密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 虎杖白藜蘆醇合 酶基因的克隆與表達 of of 摘 要 白藜蘆醇（ 3,45稱 一種天然存在的多酚化合物。已經發(fā)現(xiàn)花生、葡萄、虎杖等植物中含有 白藜蘆醇 。據(jù)報道， 白藜蘆醇 有著廣泛的生物學和藥理學特性，如抗癌、抗炎癥、心 血管保護等作用。 白藜蘆醇 在植物保護中也發(fā)揮著重要作用。 白藜蘆醇合酶 （ 芪類（ 質合成的關鍵酶 ,催化一分子 豆酰 三分子 二酰 成 白藜蘆醇 。 酸 代謝途徑，是控制植物次生代謝產物合成途徑中重要的分支點的酶之一。苯丙酰代謝途徑幾乎存在于所有植物中，而 存在于少數(shù)有 植物中，大多數(shù)重要的作物都缺乏該基因，因此將 因 轉入無 植物 ,可以為該植物提供增強抗真菌侵染的防御體系或增強植物抗逆境脅迫的能力，還能提高一些作物的品質。 本研究利用 ，從藥用植物虎杖（ 克隆到了 全長 們將它命名為 從虎杖基因組 克隆到了一個具有全長編碼區(qū)的 因序列和一個比全長編碼區(qū)少了 72 因（ 列以及一個含有兩個內含子的 因序列。將來自花生 ( 因 (來自虎杖的 核表達時發(fā)現(xiàn)， 因與 能正常表達成蛋白，而因在誘導表達時，卻未能檢測到相應蛋白。植物表達時，用上述三個基因替換掉了面的 因，從而構建了三個植物表達載體 用農桿菌介導法導入煙草品種 經 測表明，目標基因已經轉入煙草 ，且在 水平得到了表達 。但通過 藜蘆醇 。 關鍵詞 ：虎杖 ， 白藜蘆醇合酶 ， 轉基因煙草 is a in It is it a of as It is to be a to of in to in of of of of is in is in S. S be to by S in In A RS . A S a a 72 bp as a NA 1 in in in be no be to In in by US in in no be 錄 第一章 綜 述 . 1 白藜蘆醇 . 1 生化特性及其在植物中的分布與存在形式 . 1 生物合成途徑 . 1 作為植物雌激素而起到預防癌癥的作用 . 2 調節(jié)癌癥第一、二階段的酶 . 3 保護心血管系統(tǒng) . 3 白藜蘆醇與炎癥 . 4 藜蘆醇合酶 . 5 白藜蘆醇合酶 的酶學性質 . 5 白藜蘆醇合酶 與查爾酮合 酶 . 5 白藜蘆醇合酶 基因的誘導表達 . 6 白藜蘆醇合酶 基因的轉基因研究 . 6 第二章 材料與方法 . 8 材料 . 8 方法 . 9 基本的實驗方法 . 9 提取 （ 結合酸酚、高鹽溶液與 . 9 一條鏈的合成 . 9 克隆全長基因 . 10 司的 體亞克隆 . 11 百泰克公司質粒提取試劑盒 . 11 百泰克公司 段的回收 . 12 粘末端 進行基因克隆 . 12 導表達 . 13 蛋白的提取 . 13 鎳柱純化目標蛋白 . 13 蛋白濃縮及分子篩純化 . 14 泳 . 14 虎杖基因組 提取 . 14 農桿菌感受態(tài)細胞的制備： . 15 農桿菌感受態(tài)細胞的轉化： . 15 含目的基因的農桿菌的鑒定 . 15 根癌農桿菌介導 化煙草 . 15 提取煙草 . 15 9 用 理所提取的 . 16 白藜蘆醇的提取 . 16 色譜分析 . 16 第三章 結果與分析 . 17 虎杖 因全長 克隆與測序分析 . 17 法克隆虎杖 因同源片斷 . 17 克 隆虎杖 因的 3末端 ： . 18 法克隆基因 5末端 . 19 全長序列 . 19 與來自花生、葡萄、蓼科大黃屬的 因以及查爾酮 查爾酮合酶 基因進行蛋白序列比對 . 22 虎杖基因組 白藜蘆醇合酶基因同源序列的克隆與 分析 . 24 擴增起始密碼子與終止密碼子之間的序列 . 24 從虎杖基因組 克隆到比全長編碼區(qū)缺失了 72序列 . 25 從虎杖基因組 克隆到了含有全長編碼區(qū)的序列 . 28 從虎杖基因組 克隆到含有兩個內含子的序列 . 29 因的原核表達 . 30 將 個基因克隆到 . 30 進行誘導表達、純化與鑒定 . 33 白藜蘆醇合酶 基因的植物表達 . 34 利用 T 載體 行亞克隆 . 34 植物表達載體的構建 . 35 煙草的遺傳轉化 . 37 檢測轉基因煙草植株 . 38 檢測轉基因煙草植株 . 39 檢測轉基因煙草中白藜蘆醇的含量 . 40 討論 . 41 第四章 結論 . 42 基因克隆 . 42 原核表達 . 42 植物表達 . 42 參考文獻 . 43 致謝 . 48 作者簡歷 . 49 V 英文縮略表 縮略詞 中文全稱 英文全稱 落酸 芐青霉素 6b 羧芐青霉素 椰菜花葉病毒 35S 啟動子 5S 六烷基三己基溴化銨 ,4,4 一二氯苯氧 乙酸 2,4碳酸二乙酯 硫蘇糖醇 B 溴化乙錠 二胺四乙酸二鈉 葡萄糖醛酸糖苷酶 丙基硫代 那 霉素 N 激動素 E 巰基乙醇 乙酸 酸鈉 合酶鏈式反應 端快速擴增 of 福平 轉錄聚合酶鏈式反應 二烷基磺酸鈉 羥甲基氨基甲烷 B 菌培養(yǎng)基 43吲哚 - 5國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 綜述 1 第一章 綜 述 藜蘆醇 化特性及其在植物中的分布與存在形式 白藜蘆醇 （ 稱 是一種植物次生代謝產物， 分子式為 對分子質量為 228 25，為無色針狀結晶，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、二甲亞砜等，有順、反兩種構型，其中反式是穩(wěn)定結構 （見圖一） ，而且生物活性更加廣泛，結構式見圖一 (胡賧 等， 2005)。 它能保護植物免受病原微生物和草食動物的侵害，是一種植保素 （ 994） 。 它是 1940年首次從毛葉藜蘆 (根部 獲得的（ 2005）。 白藜蘆醇 存在于葡萄 、花生、藜蘆、決明子和等天然植物中，到目前為止至少已在 21科、 31屬的 72種植物中發(fā)現(xiàn)了 白藜蘆醇 （ 1997） 。 在一些藥用植物中含量較高，尤其是蓼科植物虎杖 白藜蘆醇 的含量比花生和葡萄高很多 （ 曹庸 等， 2003） 。 白藜蘆醇 常被發(fā)現(xiàn)以糖苷（ 3,5,4 - D- 形式存在，見圖二（ 2005）。 隆到了一種能將 白藜蘆醇糖苷 轉變成白藜蘆醇的酶，命名為 D - 它水解 -（ 13 ） 2006） 。 圖一 反式白藜蘆醇 二 白藜蘆醇糖苷的順反兩種構型 生物合成 途徑 在植物中， 白藜蘆醇 是由一分子的香 豆酰 三分子丙二酰 白藜蘆醇合酶 (化形成的。 第一章 綜述 2 應 (et 992),它的催化步驟如圖三所示 (et 999)。 1994)已從葡萄中分離出 白藜蘆醇 生物合成途徑中的相關酶基因 ,白藜蘆醇 的生物合成途徑如圖四所示。 圖三 化的反應步驟 S 圖四 白藜蘆醇 的生物合成途徑 of 44oA 作為植物雌激素而起到預防癌癥的作用 隨著年齡的增長而引起的雌激素和雄性激素的減少會導致組織和器官功能的失調 ，然而， 不平衡的荷爾蒙刺激可能使得細胞增殖超過分化和衰亡 ，因而增加了發(fā) 生癌癥的風險。因此，激素依賴的腫瘤（乳房和前列腺，或其他的如肺）可以通過日常攝入恰當量的選擇性雌激素受體調節(jié)物來阻止其發(fā)生，這些復合物表現(xiàn)出了不同程度的對雌激素的競爭與拮抗作用，雌激素受體的靶標基因表達和其他相關細胞內應答依賴于細胞周期（ 2003） 。幾種多酚化合物在結構上極像雌激素，例如植物雌激素類黃酮 999） 。西方國家婦女乳腺癌發(fā)生率比亞洲國家高六倍，因為亞洲國家婦女們常食用富含植物雌激素的豆 類產品，表明，植物雌激素可作為一種癌癥的化學預防藥（ 2002） 。多酚化合物 白藜蘆醇 可以被看作是可以食用的植物雌激素，它對于雌激素受體表達或不表達的人類腫瘤具有非常好的效果。 白藜蘆醇 的化學結構像合成的雌激素 白藜蘆醇 屬于一型雌激素（ 003） 。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 綜述 3 節(jié)癌癥第一、二階段的酶 癌癥的起始是多個事件的結果。刺激因子（如激素、細胞因子）、壓力調節(jié)因子（ 炎癥氧自由基 ）的組合作用以及外源入侵物（病毒、輻射和異型生物質復合物）都能影響細胞增殖的 控制從而導致組織的腫瘤化（ 2005）。 異型生物質（致癌物和藥物）常常是很容易進入細胞的脂溶性物質。為了防止它們的毒害作用，細胞常通過所謂的生物轉化的處理過程使它們變得更親水、容易排泄。這個過程包括第一階段的酶的氧化作用和通過第二階段的酶連接上極性基團，然而這種處理容易導致高反應活性的氧自由基和其他容易與 而使前致癌物變成了致癌物（ 997）。 這個氧化階段包括了一些膜結合酶（例如細胞色素 ,它們利用氧分子引入氧原子。第二 個階段通過轉移酶進行，它們加入親水基團或者改變分子的氧化還原狀態(tài)（如谷胱苷肽 轉移酶， 苯醌氧化還原酶）（ ， 2003， 2004）?；瘜W防治策略包括第一階段負責激活異質型生物的酶的抑制和第二階段酶的誘導，它們能聯(lián)合已經激活的復合物成為內源配基（如谷胱苷肽）。 白藜蘆醇 是種外源的脂溶性的復合物，能跨過質膜，進行細胞代謝的，而且它可能與第一階段的酶相互作用。在體外白藜蘆醇抑制人重組的 450（ ,2003） 。進一步的研 究表明，在鼠表皮中， 白藜蘆醇 也能誘導第二階段的酶（如 )H:苯醌氧化還原酶） (， 2004)。這些數(shù)據(jù)都增強了 白藜蘆醇 可以用于癌癥的化學預防這一假說。 護心血管系統(tǒng) 白藜蘆醇 對心血管系統(tǒng)的保護作用源于它能夠引起血管舒張（通過調節(jié)一氧化氮合成酶）、抑制前列腺素的產生（通過調節(jié)環(huán)氧合酶）以及具有抑制血小板凝聚、抑制低密度脂蛋白氧化、抗炎癥、清除自由基等作用。 已知一氧化氮有血管舒張?zhí)匦?，它能抑制血小板黏附聚集，而且能抑制粘連分子的表達，而且它能抑制 細胞生長和轉移（ 1997； 1989； 1991； 996）。很明顯，一氧化氮和 白藜蘆醇 享有一樣的靶標。一氧化氮合成酶世含有亞鐵血紅素的單氧化酶，有一個還原酶區(qū)域和一個氧化酶區(qū)域。內皮、神經元、線粒體的一氧化氮合成酶的組成型異構體能提供低細胞內濃度的半壽期短且自由基一氧化氮。一種一氧化氮合成酶的可誘導形式，在發(fā)生炎癥時可以在轉錄水平激活，提供高濃度的一氧化氮（ 2005）。 白藜蘆醇 可能通過削弱血管生成的進程來支持抗癌活性。已知這種復合 物能抑制內表皮細胞的轉移、血管的形成從而阻斷氧自由基的形成以及相關的 2003）。以為摩爾范圍內的 白藜蘆醇 進行處理，能通過促進一氧化氮的釋放來誘導血管平滑肌細胞的松弛，而這能被一氧化氮合成酶的抑制物所逆轉（ ， 2002）。 白藜蘆醇 首先被發(fā)現(xiàn)在根部能抑制環(huán)氧化酶（ 活性，環(huán)氧合酶催化前列腺素生物合成的首個步驟 (底物是花生四稀酸 )。已知前列腺素是細胞增殖和血管生長的刺激物，免疫監(jiān)視的抑制因子（ ， 2004）。在體外， 白藜蘆 醇 非競爭地抑制環(huán)氧合酶和氫過氧化物酶 ， 1997;， 2004）。 白藜蘆醇 的這種雙效性是唯一的，因為典型的非中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 綜述 4 類固醇抗炎癥藥物（ 影響 1971； 003)。除了組成型的 種可誘導形式的 炎 癥藥物 和有絲分裂刺激所誘導（ ， 2003）。 既然 ， 1995； ， 1997）。所以盯住 天然的抗氧化劑，如維生素和多酚化合物，在預防跟自由基相關的疾病中起著重要的作用。白藜蘆醇 的抗氧化能力可能跟它能阻止動脈硬化有關，因為低密度脂蛋白的氧化是 動脈 硬化發(fā)生中的一個重要事件。 在胡蘿卜素的乙醇溶液中， 白藜蘆醇 能非常有效地清除羥基（氫氧基）（ ， 2003）。 白藜蘆醇 對于巨噬細胞（受到脂多糖和佛波醇酯刺激）產生的超氧自由基（ 能明顯減少化生四稀酸的釋放（由脂多 糖或佛波醇酯誘導、或通過暴露于 2）（ ， 2000）。有人對 白藜蘆醇 的抗氧化能力進行過評估，發(fā)現(xiàn)它能阻止微粒體中 誘導的脂質過氧化；也能阻止 誘導的低密度脂蛋白的氧化（ ， 1997） ;還能抑制鐵離子或紫外照射所催化的鼠肝臟微粒體中的脂質過氧化( 4.8 , （ ， 2000） 。最近有人在酵母 白藜蘆醇 的抗氧化效果進行了評價，發(fā)現(xiàn)跟維生素 C、維生素 E、丙基末食子酸鹽相比， 白藜蘆醇 有更高的清除 ， 1999；， 1998） 。 藜蘆醇與炎癥 炎癥的發(fā)展是由前列腺素所介導的，對前列腺素的抑制作用可以部分解釋 白藜蘆醇 的化學預防和保護心血管效果。已經有研究表明， 白藜蘆醇 能劑量依賴地抑制人外周血白細胞中 ， 2005）。活體實驗中， 白藜蘆醇 能明顯降低已經升高的 2004）。在體外 或活體模型中， 白藜蘆醇 也能降低環(huán)氧合酶 2的表達，環(huán)氧合酶 2能被炎癥所誘導，它催化前列腺素的產生（ ， 2005； 2004）。 白藜蘆醇 還被觀察到，能降低誘導型環(huán)氧合酶 2的活性（經由信號轉導途徑抑制這種酶的表達）（ ， 1998；， 2004； 2004） 白藜蘆醇 也能抑制細胞因子的炎癥作用，如腫瘤壞死因子（ 白細胞介素 ， 1999； ， 2003）。核因子 是一種轉錄因子，調控基因參與炎癥與腫瘤發(fā)生（ ， 1997） 。抑制 核因子 是 白藜蘆醇 展現(xiàn)出抗腫瘤活性的可能機制。已經在幾類細胞株中觀察到， 白藜蘆醇 抑制了腫瘤壞死因子誘導的核因子 的激活（ ， 2000； ， 2002） 。最近研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制 核因子 的表達以及抑制由 核因子 調控的兩個酶（環(huán)氧合酶 2和基質金屬蛋白酶）的表達， 白藜蘆醇 能減少誘發(fā)乳腺癌，各種腫瘤、廣大癌癥在雌性 潛伏（ ， 2002） 。 白藜蘆醇 抑制核因子 活化的確切機制仍然不清楚。 2000)的研究確定， 白藜蘆醇 能夠抑制腫瘤壞死因子 的活化，是通過防止磷酸化和， 2000）。通過阻斷核因子 活性， 白藜蘆醇 也表現(xiàn)出對核因子 活性的阻斷（ ， 2000） 。 第一章 綜述 5 以結合無活性的 。在激活時， B， 并降解它，從而容許 核因子 遷移到核。 白藜蘆醇 抑制上游的一個信號成分（ ， 2000） 。 藜蘆醇合酶 藜蘆醇合酶 的酶學性質 C 被稱為 3,5,4 是芪合酶 (稱 的一類。 et 995),分子量為 90 000 等電點為 984;991)。芪合酶（ 芪類物質合成的關鍵酶，這類酶催化合成其它酶作用底物的骨干分子。蛋白質交叉結合和定點突變分析證明 ,58個氨基酸殘基 ,接近于酶的活性位點 個亞單位均可進行三步縮合反應 ,同時異源二聚物的亞單位缺失補充實驗證明 ,兩個亞單位在產物形成過程中是協(xié)同合作的 ,但還不能確定這種協(xié)同作用是發(fā)生在酶 et 995;991)。 984 ）。 992)利用定點突變技術研究了酶活性位點半胱氨酸 將 果酶對受試三種底物的活性均喪失 ,而藜蘆醇合酶 對 4的活性 ,動力學分析證明其與對照相比 倍 ,從而使得該酶從 白藜蘆醇 形成型轉化為二氫赤松素形成型。2001)改變 白藜蘆醇合酶 的底物，研究了 白藜蘆醇合酶 合成其他新型聚酮化合物的能力 ,結果顯示很微小的化學修飾就可引導 白藜蘆醇合酶 催化反應形成一系列不同的新產物。 藜蘆醇合酶 與查爾酮合 酶 白藜蘆醇合酶 和 查爾酮合酶 是植物體中 白藜蘆醇合酶 和 查爾酮合酶 的序列比較分析顯示兩種基因是相互關聯(lián)的但不是完全相同，兩者在 蛋白質水平是高度同源的