在羊體上蜱的數(shù)量極少，這可能是羚羊經(jīng)常受到蜱的侵襲，在進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了對(duì)蜱的非特異性抵抗力。另外，趙忠芳等（ 1998）對(duì)不同體況動(dòng)物自身抗蜱能力 作了研究，發(fā)現(xiàn)以卡介苗作為免疫增強(qiáng)劑能提高兔對(duì)蜱的抵抗力，提出在蜱活動(dòng)季節(jié)滅蜱時(shí)，應(yīng)該考慮動(dòng)物身體狀況，加強(qiáng)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，對(duì)種用動(dòng)物以免疫增強(qiáng)劑進(jìn)行接種，以減少疾病的發(fā)生。特異性免疫又稱獲得性免疫，為后天所獲得。這種免疫是由于作為抗原的寄生蟲(chóng)激發(fā)宿主機(jī)體所產(chǎn)生的一系列識(shí)別與排斥的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。特異性免疫清除相應(yīng)抗原的能力，顯著強(qiáng)于非特異性免疫力，是進(jìn)行人工免疫的基礎(chǔ)。這種后天獲得的特異性免疫不能遺傳（童競(jìng)亞， 1996）。蜱吸血能誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答，當(dāng)宿主獲得抗蜱免疫后可導(dǎo)致蜱吸血量減少，飽血程度下降，吸血 時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)卵量下降，以及蜱和卵的死亡率升高等。蜱叮咬的部位常會(huì)有顯著的病理變化，當(dāng)宿主再次被蜱叮咬時(shí)，就會(huì)發(fā)生獲得性免疫應(yīng)答。宿主經(jīng)蜱誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可使皮膚產(chǎn)生癢覺(jué)，刺激宿主的清除反應(yīng)，使宿主減少荷蜱量。由此可見(jiàn)，宿主對(duì)蜱的抵抗力可以有效地控制蜱的感染。如果通過(guò)疫苗免疫使宿主從易感變成有抵抗力必然有助于對(duì)蜱種群的控制。此種良好前景使得人們開(kāi)始致力于對(duì)宿主免疫機(jī)理和疫苗的研究?？跪缫呙缈捎嗅槍?duì)性的消滅特異性蜱種，有利于環(huán)境保護(hù)和人類健康，易于管理且成本低廉。本研究的對(duì)象是巴貝斯蟲(chóng)病和泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介 青海血蜱，其研究結(jié)果對(duì)于蜱及蜱傳病的防治都具有重要意義。 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 疫苗免疫是畜禽病蟲(chóng)害可持續(xù)控制技術(shù)中最為有效的方法之一，家畜外寄生蟲(chóng)病的防治也是如此。 能性抗原的選擇 藏抗原”概述 疫苗的開(kāi)發(fā)首先在于功能性抗原的選擇，盡管人們多次證實(shí)用半飽血微小牛蜱雌蜱的提取物免疫牛能增強(qiáng)?？乖擈绲哪芰?(et 1986; et 1996; et 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 1988a;1988b)，但這與疫苗的實(shí)際發(fā)展相距甚遠(yuǎn)，因 為研制理想疫苗的前提是保護(hù)性抗原的尋找和詳細(xì)分析。常規(guī)的抗原是正常的寄生蟲(chóng)與宿主作用過(guò)程中與宿主相接觸的寄生蟲(chóng)分子，由于寄生蟲(chóng)與宿主間的選擇相容性在進(jìn)化過(guò)程中得以發(fā)展，使這些抗原所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫在寄生蟲(chóng)控制中的效力不足。上述缺陷使得人們開(kāi)始尋求內(nèi)在的生理目標(biāo) 新的抗原或“隱藏抗原”。這些抗原通常情況下可能不與宿主接觸，很可能有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)對(duì)寄生蟲(chóng)損害更大的宿主的免疫應(yīng)答。采用不同于傳統(tǒng)疫苗研究的技術(shù)路線，篩選出外寄生蟲(chóng)在正常發(fā)育過(guò)程中從未與宿主免疫系統(tǒng)接觸的“隱藏抗原”，由這些“隱藏抗原”誘導(dǎo) 的宿主免疫保護(hù)可避開(kāi)寄生蟲(chóng)的免疫逃避機(jī)制，因此其免疫原性良好的組分可作為疫苗候選抗原，并可用于研究外寄生蟲(chóng)的免疫機(jī)理，探討以分子疫苗防制外寄生蟲(chóng)感染的新方法，提高對(duì)外寄生蟲(chóng)及其傳播的傳染性疾病及血液原蟲(chóng)病防治的水平，減少有害化學(xué)藥物對(duì)環(huán)境及肉、蛋、奶的危害，提高畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展能力。而且事實(shí)也證明科學(xué)家們?cè)趯ふ摇半[藏抗原”方面已有很多成功的實(shí)踐。例如， （ 1972）的研究表明飼喂于用斯蒂芬斯瘧蚊（ 腸抗原免疫的兔體上的蚊子比飼喂于未免疫或用整個(gè)蚊子的研磨物免 疫的兔體上的蚊子有較高的死亡率，這也許就是“隱藏抗原”的雛形。盡管 (1979a)沒(méi)有給出“隱藏抗原”的確切定義，但他們還是第一次記錄了“隱藏抗原”能顯著提高家畜抵抗吸血節(jié)肢動(dòng)物侵襲的能力。 （ 1989; 1995）對(duì)微小牛蜱提取物進(jìn)行組分純化，并進(jìn)行免疫攻擊試驗(yàn)，利用這種方法已經(jīng)分離到截止目前最為有效的“隱藏抗原”，如微小牛蜱的 原，并利用該抗原研制成功了抗微小牛蜱的重組疫苗。已發(fā)現(xiàn)的“隱藏抗原”還有麗蠅屬銅綠蠅的 et 1993)和 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的 et 1993)。 發(fā)現(xiàn)的功能性抗原 免疫學(xué)、分子生物學(xué)和信息技術(shù)的迅速發(fā)展為蜱的功能性抗原的發(fā)現(xiàn)及研究提供了有力的手段。截止目前，已從微小牛蜱、長(zhǎng)角血蜱、小亞璃眼蜱等多種蜱的唾液腺、腸道、馬氏管、卵巢和肌肉等組織與器官中分離和鑒定出多種重要的功能性抗原。利用這些功能性抗原免疫的動(dòng)物均能產(chǎn)生不同程度的抗蜱免疫。 微小牛蜱有關(guān)的功能性抗原 在蜱的免疫學(xué)防治方面，對(duì)微小牛蜱研究較多也較早，而且 成為最著名的保護(hù)性抗原。 原是 (1989)從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道中分離出的一種膜結(jié)合糖蛋白，分子量為 89000，等電點(diǎn)為 微克級(jí)的抗原免疫牛所產(chǎn)生的抗體即對(duì)牛有抗蜱保護(hù)作用，當(dāng)微小牛蜱吸食了用 原免疫的牛的血液時(shí)，血液中的抗體即與蜱腸道表面的相應(yīng)糖蛋白結(jié)合，從而使蜱腸道受到嚴(yán)重?fù)p傷，當(dāng)牛血液滲入蜱的血淋巴后，能更進(jìn)一步引起蜱的大規(guī)模死亡及繁殖和生存能力的下降等。并已證明 一種“隱藏抗原”。但天然 原在微小牛蜱體內(nèi)含量甚微，限制了從蜱中大量分離和純化該類蛋白，于是人們尋求 用分子生物學(xué)手段來(lái)獲得重組蛋白。 (1994)證實(shí) 原在不同株的微小牛蜱腸道細(xì)胞膜上均有存在，用重組蛋白 備的疫苗對(duì)不同株的微小牛蜱以及已經(jīng)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的微小牛中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 蜱都能產(chǎn)生免疫抵抗。該結(jié)果提示可用重組 疫牛來(lái)防制微小牛蜱。于是 (1989) 構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量為 8 105 微小牛蜱 庫(kù) , 并根據(jù) 內(nèi)切蛋白酶 化序列設(shè)計(jì)了 4 個(gè)寡脫氧核苷酸探針，用此探針從文庫(kù)中分離和鑒定出一個(gè)編碼 其序列包 含一個(gè) 1982 個(gè)堿基的開(kāi)放閱讀框 , 預(yù)測(cè)的 組蛋白含有 650 個(gè)氨基酸 , 其中包括 19 個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和近 C 端 23 個(gè)氨基酸的疏水區(qū)。推測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)含有由 6 個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成的多次重復(fù)區(qū)，提示該蛋白含有多個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域。大腸桿菌中對(duì) 599 個(gè)氨基酸的 白和 651 個(gè)氨基酸的 該包涵體免疫的牛對(duì)微小牛蜱具有明顯的抵抗力。然而，原核表達(dá)的重組 函體對(duì)動(dòng)物的免疫保護(hù)作用不如天然 是澳大利亞墨爾本大學(xué)的 (1990) 利用真菌的 動(dòng)子系統(tǒng)對(duì)微小牛蜱的 因在絲狀真菌 進(jìn)行了高效表達(dá)和分泌。表達(dá)產(chǎn)物包含 泌信號(hào)及其全部成熟多肽，但無(wú)疏水碳端。所分泌的 重組蛋白分子量約為 83到 87根據(jù)氨基酸序列推測(cè)的分子量為 69表達(dá)水平約為 ，未在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到該重組蛋白。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中檢測(cè)到了高水平的編碼 巴的 1994) 和1996) 等對(duì)在畢赤酵母（ 表達(dá)的重組蛋白 生化特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在該系統(tǒng)中表達(dá)的 7到 40的是 1997) 的研究恰恰證實(shí)了正是因?yàn)檫@種顆粒狀的結(jié)構(gòu)才提高了 原的免疫原性及其在控制微小牛蜱方面的巨大潛力。但可惜的是盡管以重組蛋白 基礎(chǔ)的抗微小牛蜱疫苗好多試驗(yàn)中以其對(duì)牛的強(qiáng)大保護(hù)力征服了廣大用戶，但在阿根廷 A 株 微小牛蜱面前它卻顯得蒼白無(wú)力。于是古巴科學(xué)家 (2000) 利用反轉(zhuǎn)錄 微小牛蜱 A 株中分離了 因，并在畢赤酵母（ 進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為一顆粒狀糖蛋白。試驗(yàn)表明以該重組蛋白為基礎(chǔ)的疫苗對(duì)不同地域的微小牛蜱具有更廣譜的抗性。然而通常以單一抗原為基礎(chǔ)的抗蜱疫苗往往不如以幾種靶抗原為基礎(chǔ)的抗蜱疫苗的保護(hù)效果，于是人們也在不停地尋找微小牛蜱的其它保護(hù)性抗原。例如， （ 1991）從半飽血微小牛蜱雌蜱中分離出 的一種羧基二肽酶，是在微小牛蜱的唾液腺和腸道中大量分布的一種“隱藏抗原”。 （ 1996）證實(shí) 增強(qiáng) 為疫苗抗原對(duì)微小牛蜱的抵抗作用。（ 1998）也從半飽血的微小牛蜱雌蜱中分離出 原，盡管該抗原對(duì)動(dòng)物的免疫保護(hù)性不如 么顯著，但當(dāng)其與 合應(yīng)用時(shí)，能增加后者的免疫性。研究還發(fā)現(xiàn)微小牛蜱自然感染宿主不能產(chǎn)生針對(duì) 免疫應(yīng)答，提示它又是一種“隱藏抗原”。免疫熒光分析顯示該抗原在蜱腸道、唾液腺和卵巢等的表面廣泛分布。另一方面，一些細(xì)胞因 子能調(diào)節(jié)動(dòng)物的免疫應(yīng)答， （ 1999）曾嘗試用編碼 列與一些羊的細(xì)胞因子基因聯(lián)合應(yīng)用，最后輔以一次 組蛋白來(lái)免疫綿羊，并獲得了強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。單克隆抗體技術(shù)在尋找抗蜱保護(hù)性抗原和評(píng)價(jià)抗蜱抗體是否對(duì)蜱具有損傷性等方面也發(fā)揮著重要作用。 (1995) 利用 18 種抗微小牛蜱中腸抗原的單克隆抗體作探針?lè)謩e與不同發(fā)育階段的微小牛蜱的各種器官雜交，結(jié)果證實(shí)了常規(guī)抗原存在于成蜱的腸道表面、唾液腺型腺泡和馬氏管及幼蜱的腸道中，但在成蜱的卵巢和發(fā)育中的卵中不存在。在此之前， 他們用單克隆抗體 淀了一種抗原，當(dāng)用 10 日齡微小牛蜱幼蜱攻擊用該抗原免疫的牛時(shí)，該蜱的產(chǎn)卵量減少 62%且對(duì)牛的保護(hù)率達(dá) 99%以上。對(duì)抗微小牛蜱中腸和生殖管組織的單克隆抗體篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，有一種單中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 克隆抗體能與不同發(fā)育階段的微小牛蜱的組織中的不同大小的蛋白反應(yīng)，有一種只與 中腸提取物反應(yīng)（ et 1991）。在巴西 , (1997) 用微小牛蜱的胚和腸道提取物免疫 c 小鼠，將該小鼠的脾細(xì)胞和 骨髓瘤細(xì)胞雜交，制備了 四種單克隆抗體。這些單克隆抗體均能識(shí)別不同發(fā)育階段的微小牛蜱的組織或器官。當(dāng)他們將這些單克隆抗體注射入飽血微小牛蜱雌蜱的下腹后，發(fā)現(xiàn)單抗 使該蜱的產(chǎn)卵量顯著下降。 長(zhǎng)角血蜱有關(guān)的功能性抗原 (1999)測(cè)定了一個(gè)能編碼分子量為 29胞外基質(zhì)樣蛋白的 隆，所編碼蛋白 長(zhǎng)角血蜱唾液腺相關(guān)，此胞外基質(zhì)樣蛋白的結(jié)構(gòu)類似于膠原蛋白。該蛋白能在飽血或未飽血的長(zhǎng)角血蜱成蜱或非成蜱中表達(dá)，重組蛋白對(duì)兔具有明顯的免疫保護(hù)作用 ，曾被作為抗長(zhǎng)角血蜱疫苗的候選抗原。然而， 組蛋白只能刺激家兔產(chǎn)生抗長(zhǎng)角血蜱幼蜱和若蜱的免疫，而對(duì)成蜱無(wú)任何抗性。于是 (2001) 又對(duì)所構(gòu)建的長(zhǎng)角血蜱成蜱的 達(dá)文庫(kù)進(jìn)行了免疫學(xué)篩選，并結(jié)合 和 3末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆了兩個(gè)編碼該蜱唾液腺蛋白的 別命名為 析表明此二基因也能在蜱的其它器官中表達(dá)。他們?cè)诖竽c桿菌中成功表達(dá)了重組 白，并對(duì)其作為抗蜱疫苗抗原的可行性也做了分析，結(jié)果顯示 種重組蛋白均可作 為抗長(zhǎng)角血蜱“雞尾酒”疫苗的有效成分。蜱的肌肉組織在蜱吸血時(shí)發(fā)揮著重要作用，自然也有人將尋找保護(hù)性抗原的目光盯到了蜱的肌肉組織。 (2001)用經(jīng)長(zhǎng)角血蜱反復(fù)叮咬的家兔的陽(yáng)性血清從該蜱的 達(dá)文庫(kù)中篩選出了 0 基因。其預(yù)測(cè)的氨基酸序列與黑腹果蠅（ 的肌原蛋白 I 亞基的 隆同源。免疫化學(xué)分析結(jié)果顯示，天然 0 蛋白廣泛存在于長(zhǎng)角血蜱的各種組織中。同樣，一些酶類如幾丁質(zhì)酶、抗氧化酶和絲氨酸蛋白酶及其抑制劑在蜱的生活史中也是非常重要的。幾 丁質(zhì)酶與蜱的蛻皮、調(diào)控新陳代謝和圍食膜孔隙度等密切相關(guān)。 (2003) 首次從長(zhǎng)角血蜱 庫(kù)中克隆了一個(gè)蜱的幾丁質(zhì)酶分子，并在昆蟲(chóng)桿狀病毒中對(duì)之進(jìn)行了成功的表達(dá)。重組的幾丁質(zhì)酶 有效降解幾丁質(zhì)。該研究預(yù)示此重組蛋白可作為抗長(zhǎng)角血蜱疫苗的候選抗原。同時(shí)由于重組的昆蟲(chóng)桿狀病毒能感染蜱，也啟發(fā)人們?nèi)パ兄埔环N新的生物殺蟲(chóng)劑。抗氧化酶能及時(shí)清除真核生物在有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基，從而消除氧自由基對(duì)真核生物的毒性作用。 2001) 首次克隆和表達(dá)了長(zhǎng)角血蜱的一種有酶活性的過(guò)氧化物還 原酶 酶在蜱吸血時(shí)大量表達(dá)，提示它可能是蜱正常生活史中的一種重要解毒酶。對(duì) 能的闡明能幫助我們更好的理解蜱唾液腺的生理特性和蜱在吸血時(shí)與宿主間的相互作用。絲氨酸蛋白酶及其抑制劑能參與許多生物的發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)，所以它們或許也是抗蜱疫苗的候選抗原 (1984, 1986; et 1998; et 2001a)。 (2001b)利用 端快速擴(kuò)增技術(shù)（ 隆了長(zhǎng)角血蜱的兩個(gè)絲氨酸蛋白酶基因 （ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 它功能性抗原 1988) 的研究表明，美洲花蜱（ 叮咬家兔的過(guò)程中能向兔體分泌一些物質(zhì)，在這些分泌物中有三種分子量分別為 41、 40 和 39蛋白能刺激家兔產(chǎn)生抗美洲花蜱的抗體。 （ 1986） 用免疫印跡法證實(shí)超敏兔血清能與吸血 96 小時(shí)的小亞璃眼蜱（ 蜱唾液中的 9 種蛋白和唾液腺中的 17 種蛋白反應(yīng)。將從唾液中提取的抗原、和 注入經(jīng)小亞璃眼蜱叮咬的家兔皮內(nèi)后，三者均能刺激機(jī)體產(chǎn)生速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)后兩者能刺激機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋了影響抗蜱免疫的機(jī)理。 (1996) 用蛔蟲(chóng)提取物（ 種型變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑）和蜱唾液腺提取物（ 弗氏不完全佐劑免疫雜交牛（ 結(jié)果表明當(dāng)作為免疫調(diào)節(jié)劑的蛔蟲(chóng)提取物與蜱的唾液腺提取物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能明顯增強(qiáng)?？剐喠а垓珧绲拿庖吡?。 2001) 用 認(rèn)了一種分子量為 39蛋白，它能引發(fā) 牛對(duì)不同階段小亞璃眼蜱的抗性。 (2003) 利用 端快速擴(kuò)增技術(shù)（ 隆了附尾扇頭蜱（ 四個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（ (2003) 克隆和表達(dá)了兩種蜱的鐵蛋白酶。周金林 (2004) 等也克隆到了鐮形扇頭蜱和微小牛蜱的多個(gè)酶和酶的抑制劑分子新基因。 商業(yè)化的抗蜱疫苗 目前 ,已商業(yè)化的預(yù)防寄生蟲(chóng)的疫苗只有預(yù)防微小牛蜱的 et 1995; et 1992）和 (et 1995a)。 抗原成分是 1994年在澳大利亞注冊(cè)，并進(jìn)行了大范圍的評(píng)價(jià)，通過(guò)生產(chǎn)者的調(diào)查，用戶的接受程度已很高。在巴西的一項(xiàng)病原管理的項(xiàng)目中進(jìn)行了野外評(píng)價(jià)。該疫苗能使免疫牛所感染的蜱的數(shù)量下降 89%。古巴生產(chǎn)的抗微小牛蜱疫苗 根據(jù)已發(fā)表的 列而生產(chǎn)的。截止目前，該疫苗已在古巴、哥倫比亞、 多米尼加共和國(guó)、巴西、玻利維亞和巴拉圭等國(guó)家注冊(cè)，在墨西哥、巴西、哥倫比亞和古巴進(jìn)行了條件試驗(yàn)，并在古巴、巴西、阿根廷和哥倫比亞等國(guó)家進(jìn)行了田間試驗(yàn) (et 1997)。 (1995b) 在巴西的田間試驗(yàn)顯示重組疫苗奶牛、肉牛及雜交牛均有很好的保護(hù)作用。且當(dāng)該疫苗與口蹄疫疫苗和和狂犬病疫苗一起使用時(shí)，三者不會(huì)互相影響，也不會(huì)對(duì)被免疫動(dòng)物產(chǎn)生不良影響。他們建議每 6 周重復(fù)免疫一次能一直維持 保護(hù)作用。因微小牛蜱是牛巴貝斯蟲(chóng)（ 無(wú)漿體（ 的傳播媒介，所以抗微小牛蜱疫苗 應(yīng)用也降低了牛巴貝斯蟲(chóng)病和無(wú)漿體病的發(fā)病率 (et 1995c; et 1995)。同時(shí)，也因該疫苗的使用從總體上增強(qiáng)了牛的體質(zhì)，從而提高了牛對(duì)蠅蛆病等其它疾病的抵抗力 (et 1995)。另一方面，也因該疫苗的使用而節(jié)省了對(duì)蜱的傳統(tǒng)化學(xué)療法及用于治療蜱傳病的巨大開(kāi)支 (et 1997)。因?yàn)橛?jì)算機(jī)模擬可以為疫苗免疫控制方法提供 快速而簡(jiǎn)便的方式，故用疫苗進(jìn)行大規(guī)模抗蜱免疫程序的計(jì)算機(jī)模擬工作正在古巴進(jìn)行，但程序還有待于進(jìn)一步完善和優(yōu)化。另外，因許多蜱種之間存在交叉反應(yīng)，故多價(jià)免疫將是更有效的疫苗，目前澳大利亞人正在尋求其他抗原，以便與合使用來(lái)加強(qiáng)疫苗的效果。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 蜱免疫的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) （ 1994）認(rèn)為抗蜱疫苗在田間并不一定在一代內(nèi)就直接將蜱殺死，而是要在連續(xù)的幾代內(nèi)通過(guò)降低蜱的繁殖能力而從總體上循序漸進(jìn)地控制蜱的數(shù)量?？跪缫呙绲闹饕Ч峭ㄟ^(guò)減少每只飽血雌蜱的產(chǎn)卵量從而減少幼蜱總量，只對(duì)少量動(dòng)物 免疫所得到的保護(hù)效果相對(duì)于對(duì)蜱種群的控制計(jì)劃來(lái)說(shuō)只是杯水車薪。目前，限制抗外寄生蟲(chóng)疫苗進(jìn)入市場(chǎng)的主要因素可能還是源于人們對(duì)寄生蟲(chóng)疫苗通過(guò)免疫攻擊試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)的誤區(qū)。 議，對(duì)寄生蟲(chóng)疫苗的評(píng)價(jià)應(yīng)以動(dòng)物系統(tǒng)中的經(jīng)濟(jì)效益及其他可持續(xù)農(nóng)業(yè)的指標(biāo)為準(zhǔn)，而不應(yīng)僅僅以疫苗免疫和攻擊研究中的保護(hù)率水平為準(zhǔn)。僅僅中度有效的疫苗可能在降低寄生蟲(chóng)數(shù)量方面很有作用。從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)看，將免疫保護(hù)期延長(zhǎng)至 5 10 年在寄生蟲(chóng)控制中的作用要遠(yuǎn)比將保護(hù)率提高到 50 70的作用大得多。必須看到，外寄生蟲(chóng)疫苗只能減少外寄生蟲(chóng)數(shù)量而不是只 保護(hù)單個(gè)動(dòng)物，而且還需連續(xù)幾代在一定范圍內(nèi)科學(xué)管理才能見(jiàn)效。所以， （ 1995）認(rèn)為一個(gè)良好的蜱的防控計(jì)劃應(yīng)該做到： 1，對(duì)一個(gè)畜群中所有動(dòng)物都要進(jìn)行抗蜱免疫。 2，接受抗蜱免疫的畜群要封閉管理，因?yàn)橐胛疵庖叩膫€(gè)體會(huì)使蜱在整個(gè)畜群中又死灰復(fù)燃。 3，應(yīng)該明確抗蜱疫苗對(duì)蜱的損害是從吸食了被免疫動(dòng)物血液的蜱的下一代開(kāi)始的，并在逐代加強(qiáng)。 綜上所述，疫苗免疫是畜禽病蟲(chóng)害可持續(xù)控制技術(shù)中最為有效的方法之一，家畜外寄生蟲(chóng)病的防治也是如此。而設(shè)計(jì)寄生蟲(chóng)疫苗的關(guān)鍵是：（ 1）確認(rèn)保護(hù)性抗原；（ 2）使該抗原的 生產(chǎn)達(dá)到足以使用的量；（ 3）用最有效的方法去管理和實(shí)施。然而，多少年來(lái)，這三個(gè)因素仍象一條不可逾越的鴻溝阻礙著人類利用免疫學(xué)方法防治蜱的進(jìn)程。直到最近十幾年來(lái)，人類才揭開(kāi)了抗寄生蟲(chóng)疫苗免疫的神秘面紗之一角?，F(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，使得人們對(duì)保護(hù)性抗原的尋找變的更加方便可靠。各種克隆表達(dá)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，使得科學(xué)家們能夠得到足量的用于分析的保護(hù)性抗原，并使該種抗原的商業(yè)化批量生產(chǎn)成為可能。新型佐劑的出現(xiàn)和利用生物復(fù)制載體（如細(xì)菌和病毒）將抗原導(dǎo)入宿主已開(kāi)辟了預(yù)防接種的新途徑 (et 1991)。免疫新概念正在完善我們對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制的理解，而對(duì)抗原的研究已拉開(kāi)了人類理解各種免疫細(xì)胞激活機(jī)理的新序幕。目前，盡管抗寄生蟲(chóng)疫苗還相對(duì)甚少，而且還存在著種種缺陷，如果將人類當(dāng)前對(duì)寄生蟲(chóng)免疫的研究成果看成是寒夜中的啟明星，則利用疫苗來(lái)徹底防治寄生蟲(chóng)的曙光離我們并不遙遠(yuǎn)。 究?jī)?nèi)容和方法 盡管我國(guó)是蜱及蜱傳病危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，但在蜱的免疫學(xué)方面的研究工作開(kāi)展甚少。本研究以青海血蜱這一我國(guó)特有的蜱種為研究對(duì)象，采用不同于傳統(tǒng)疫苗研究的技術(shù)路線，從蜱的唾液腺篩選出外寄生蟲(chóng)在正常 發(fā)育中從未與宿主免疫系統(tǒng)接觸的“隱藏抗原”，由這些“隱藏抗原”誘導(dǎo)的宿主免疫保護(hù)可防止寄生蟲(chóng)的免疫逃避機(jī)制。試驗(yàn)中將通過(guò)比較用蜱叮咬和用蜱唾液腺研磨物免疫動(dòng)物所得抗血清的差異