學(xué)校代號 10532 學(xué) 號 分 類 號 密 級 博士學(xué)位論文 基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 學(xué)位申請人姓名 劉斯佳 培 養(yǎng) 單 位 化學(xué)化工學(xué)院 導(dǎo)師姓名及職稱 蔣健暉 教授 學(xué) 科 專 業(yè) 分析化學(xué) 研 究 方 向 生物傳感 論文提交日期 2013 年 12 月 學(xué)校代號 ： 10532 學(xué) 號 ： 級 ： 湖南大學(xué)博士學(xué)位論文 基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 學(xué)位申請人姓名： 劉斯佳 導(dǎo)師姓名及職稱： 蔣健暉 教授 培養(yǎng)單位： 化學(xué)化工學(xué)院 專業(yè)名稱： 分析化學(xué) 論文提交日期： 2013年 12月 論文答辯日期： 2013年 12月 答辯委員會主席： 陳金華 教授 (2005 A in of in 2013 博士學(xué)位論文 摘 要 生物傳感是基于生物分子識 別及其下游信號轉(zhuǎn)換， 進行目標(biāo)物檢測的一類分析方法，是分析化學(xué)與生命 科學(xué)的交叉研究領(lǐng)域。比較其它分析方法，它有著不少的優(yōu)勢，特別是提高了分析速度和應(yīng)用 靈活性。隨著電子、微電子和機械系統(tǒng)的進步，便攜式、集成式傳感元件的開發(fā) ，生物傳感方法研究有機會為醫(yī)療、環(huán)境保護、食品安全乃至公共 安全等領(lǐng)域提供更多現(xiàn)場快 速檢測技術(shù)，為公共健康與公共安全建立第一道防線。近年來，納 米材料領(lǐng)域的研究不斷突破，核酸識別、核酸信號放大新技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，為構(gòu)建 高靈敏、高選擇性、快速高效的新型生物傳感器提供了更完美的設(shè)計思路， 為生物傳感器實現(xiàn)不同 分析靶標(biāo)的現(xiàn)場快速檢測提供了更有力的平臺。本論文則基于當(dāng)前熱點納米材料 納米材料發(fā)展了三個頗具醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用前景的生物傳感器， 其中有細(xì)胞信號通路重要蛋白酶 的檢測，活細(xì)胞及亞細(xì)胞器 的示蹤。首次報道非氧化石墨烯通過非共價生物功能化應(yīng)用于生物傳感器， 也是首次展示利用無毒納米材料對細(xì)胞能量工廠 時涉及其中的納米材料- 非氧化石墨烯、硅量子點、碳量子點的 生物功能化研究都各自有小小突破，為它們在生物傳感領(lǐng)域的進一步 發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。本論文還基于核酸雜交技術(shù)和金屬離子介導(dǎo)的核酸偽雜交技術(shù)分別發(fā)展了針對生物體重要的癌癥標(biāo)記物 環(huán)境污染物 且對這兩種靶標(biāo)都實現(xiàn)了高靈敏高選擇性的分析。所有研究具體內(nèi)容如下所述： 為了進一步拓寬非氧化石墨烯在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用， 在 第 2 章 中發(fā)展了一種新穎的雙層磷脂膜修飾的非氧 化石墨烯復(fù)合納米材料，它是通過非氧化石墨烯大面積雙面芳香環(huán)層和已合成的脂質(zhì)體疏水烷烴夾層利用范德華力和疏水作用力形成的，并且這種非共價組裝過程不會破 壞石墨烯片層的電子大共軛結(jié)構(gòu)，使得該復(fù)合納米材料保留了非氧化 石墨烯卓越的電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)， 而表面修飾的磷脂膜層則能賦予非氧化石墨烯良好的生物相容性、親水 性以及表面可控修飾性，為石墨烯的生物功能化提供 了一個新的實用平臺， 該復(fù)合納米材料由磷脂雙分子層和疏水的還原石墨烯片組成，類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，通過利用熒光素標(biāo)記的磷脂摻雜在復(fù)合納米材料中，發(fā) 展出了一個檢測磷脂酶 D 活性的熒光生物傳感器。該生物傳感器具有高靈敏和寬檢測范圍的特性，其檢測下限低至 ，優(yōu)于以往報道的磷脂酶 D 分析方法，而且基于該分析 模式是一步均相法，該生物傳感器有極好的適應(yīng)性，操作簡易性，以及進一步實現(xiàn)高通量 分析和實時監(jiān)測反應(yīng)動力學(xué)的可能。 于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 近年來，硅納米材料憑借它 出色的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)性 質(zhì)，以及表面可控修飾，可適應(yīng)硅材料作為半導(dǎo)體材料的特殊應(yīng) 用吸引科學(xué)家們的 關(guān)注，尤其是零維硅納米材料 于硅材料本身無毒、化學(xué)惰性、生物相容性極好，非常適合生物傳感方法研究，特別是生物成像領(lǐng)域。在第 3章 中我們首先將電化學(xué)刻蝕法合成的硅點用雙氧水氧化鈍化，再用硅烷化試劑 在有機相中進一步老化，轉(zhuǎn)入水相后通過碳二亞胺 /硫代琥珀酰亞胺法（進行表面水溶性改性獲得最終的硅量子點， 該硅量子點具有優(yōu)良的水分散性，強熒光性（量子產(chǎn)率 30%），合適的尺寸（約 4 非常適合作為熒光成像探針。此方法合成的硅點表面保留了一定數(shù)目的伯胺基團，可 以被進一步功能化。研究中我們分別選用線粒體定位試劑三苯基膦和溶酶體定位試劑嗎啉通過 并通過雙光子熒光共聚焦成像證明其示蹤效果，實驗結(jié)果證明，通過和商品化的有機染料對比，硅量子點能準(zhǔn)確、快速（約 15 亞細(xì)胞器線粒體和溶酶體進行定位，且成像效果不遜于有機染料探針，此外線粒體會在細(xì)胞凋亡初期腫脹變圓，通過誘導(dǎo)劑引發(fā)細(xì)胞 開始凋亡，實時成 像圖顯示了我們合成的功能化硅量子點能很好的表現(xiàn)出線粒體形狀變化，進行細(xì)胞早期凋亡的示蹤，表明所得的硅量子點是 有潛質(zhì)的生物成像探針。 不光是石墨烯，碳納米材料本身優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)性質(zhì) 和無毒、化學(xué)惰性、容易代謝等特性促使科學(xué)家 們不斷開發(fā)其在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。為了拓寬熒光碳納米材料在生物成像領(lǐng)域的發(fā)展空間，在第 4章 中我們合成了一個雙層脂質(zhì)體共價修飾的新型碳量子點， 因為傳統(tǒng)一步法合成出的碳 點往往光學(xué)性質(zhì)差強人意（量子產(chǎn)率通常低于 3%），很多相關(guān)研究都著力于表面改性提高量子產(chǎn)率，例如通過氨基修飾的低聚 子量約 1500）進行表面鈍化處理，實現(xiàn)光學(xué)性能提高（量子產(chǎn)率約 10%），而我們則嘗試用相似分子 量的磷脂代替氨基修飾的低聚 先通過傳統(tǒng)的 硝酸回流法合成出碳點前體，再通過超濾裝置篩選出所需顆粒大?。ㄐ∮?0 ，同時合成好雙分子層脂質(zhì)體。利用碳二亞胺 /硫代琥珀酰亞胺法將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺的氨基末端和碳點表面因氧化產(chǎn)生的羧基官能團 交聯(lián)獲得最終的碳量子點， 該碳點熒光強度比同濃度的前體碳點高3 倍，尺寸約 5 面包裹的脂質(zhì)體雙分子 層能賦予碳點優(yōu)異的生物相容性和表面可控修飾性。我們 進一步探索了碳點在 頸癌）細(xì)胞中的雙光子熒光共聚焦成像效果，實驗證明 碳點在細(xì)胞各個位置都有分布，說明該方法合成的碳點非常適合 生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用。 汞是高毒的環(huán)境污染物，尤其是其具有高遷移性、持久 性、甲基化作用性 、生物富集性及食物鏈放大性 等特點，即便是極微量的存 在于環(huán)境中，對動植物及人類的健康也是極大的威脅。在 第 5章 中我們設(shè)計了一個非常新穎的，基于高靈敏性、高選擇性的檢測 電化學(xué)傳感器。這士學(xué)位論文 項技術(shù)的設(shè)計思路是鄰近的聚 T 導(dǎo)條件下產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)。先是在金電極表面，通過價鍵，有序地組裝上一層由8 個堿基組成的全T 該探針末端標(biāo)記了電活性物質(zhì)二茂鐵，當(dāng)沒有 在時，電極表面的聚 T 茂鐵離金表面很近，電子發(fā)生傳遞，可檢測到二茂鐵的氧化還原電流；當(dāng) 在條件下，最相鄰的聚 T 即電極表面的探針構(gòu)象在 導(dǎo)的 性的類似雙鏈的結(jié)構(gòu)，這個構(gòu)象變換導(dǎo)致了二茂鐵遠(yuǎn)離電極表面，電子傳遞受阻，檢測到的氧化還原電流大大減弱。 通過電化學(xué)信號的變化可以判斷 存在及定量分析。這個檢測機理已經(jīng)得到毛細(xì)管電泳及一系列電化學(xué)方法的充分驗證， 并且實驗結(jié)果表明這個傳感器能在1 M 之間高靈敏檢測 檢測下限能到達 0.5 于本文中介紹的其它檢測方法， 并且這項技術(shù)表現(xiàn)出了優(yōu)異的選擇性，這是和傳統(tǒng)的電化學(xué)方法（陽極溶出分析法 測 大的區(qū)別，而且這個 感器所需試劑非常少、操作步驟 很簡單又有著極好的再生性。如此經(jīng)濟高效的電化學(xué)傳感器在實時現(xiàn)場監(jiān)測環(huán)境中 有很好的應(yīng)用前景。 生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控功能，不僅對細(xì)胞的生長、分化和凋亡有著重要的影響，而 且還與許多疾病有著密切的關(guān)系，研究者發(fā)現(xiàn)在白血病、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和心血管障礙等疾病中，相關(guān)的 于有核酸序列短、含量少以及相互之間序列相似性等特點，分析測試有一定的挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的 檢測方法有印記雜交技術(shù)、微陣列檢測技術(shù)、基于號放大的檢測技術(shù)、陽離子聚合物等。本論文第 6章 中將向大家報道一種基于雙重侵 入式信號放大技術(shù)（ 靈敏高選擇性檢測有研究小組基于侵 入式信號放大技術(shù)檢測 是都是將目標(biāo) 相似序列的 們則是將 且 們借鑒缺口連接原理，設(shè)計出 端距侵入位點數(shù)個核苷酸距離。當(dāng)加入嗜熱性 相應(yīng)的核苷三磷酸，完全匹配的 端開始聚合延伸， 當(dāng)聚合延伸到達信號探針和模板探針雜交區(qū)的第一對核苷酸（即侵 入位點），將距信號探針侵入位點核苷酸和后一位（靠近 3端）的核苷酸之間磷酸骨架斷開，信號探針5 翹起一段離開，另一段也因雜交序列變短，與模板雜交穩(wěn)定性減弱并脫 離模板，遂成為第二重循環(huán)放大的引物探針。第二重循環(huán)放大類似第 一重循環(huán)，也是需 要借助聚合的作用才能形成侵入式結(jié)構(gòu)，進一步消弱了非特異 性切刻作用，第 二重循環(huán)的信號探針是 5標(biāo)記熒光團熒光素，中間 標(biāo)記淬滅基團的 侵入式結(jié)構(gòu)形成，信號探針 5翹起并帶有熒光素修飾的“翼”離開，和信號探針中間標(biāo)記的淬滅基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 團分開，熒光信號增強，并且與靶序列濃度成正比。實驗結(jié)果證明，該方法可以一步實現(xiàn)兩重循環(huán)放 大，檢測靈敏度高，下限可達 10 ，尤其是能區(qū)分相似的 現(xiàn)了難得的 關(guān)鍵詞：生物傳感器；納米材料；核酸；非氧化石墨烯 ；硅量子點；碳量子點；汞（離子；小 博士學(xué)位論文 is on of a of to is to of it to of in of to to of of In to in of of as to a is on of an Its by of to of of At of a a in of is on of of to to a of as In to of I 基于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 We a be a of is to a of a in a of By a in a is of . is to , of it as as to In a of as as of as an in in of In , we a 0%), In be by in to to of to 士學(xué)位論文 a of be to In we to to 5 of in of in or an to to of in a of in of a a of of in a of As in of is to of in of to an , we a of in of as as in %). of in to to of 0%) by 500). On of 于納米材料和核酸探針的生物傳感方法研究 we 0 by a of EG of in to DC a at We of in As a in a in in of is of of of a in is a , we a T to . of in on of In a of a of to c a of a g2+in a .0 nM M, a .5 g2+a of 士學(xué)位論文 to In be It in g2+a