DHPLC變性高效液相色譜在突變基因中的應(yīng)用,1.神馬是液相色譜,液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用,神馬是高效液相色譜,高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相。,液相色譜法原理,分離原理是：溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。,HPLC的極性分離類(lèi)型,液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜(NP-HPLC)采用極性固定相，流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等）。反相色譜(RP-HPLC)重點(diǎn)采用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。比如高通量篩選DNA序列變異。,反向液相色譜流篩選基因變異流程程圖,輸液泵,進(jìn)樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測(cè)器,溶劑,數(shù)據(jù)處理,溶劑,DNA:非極性物質(zhì)色譜柱:非極性溶劑:極性水/甲醇/乙腈,柱塞往復(fù)泵,手動(dòng)進(jìn)樣器,獨(dú)特的DNA色譜柱DNASep柱,當(dāng)DNA片段遇見(jiàn)PS-DVB和TEAA,雜合子個(gè)體的DNA經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生雜合二倍體,它與純合子個(gè)體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配的純合二倍體的解鏈特征不同,在部分加熱變性的條件下,通過(guò)雜合與純合二倍體于柱中的保留時(shí)間差異,而發(fā)現(xiàn)DNA的突變。當(dāng)柱溫升高使DNA片段開(kāi)始變性,則部分變性的DNA可被較低濃度的乙腈洗脫下來(lái)。由于異源雙鏈(錯(cuò)配的)DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同,在相同的部分變性條件下,異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性,被色譜柱保留時(shí)間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來(lái),從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線(xiàn)。,同源DNA于異源DNA,DHPLC系統(tǒng)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)Hae3酶切質(zhì)粒pUC18分析圖譜比較,紫外光檢測(cè)器,DHPLC在檢測(cè)突變基因的主要技術(shù)特點(diǎn),檢測(cè)的準(zhǔn)確性高,對(duì)未知突變大于96%,已知突變大于99%。檢測(cè)靈敏度高,能檢測(cè)低水平的突變,可靠檢測(cè)樣品中少至5%的基因型?？煞治霎愘|(zhì)性樣本,可進(jìn)行混合樣品的分離檢測(cè)。操作容易,自動(dòng)化分析。結(jié)果重復(fù)性高,速度快。,DHPLC在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用,DHPLC