分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學(xué) 號： 100820047 福州 大學(xué)碩士學(xué)位論文 青枯雷爾氏菌致病力分化及其特征色譜建立 學(xué) 科 門 類： 工 學(xué) 一級學(xué)科名稱： 生物工程 二級學(xué)科名稱： 發(fā)酵工程 研 究 方 向：生物農(nóng)藥 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 研究 員 副 研究員 完 成 時 間：二 年 一 月 摘要 本論文利用高效液相離子交換色譜體系，研究了世界上分布最廣、危害最重且最難防治的植物致病菌 青枯雷爾氏菌的色譜行為。 通過對不同來源地菌株的色譜分析，研究了不同致病力不同地域不同寄 主的青枯雷爾氏菌 的色譜行為，并且探究了 枯雷爾氏菌 在 番茄內(nèi)的定殖能力、生物防效以及生物防效和色譜行為之間的聯(lián)系， 并且建立了青枯雷爾氏菌的特征色譜圖庫。 主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1 優(yōu)化了青枯雷爾氏菌的色譜分離及表征的條件。通過優(yōu)化，得 到最佳的色譜條件： 在室溫下，在 緩沖液為 A 液是 哌嗪， B 液是哌嗪體系下，使用 色譜柱規(guī)格 強(qiáng)陰離子交換樹脂 速為 1ml/脫梯度是 1 的 75%（ 30色譜條件下 ， 青枯雷爾氏菌 得到很好的分離及表征 ，出現(xiàn)一個單一的特征峰 。 2 通過對 2 株不同致病力的菌株 行了色譜表征，得到了不同致病 力的青枯雷爾氏菌的特征譜圖。通過對特征譜圖的分析表明：不同致病力的菌株的特征峰在峰型以及保留時間上有差別，致病力越強(qiáng)的菌株，其特征峰的保留時間越長。 3 對 35 株弱致病性的 枯雷爾氏菌進(jìn)行了色譜表征。根據(jù)其特征峰的個數(shù)，將這 35 株菌分為 3 類。第 1 類，在 1現(xiàn)單一的特征峰；第 2 類，在1 8出現(xiàn)特征峰；第 3 類，在 18 17出現(xiàn)特征峰。 4 對分離自不同地域不同寄主的青枯雷爾氏菌進(jìn)行了色譜表征。通過對這 4種寄主的青枯雷爾氏菌進(jìn)行色譜表征，也得到了 3 種類型的特征譜圖。結(jié) 果表明青枯雷爾氏菌的色譜形態(tài)和寄主以及地域的相關(guān)性不大，與致病力有關(guān)。 5 對 枯雷爾氏菌的定殖能力與生物防效進(jìn)行了研究。研究表明，生物防效較好的菌株，其定殖能力就較強(qiáng)；而且其色譜形態(tài)大多表現(xiàn)出第 1 類形態(tài)。 實驗表明利用高效液相離子交換色譜法 對青枯雷爾氏菌進(jìn)行表征 ， 可對青枯雷爾氏菌進(jìn)行分類，并且研究了色譜行為與致病力、寄主以及地域之間的關(guān)系。這種研究方法將為闡明青枯菌的多態(tài)性及其在傳代培養(yǎng)過程中致病性逐漸減弱的內(nèi)在機(jī)理，并最終研制出特效的青枯菌抗菌劑奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌， 高效液相色譜， 色譜分析，植物疫苗，定殖 of of of by By of on in of of in s as 1 . At on a 650 C （ 200 a at a a 75 /30. 2 by we of of of on If of 3 5 of to of 5 of a 11874 of of as as of 5 we of of on a of th of to be of as as us to s 錄 摘要 . 2 . 3 第一章 緒論 . 7 1 前言 . 7 2 青枯雷爾氏菌的致病機(jī)理以及致病力分化 . 7 3 高效液相色譜在細(xì)菌上的應(yīng)用 . 9 4 青枯病的防治研究進(jìn)展 . 11 學(xué)防治 . 11 物防治 . 11 第二章 青枯雷爾氏菌致病力分化 . 13 1 前言 . 14 2 材料及方法 . 14 料 . 14 器設(shè)備 . 14 養(yǎng)基 . 14 法 . 14 3 結(jié)果與分析 . 15 化指數(shù)的測定 . 15 4 討論 . 18 第三章 青枯雷爾氏菌色譜表征條件的確立 . 19 1 前言 . 19 2 材料及方法 . 19 料 . 19 器設(shè)備 . 19 養(yǎng)基 . 19 法 . 19 譜原理 . 19 效液相色譜條件及方法探究 . 20 枯雷爾氏菌的培養(yǎng) . 20 沖液對青枯雷爾氏菌活力的影響 . 20 品前處理 . 20 沖體系的確定 . 20 液量的優(yōu)化 . 21 譜條件的確立 . 21 譜系統(tǒng)的前處理 . 21 譜體系及方法 . 21 3 結(jié)果與分析 . 22 譜環(huán)境的分析 . 22 沖液對青枯雷爾氏菌活力的影響 . 22 樣樣品的前處理 . 22 譜條件的確立 . 23 沖液 確定 . 23 液量的選擇 . 25 4 討論 . 27 第四章 青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征圖譜的建立 . 29 1 前言 . 29 2 材料與方法 . 29 料 . 29 器設(shè)備 . 29 養(yǎng)基 . 29 枯雷爾氏菌的色譜表征 . 29 同致病力的青枯雷爾氏菌的色譜表征 . 29 座子插入系列青枯雷爾氏菌的色譜表征 . 30 同寄主的青枯雷爾氏菌的色譜表征 . 30 3 結(jié)果與分析 . 33 同致病力 青枯雷爾氏菌色譜表征 . 33 枯雷爾氏菌 色譜表征 . 34 座子插入青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜圖庫的建立 . 35 同寄主中青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜 圖庫的建立 . 39 生植株中青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜圖庫的建立 . 39 椒植株中青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜圖庫的建立 . 41 子植株中青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜圖庫的建立 . 43 茄植株中青枯雷爾氏菌的色譜表征及特征色譜圖庫的建立 . 45 4 討論 . 48 第五章 轉(zhuǎn)座子 入青枯雷爾氏菌的定殖及生物防效 . 49 1 前言 . 49 2 材料與方法 . 49 料 . 49 養(yǎng)基 . 49 法 . 49 茄植株的培養(yǎng) . 49 枯雷爾氏菌菌懸液的制備 . 50 弱青枯雷爾氏菌在番茄植株內(nèi)定殖數(shù)量 . 50 株體內(nèi)青 枯雷爾氏菌的分離 . 50 座子 入青枯雷爾氏菌的灌根處理 . 50 座子 入青枯雷爾氏菌的防效評價 . 50 3 結(jié)果與分析 . 51 座子 入青枯雷爾氏菌在番茄植株內(nèi)定殖數(shù)量 . 51 座子 入青枯雷爾氏菌的生物防效實驗 . 53 4 討論 . 55 第五章 結(jié)論和展望 . 57 1 結(jié)論 . 57 2 展望 . 58 參考文獻(xiàn) . 59 青枯雷爾氏菌致病力分化及其特征色譜建立 第一章 緒論 1 前言 青枯雷爾氏菌 ( 簡稱 青枯菌。 是一種革蘭氏陰性植物病原菌，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴(yán)重的植物病害之一 ( C, M,1990)。 至今尚沒有 有效的化學(xué)農(nóng)藥和其他防治辦法。因此青枯病 有著 植物的“癌癥” 之稱 。植物青枯菌可侵染 40多個科 200多種植物，僅次于農(nóng)桿菌 （ ， ， ， 1998） 。是番茄、馬鈴薯、花生、甘薯、煙草、辣椒、茄子、生姜、草莓、香蕉以及一些貴重藥材和花卉植物許多植物生產(chǎn)的重要限制因素，世界各地均有分布 （ 楊柳 ， 蘭濤 ， 巫升鑫 ， 陳順輝 ,吳為人， 2011） 。 2 青枯雷爾氏菌的致病機(jī)理 以及致病力分化 通過研究證明，青枯菌可以從植株的根部或莖部的受傷部位侵入，從而引發(fā)植株發(fā)病。但是在自 然條件下，青枯菌也能從沒有受傷的植株的次生根的根冠侵入。 植物生長時在次生根的根冠和主根的表皮問形成鞘，青枯菌能穿過這層鞘，侵入皮層細(xì)胞間隙生長，破壞細(xì)胞間中膠層，使細(xì)胞壁分離，變形，形成空腔，繼而侵染，木質(zhì)部薄壁組織使導(dǎo)管附近的小細(xì)胞受刺激形成侵填體，并移入侵填體，侵填體破裂后繼被釋放進(jìn)入導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖和快速傳播擴(kuò)張，從而引起植株萎蔫死亡 （ ， 1958） 。植物病理學(xué)研究表明：青枯菌侵入植株后，在皮層細(xì)胞間隙定殖，在生長時，產(chǎn)生大量的胞外多糖，從而阻礙植株體內(nèi)水分運(yùn)輸，造 成導(dǎo)管的堵塞，引起植株的枯萎。 植株 感染青枯病后，一般成株期發(fā)病，先是頂葉萎蔫下垂，然后下部葉片凋萎，最后中部葉片凋萎，也有一側(cè)葉片先萎蔫或全株葉片同時萎蔫 （高歡樂， 2009） 。給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。植株死亡后葉片仍保持青綠色。 革蘭氏陰性細(xì)菌有 5種類型蛋白分泌系統(tǒng) (即 I 中， II I 青枯菌的致病性密切相關(guān)。青枯菌主要通過 ， ， 2004） 。由 因編碼。青枯菌的 因簇呈線性排列。青枯菌中除 22 存在一個獨(dú)立的由 1.3 .7 兩類基因簇之間不存在同源性 （ ， ， ， 2000） 。第二類 稱為附屬的 和分泌效應(yīng)子蛋白 （ ， A， 2003） 。 接將效應(yīng)子蛋白分泌到植株細(xì)胞內(nèi)。 而喪失致病力 （ ， ， ， 2003）。 盡管 青枯菌的 然細(xì)菌的數(shù)量有所減少，但突變體仍然具有侵染番茄 (部并在維管系統(tǒng)定殖的能力，說明 ， ， 2000） 。青枯菌能通過 胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子，這些胞外蛋白能破壞寄主細(xì)胞，引起組織壞死，是導(dǎo)致 寄主植物萎蔫的重要因素。 除與 2有多種因素影響青枯菌的致病力。青枯菌的 青枯菌具有致病性所必需的，其作用可能是保護(hù)青枯菌免遭寄主抗菌物質(zhì)的攻擊。青枯菌侵染番茄的初期，其與番茄的相互識別及定殖離不開與鞭毛有關(guān)的泳動能力， 失去泳動能力的突變株，致病能力顯著降低。青枯菌在具有向化性時才表現(xiàn)出致病性 （黃真池，劉媛，曾富華，盧向陽， 2008） 。 青枯 雷爾氏 菌的菌體呈 現(xiàn)出 長橢圓形，近桿狀，革蘭氏染色為陰性，菌體大小為 米，極生鞭毛 1 能 形成莢膜和芽孢。菌體內(nèi)有聚 羥基丁酸鹽顆粒，在顯微鏡下顯示 的 兩極著色較深 （ ， 1954） 。 青枯雷爾氏菌 在不同寄主上的菌落形態(tài)沒有 太 明顯差異，在普通培養(yǎng)基上菌落呈圓形或不正行，表面光滑，有光澤。在肉汁瓊脂平板上， 32 下培養(yǎng) 48小時后，均出現(xiàn)直徑 為 1沿光滑。青枯菌為好氣性細(xì)菌，在厭氣條件下培養(yǎng)，致病性會迅速喪失， 30 在 四氮唑， 2，3， 5三苯基氯化四氮唑）培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) 48h，會出現(xiàn)兩種菌落形態(tài)：一種是致病性強(qiáng)的野生型菌株，其菌落呈不規(guī)則或近圓形，具有較寬的白邊，流動性強(qiáng)，菌落中心呈粉紅色；另一種是致病力弱或者喪失致病力的變異株，干燥而扁平，菌落白邊很窄或沒有，中心呈暗紅色。 青枯雷爾氏菌 能在培養(yǎng)基上產(chǎn)氨，不產(chǎn)酸，可 以 還原硝酸鹽。培養(yǎng)基的主要碳源 是 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖；主要的氮源是蛋白胨 以及 尿素。 在長期的 傳代 培養(yǎng)中，極易發(fā)生致病力的分化，容易失去致病力。 青枯雷爾氏菌是一種非常復(fù)雜的細(xì)菌，呈現(xiàn)出高度的分化多樣性。根據(jù)對不同植物致病性的差異，將青枯雷爾氏菌劃分不同的生理小種 （ ， ， 1962） 。至 20世紀(jì) 60年代，已經(jīng)將其劃分為 4個生理小種。在 2003年陳永芳，何禮遠(yuǎn)等講青枯雷爾氏菌劃分為 5個小種 （ 陳永芳，何禮遠(yuǎn)，徐進(jìn) 2003） 。根據(jù)青枯雷爾氏菌對三種雙糖（乳糖、麥芽糖以及纖維二糖）和三種醇（甘露醇、甜醇以及山梨醇）的氧化能力， 分為 4個生理型： 、 、 、 、 （ C， 1964） 。 另外，一些學(xué)者還應(yīng)用單抗、多抗血清學(xué)的方法以及 出了很多不同種下的分類方案 （何禮遠(yuǎn)，康耀衛(wèi)， 1995） 。雖然這些研究都沒有得出一致的結(jié)論，但是卻充分的說明了青枯雷爾氏菌的遺傳多樣性。 其劃分為 2個主要的組群：亞洲分支 美洲分支分別包括來自亞洲和美洲的菌株 (， ， 1991)。 除了上述的分類方法外，還有青枯雷爾氏菌的致病性和菌系的分化，其依據(jù)是青枯雷爾氏菌對鑒別品種的反應(yīng)。帥正彬等對四川成都地區(qū)番茄的青枯雷爾氏菌的生理小種進(jìn)行研究，結(jié)果表明，同一生理小種的青枯雷爾氏菌接種番茄后便顯出不同的致病性，得出同一生理小種的菌株，存在致病力的分化這一結(jié)論 （ 帥正彬，蘇家烈，羅小波， 1997） 。 有研究表明，青枯雷爾氏菌存在不同總比病例的分化即強(qiáng)致病力的菌株和無致病力的菌株，強(qiáng)致病力的菌株侵入植株，可導(dǎo)致植株發(fā)??；無致病力的菌株侵入植株，不能 引起植株發(fā)病 （ M， E， f， 2005） 。在一定的條件下，強(qiáng)致病力的菌株，會逐漸喪失致病性，弱化為弱致病性的或無致病性的菌株。但是在自然條件下，青枯雷爾氏菌能夠 保持穩(wěn)定的致病力，抵抗外界不利條件，從而侵入植株，引起植株發(fā)病 。 程本亮通過對不同發(fā)病時期不同部位的番茄以及生姜植株的青枯雷爾氏菌進(jìn)行分離，從發(fā)病初期的番茄植株根部后后期的莖部分離到不同致病力的青枯雷爾氏菌，其中大多數(shù)為強(qiáng)致病力的，少數(shù)菌株為無致病力的 ；而從患有青枯病的生姜植株中分離到的青枯雷爾氏菌 均為無致病力的菌株。 對強(qiáng)致病力的青枯雷爾氏菌 培養(yǎng) 5代之后，青枯雷爾氏菌 青枯雷爾氏菌 代時候出現(xiàn)了致病力的分化。 3 高效液相色譜在 細(xì)菌 上的應(yīng)用 色譜技術(shù)作為一種重要的分析方法，在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛。但是在微生物這一方面，主要用于細(xì)菌成分及代謝產(chǎn)物分析 (陳昭華，劉樹滔，薛偉明 ,2004)。例如應(yīng)用氣象色譜以特征脂肪酸組成為分類依據(jù)進(jìn)行細(xì)菌的分類。 早在 20世紀(jì) 70年代，就有人利用色譜技術(shù)來分析細(xì)菌完整的細(xì)胞。將 微生物懸浮液與樹脂混合后，使用不同濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫，從而將不同的細(xì)菌組分洗脫下來，從而實現(xiàn)分離的目的。 用陽離子交換層析柱 功地實現(xiàn)了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌的分離，且回收率分別為87%和 97%（ E， ， 1976） 。但當(dāng)時對細(xì)菌的分離一般采用 常壓色譜柱，分離時間長，容易染菌；同時由于分離材料上的局限， 8090年代用離子交換樹脂分離細(xì)菌的研究趨于停止 。 近年來，隨著色譜技術(shù)和各種新型分離材料的研究和開發(fā)，又為應(yīng)用色譜技術(shù)分離 細(xì)菌提供了可能 （ 林 娟 劉樹滔 高珍娜 饒平凡， 2009） 。 在 2001年，陳強(qiáng)通過對青枯菌的強(qiáng)、弱致病株系在色譜上的表征，探討青枯菌的致病機(jī)理，從細(xì)菌色譜方面提出了青枯菌致病模型。 陳萍以木糖氧化無色桿菌為研究對象，賴偉蘋以金黃色葡萄球菌為研究對象，探討了這兩種細(xì)菌整個生長周期的色譜行為、并分別研究了這兩種菌在離子交換樹脂上的吸附情況。 在這之后，陳昭華以大腸桿菌中的 血清型菌種以及腸出血性大腸桿菌中不同標(biāo)本來源的 7 為實驗對象，進(jìn)行 征，并從細(xì)菌 表面結(jié)構(gòu)與荷電性質(zhì)的角度去揭示細(xì)菌吸附于離子交換樹脂的本質(zhì)原因。 效液相色譜在 青枯雷爾氏菌 上的應(yīng)用 在 2000年，謝俊斌等人首次使用高效液相色譜對活的細(xì)菌進(jìn)行了分離。他們是利用強(qiáng)陰離子交換樹脂來對結(jié)構(gòu)完整且具有生理活性的細(xì)菌進(jìn)行了分離。與傳統(tǒng)的色譜方法不同，這一研究是以強(qiáng)陰離子交換樹脂為介質(zhì)，以完整的具有生物活性的細(xì)菌個體來進(jìn)行色譜表征。通過離子交換樹脂，他們成功的表征了不同細(xì)菌的色譜行為 。 成功地將木糖氧化無色桿菌、普通大腸桿菌、短小芽孢桿菌等不同屬的混合樣品在色譜上得到分離，從而確證了高效液相離 子交換色譜系統(tǒng)用于分離細(xì)菌這樣的大顆粒體系的可行性（ 謝俊斌， 2000） 。 研究發(fā)現(xiàn)，純培養(yǎng)的細(xì)菌在色譜上表現(xiàn)出單一的保留峰，且 不同細(xì)菌的特征峰是不同的 。在這一基礎(chǔ)上，隨后又進(jìn)行了一系列的研究包括對細(xì)菌進(jìn)行各種物理和化學(xué)的處理后的色譜行為。研究了細(xì)菌經(jīng)紫外照射、菌體脫毛處理以及甲醛滅活等處理后的色譜行為差異，驗證了高效液相色譜在反應(yīng)細(xì)菌差異的可行性 （ 賴偉萍， 2002） 。 在隨后的研究中，林娟等應(yīng)用高效液相色譜對青枯雷爾氏菌進(jìn)行分離。研究發(fā)現(xiàn)在色譜柱飽和的吸附范圍內(nèi)，青枯雷爾氏菌的純培養(yǎng)物經(jīng)色譜分離得到 3個明顯的 特征峰。然后收集各色譜峰的菌體，染色后鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高效液相色譜分離后，細(xì)胞仍然保持結(jié)構(gòu)的完整性，而且生理生化特征以及生化型均沒變化 （ 林娟 , 馬騁 , 劉樹滔， 2005） 。在此實驗基礎(chǔ)上，采用 個色譜峰的菌體，培養(yǎng) 48小時后測定其弱化指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這 3個特征峰的菌體的弱化指數(shù)不相同，而且在運(yùn)動性方面也有顯著的差異 （ 林娟，馬騁，劉樹滔，饒平凡， 2007） 。這一研究證明了高效液相色譜能夠分離青枯雷爾氏菌，能夠?qū)⑵浞譃椴煌膸讉€生理狀態(tài)。結(jié)合番茄感染實驗，在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)， 3個色譜峰的組分在 致病力方面有明顯的差異，大小分別是組分 3組分 2組分 1，這一結(jié)果為利用高效液相色譜法快速分析檢測青枯菌的致病強(qiáng)度奠定了基礎(chǔ) （ 林娟 , 馬騁 , 劉樹滔， 2007） 。 進(jìn)一步的研究表明，不同致病力的青枯雷爾氏菌的特征色譜是不同的。通過軟件對青枯雷爾氏菌的各色譜峰面積進(jìn)行積分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病力越強(qiáng)，組分 3的面積越大。弱致病力的青枯雷爾氏菌主要以峰 1和峰 2為主，強(qiáng)致病力的菌株只出現(xiàn)峰 3，從而呈現(xiàn)出 致病力越強(qiáng)，峰 3所占的面積比越大 這一規(guī)律 （ 林娟 , 馬騁 , 劉樹滔， 2006） 。 在一定的條件下，細(xì)菌是一個宏觀上帶電的 顆粒，組成細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)等）帶有羧基、磷酸基和氨基等基團(tuán)，在不同的 而使細(xì)菌表面帶有不同的電荷 （ 陳萍 , 李仁寬 , 徐小華， 2002） 。 細(xì)菌在離子交換過程中表現(xiàn)為 宏觀的兩性離子 ，當(dāng) 菌帶負(fù)電荷；當(dāng) 菌帶正電荷。由于細(xì)菌在不同的生理狀態(tài)下，其細(xì)胞表面的的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同，因而帶電性質(zhì)不同，與離子交換劑的吸附能力也不同，因此可以通過高效離子交換色譜進(jìn)行分離 (林娟 )， (馬騁 )， T(劉樹滔 )，F(xiàn)(饒平凡 ),2007)。 4 青枯病的防治研究進(jìn)展 目前對青枯病的防治主要采取化學(xué)防治、生物 防治和培育抗病品種等措施（ 徐進(jìn) ,馮潔 ,顧剛， 2008） 。 學(xué)防治 目前，研究普遍認(rèn)為化學(xué)防治青枯病的難度還很大，其中一個很重要的原因就是沒有專門的特效藥 （ 趙從新 ， 鄭宇峰 ,王順黨， 2009） 。實驗表明，普通的化學(xué)藥劑只能 延遲青枯病的發(fā)病時間，而且藥效隨著時間的延長逐漸降低。 常用的藥物比如青枯靈，在防治實驗中表現(xiàn)出了一定的效果。例如， 在防治旱地 茄子青枯病的田間實驗中， 50青枯靈可濕性粉劑噴藥約 6次，防效達(dá) 73以上 ，殘藥期長達(dá) 5個月以上 （ 覃新導(dǎo)羅養(yǎng)， 2000） 。常用的化學(xué)防治還有抗生素防治、植物生長調(diào)節(jié)劑及植物殺 (抑 )菌物質(zhì)的防治。常用的抗生素有鏈霉素、四環(huán)素和有效霉素等 （ 王舒寧， 2006） 。青枯菌對植物生長調(diào)節(jié)劑 3此可能是控制青枯病的有效藥劑 （ 郭堅華 ,孫平華， 1997） 。 目前普通的化學(xué)藥劑在青枯病在防治上主要應(yīng)用于預(yù)防性的植物材料以及土壤的預(yù)處理，很少用于直接治療。而且化學(xué)藥劑生產(chǎn)簡便，價格便宜見效快，在青枯病的防治中占有主要的支配地位。而且在大面積的發(fā)病時，化學(xué)藥劑稱為唯 一的選擇。但是長期使用容易造成環(huán)境污染，在實際使用中，應(yīng)注意選擇適量的劑量，盡量減少對環(huán)境的污染 (孫思，韋愛梅，伍慧雄，王軍， 2004)。 物防治 生物防治在青枯病上的應(yīng)用，目前的研究主要包括利用無致病力青枯菌、拮抗細(xì)菌、菌根真菌對病原菌進(jìn)行抑制，以及利用基因工程對有關(guān)植物進(jìn)行抗病轉(zhuǎn)化。無致病力菌株是 利用 病菌的近緣無致病力的種或菌系產(chǎn)生的細(xì)菌素來抑制致病菌的 (孫思，韋愛梅，伍慧雄，王軍， 2004)。 無致病力菌株最早成功的應(yīng)用于病害防治的例子是用放射形土壤桿菌(4菌株防治由根癌土壤桿菌 ( A 起的桃樹冠癭病。 用無致病力產(chǎn)細(xì)菌素的青枯菌 (2現(xiàn)用產(chǎn)細(xì)菌 素的菌懸液預(yù)處理煙草比川不產(chǎn)細(xì)菌素的菌懸液處理能更有效的防治青枯病 （ E 1984） 。 陳慶河等 用紫外誘變法獲得的靑枯無致病力菌株 種于番茄植株上，進(jìn)行盆栽試驗，結(jié)果表明，經(jīng)過處理后，番茄的發(fā)病時間分別推遲了 9天和 7天， 20天后的防效達(dá)到 在田間試驗結(jié)果表 明，經(jīng)過浸根處理， 15天后對青枯病的防效分別達(dá)到 陳慶河 ,翁啟勇 ,胡方平， 2003） 。 們在同一植株上同時接種無毒突變體菌和致病菌。無毒突變體菌能在一定程度上抑制了致病茵的繁殖 （ ， 1990） 。 康耀衛(wèi)等研究發(fā)現(xiàn)將青枯菌無毒突變株 致其體內(nèi)過氧化物酶的活性增強(qiáng)，從而引起花生對毒性菌株的抗病性，表現(xiàn)為接種植株的葉片組織粗提液對致病力菌株 有很強(qiáng)烈的體外抗菌作用，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，將這種粗提液與致病菌株同時注入花生葉片內(nèi)，也表現(xiàn)出了抑制發(fā)病的作用，而且這種抑制作用隨著粗提液濃度的下降而減弱 （ 康擢 何禮遠(yuǎn)， 1994） 。 拮抗細(xì)菌是從根際十壤中稀釋分離得到的有益的微生物。日前，已報道的用于防治青枯病的拮抗細(xì)菌主要包括芽孢桿菌屬 (假單胞桿菌屬(鏈霉菌屬 (。芽孢桿菌是拮抗細(xì)菌研究中的重點(diǎn)，主要原因是芽孢桿菌易于分離，分布廣，防治效果好。 羅寬等從煙草根際和 根表土壤等分離鑒定了七株抗青枯病生防菌，并用其中三株 (一株屬不動桿菌屬，兩株屬芽孢桿菌屬 )進(jìn)行了抑制煙草青枯病的試驗，并初步研究了抗菌物質(zhì)的理化性質(zhì)。結(jié)果表明拮抗菌株對多個煙草青枯病菌株有廣譜性抑制作用，但效果有一定著異。 關(guān)于芽孢桿菌的防病機(jī)理，一些學(xué)者進(jìn)行了一系列的研究。 邱清華等的試驗表明其抗菌物質(zhì)可能為蛋白質(zhì)性質(zhì)的物質(zhì)。楊合同等人通過使用巨大芽孢桿菌菌株 明 邱清華姬廣海，魏蘭芳， 2002） 。魏春妹等人研究 與分析了 90枯病的作用機(jī)理。實驗結(jié)果表明 90根部聚集并且向根組織內(nèi)部滲透，進(jìn)而從植株根部轉(zhuǎn)移到莖和葉組織內(nèi)部繁殖，強(qiáng)烈抑制青枯病病菌的繁殖和生長， 而且還起著催芽和壯苗的作用，與植株建立互利的關(guān)系 （魏春妹，張春 明 ，劉宗鎮(zhèn)， 1994） 。 近些年來，分子生物學(xué)的新技術(shù)的迅速發(fā)展為青枯病的防治提供了一些新的途徑。通過轉(zhuǎn)座子等手段誘變得到生防菌是常用的技術(shù)?？狄l(wèi)等采用轉(zhuǎn)座子 ，該突變體在缺失了許多胞外蛋白外輸出功能后，從而失去了對寄主的致病能力；進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)，突變體 0天后仍可從根部分離，定殖能力很強(qiáng)；溫室內(nèi)接種 20天仍具有防治效果，但田間試驗效果有所下降，需要進(jìn)一步的改造 （ 康耀 衛(wèi)， 毛 國 璋， 呂 常勝， 1995） 。張景寧將產(chǎn)生柞蠶殺菌肽 而獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在將青枯雷爾氏菌接種于該植株后，存活率明顯的得到提高，而且發(fā)病較慢，該研究表明轉(zhuǎn)基因桉樹提高了其對青枯病的抗病力 （ 張景寧，張清杰、姨自然， 1995） 。 目前，普通化學(xué)藥劑對青枯病在防治主要用 于預(yù)防性的植物材料前處理及土壤的預(yù)處理，很少直接用于治療。但化學(xué)藥劑因其具有生產(chǎn)簡便，價格便宜，特別是見效快等優(yōu)點(diǎn)，因此仍然在青枯病的防治中占有主要地位，因而得到了廣泛的應(yīng)用。但在實際的使用過程中，應(yīng)該選擇適當(dāng)?shù)乃巹?，盡量減少其副作用，降低對環(huán)境的污染?？股丶爸参锛に氐戎苿?。既有普通化學(xué)藥的優(yōu)勢。又兼有生物防治的特點(diǎn)。是很有希望的一類藥劑。但還需要不斷地篩選和研究。并解決病原菌抗藥性的問題。生物防治的方法目前還都處于實驗階段。進(jìn)入實際生產(chǎn)的很少。利用無致病力青枯菌菌株、拮抗細(xì)菌、菌根真菌等方法對青枯病都能 在一定程度上起到一定的防治效果，但是在田間條件下的防治效果卻不太穩(wěn)定。如何針對不同的植物，篩選理想有益的的生防菌在田間使用，以有效控制青枯病的發(fā)生和流行，有待進(jìn)一步研究。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為青枯病的防治開辟了新的途徑，雖然利利用基因工程