密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 枯草芽孢桿菌 368核黃素高產(chǎn)原因的遺傳分析以及工程菌株的初步構(gòu)建 of 68 of of 68 of 本研究以 枯草芽孢桿菌 368（核黃素高產(chǎn)菌株）為研究對象，對直接影響其核黃素產(chǎn)量的 3類基因進(jìn)行了克隆和測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該菌株的核黃素高產(chǎn)原因與 突變可以導(dǎo)致它所編碼的黃素激酶活性大幅度下降 ，黃素激酶活性的下降一方面可以降低核黃素在代謝途徑中的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化率，增加核黃素的積累；另一方面還可以降低細(xì)胞中的 素單核苷酸 )、素腺嘌呤二核苷酸）水平，而 及核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (表達(dá)量，從而有利 于核黃素的生成與對外運(yùn)輸，增加該菌株的核黃素產(chǎn)量。另外我們對枯草芽孢桿菌中的核黃素操縱子做了進(jìn)一步的優(yōu)化和改造，主要包括：調(diào)控序列的去除、外源強(qiáng)啟動子 加入、原啟動子的去除以及四環(huán)素抗性基因的加入等。分析比較了它們在不同大腸桿菌中的游離表達(dá)情況， 嘗試以大腸桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行核黃素高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建 。結(jié)果表明：去掉 加入一個外源強(qiáng)啟動子 黃素合成基因的表達(dá)量可以得到明顯的提高。當(dāng)以 100g/的核黃素產(chǎn)量可以達(dá)到 86g/床水平）；當(dāng)加入四環(huán)素抗性標(biāo)記基因并以 20g/四環(huán)素為選擇壓力時其核黃素產(chǎn)量可以達(dá)到 108g/床水平），與未經(jīng)改造的 0 倍。最后本研究對枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法做了進(jìn)一步的摸索和優(yōu)化，用甘氨酸培養(yǎng)結(jié)合電轉(zhuǎn)法可以使枯草芽孢桿菌 式菌株）的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到 104，明顯高于其它方法。另外通過構(gòu)建整合型載體將優(yōu)化好的 檢測分析了外源基因 的整合及表達(dá)情況。該研究為進(jìn)一步構(gòu)建核黃素高產(chǎn)工程菌株奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞： 核黃素，基因工程，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌 he In to of to in a in is in of to MN in of of to of In MN AD on a to On of by as a we of of by by 00g/as a of 6g/0g/as an 08g/ml of we a as 104 ,In we an it of of be to 錄 中文摘要 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A B S T R A C T I 第一章 緒論 - 1 研究的目的和意義 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 2 目前國內(nèi)外研究進(jìn)展 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 黃素的理化性質(zhì)和生理作用 黃 素的應(yīng)用 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 黃素的工業(yè)化生產(chǎn) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 黃素合成的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 因工程技術(shù)在核黃素生產(chǎn)中的應(yīng)用 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 前國內(nèi)外核黃素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 3 研究 的 內(nèi)容和方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 第二 章 核黃素高產(chǎn)原因分析以及核黃素操縱子的改造 - 1 4 1 材料與方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4 驗(yàn)材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 要儀器、工具酶與試劑 4 用溶液和緩沖液 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4 養(yǎng)基 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 驗(yàn)方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 2 結(jié)果與分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 黃素高產(chǎn)原因的分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 黃素操縱子的拼接及改造 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 23 3 本章小結(jié) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31 三章 核黃素操縱子在大腸桿菌中的表達(dá) 2 1 材料與方法 - 32 1 . 1 實(shí)驗(yàn)材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 32 要儀器 2 劑和溶液 - 2 養(yǎng)基 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 驗(yàn)方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 2 結(jié)果與分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 35 黃素的定性 分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 35 黃素的定量分析以及 o p e r o n 表達(dá)條件的優(yōu)化 6 腸桿菌核黃素生產(chǎn)能力的分析與比較 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 42 3 本章小結(jié) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 第四章 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化及工程菌株的構(gòu)建 5 1 材料與方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 1 . 1 實(shí)驗(yàn)材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 要儀器、工具酶與試劑 - 5 養(yǎng)基和溶液 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 驗(yàn)方法 6 2 結(jié)果與分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 48 種不同轉(zhuǎn)化方法的比較 - 48 化方法 優(yōu)化 0 合型載體的構(gòu)建 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 53 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化 3 轉(zhuǎn)化子 進(jìn)行 測 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 53 黃素產(chǎn)量的檢測 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 56 3 本章小結(jié) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 56 結(jié)論與討論 - 57 參考文獻(xiàn) - 1 致謝 5 附錄 6 作者簡歷 - 71 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 1 研究目的和意義 核黃素 是動物體自身不能合成的低分子有機(jī)化合物，是維持機(jī)體正常代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品以及飼料行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值。 近年來核黃素產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，尤其是微生物發(fā)酵法 以其高效、節(jié)能 、污染小等特點(diǎn)在核黃素產(chǎn)業(yè)中逐步占據(jù)主導(dǎo)地位并成為未來的發(fā)展趨勢。 因此篩選分離不同的核黃素高產(chǎn)菌株，研究其高產(chǎn)機(jī)理，并以此為依據(jù)進(jìn)行核黃素高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建，已成為國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究以一株核黃素高產(chǎn)枯草芽孢桿菌 368為研究對象，對與核黃素合成直接相關(guān)的幾類基因進(jìn)行了克隆測序，從分子生物學(xué)水平上分析了其高產(chǎn)機(jī)理，為今后構(gòu)建核黃素高產(chǎn)工程菌株奠定一定的理論基礎(chǔ)；另外，對來源于枯草芽孢桿菌 368 中的核黃素操縱子 了不同的優(yōu)化和改造，研究比較了它們在不同大腸桿菌中的表達(dá)情況，嘗試以 大腸桿菌為出發(fā)菌株進(jìn)行核黃素高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建；最后本研究對枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法做了進(jìn)一步的摸索和探討，并以枯草芽孢桿菌為受體菌進(jìn)行核黃素工程菌株的構(gòu)建，對構(gòu)建核黃素高產(chǎn)枯草芽孢桿菌進(jìn)行了初步的研究和探索。 2 目前國內(nèi)外研究進(jìn)展 黃素的理化性質(zhì)和生理作用 核黃素（ 名維生素 生素 G、或乳黃素，其分子是由一個異咯嗪環(huán)和五個碳原子的糖側(cè)鏈組成。分子式為 子量為 376 。固態(tài)核黃素為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為 292，味苦。純核黃素溶于水，更易溶 于堿液、甲醇、乙酸和醋酸中。不溶于丙酮、醚、苯、和三氯甲烷。核黃素的水溶液呈黃綠色，并在紫外光中表現(xiàn)強(qiáng)烈的黃綠熒光，核黃素見光易分解，但在黑暗處和常溫下，結(jié)晶狀或水溶液中的核黃素是穩(wěn)定的，此外溶液的酸堿度也大大影響其破壞的速度。核黃素在酸性條件下比較穩(wěn)定，能耐高溫，但在堿性條件下則極易破壞；核黃素很易被亞硫酸鹽所還原，還原后生成無熒光的無色二氫化合物，但在空氣中經(jīng)反復(fù)震蕩后仍可重新氧化而形成核黃素，并恢復(fù)其特有的顏色和熒光。 核黃素是人體必需的一種水溶性維生素。具有廣泛的生理功能，是維持機(jī)體正常代謝所必需的 營養(yǎng)物質(zhì)。它是機(jī)體內(nèi)許多酶系統(tǒng)的重要輔基 黃素腺嘌呤二核苷酸（ 黃素單核苷酸 (組成成分。一分子的核黃素和 的一分子磷酸組合生成黃素單核苷酸 (一分子的 和一分子 的 合形成 特定的蛋白結(jié)合則形成具有特定功能的復(fù)合物，參與機(jī)體的正常代謝。在機(jī)體的能量代謝中，以 輔基的黃素蛋白（ 呼吸鏈的重要成員，參與傳遞 H 和電子的作用。而機(jī)體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動所需的能量大部分來自于電子在呼吸鏈上進(jìn)行傳遞時所形成的 糖代謝、脂肪 代謝以及蛋白代謝過程中 作為某些氧化還原酶的輔基來維持機(jī)體的正常代謝反應(yīng)。如三羧酸循環(huán)中丙酮酸氧化脫羧酶系中的二硫辛酸脫氫酶，其輔基便是 外，脂肪酸氧化過程中的脂酰氫酶、氨基酸氧化脫胺過程中的氨基酸氧化酶等，其輔基也都是 參核酸代中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 謝和機(jī)體的抗氧化作用。因此如果機(jī)體缺乏核黃素就會影響生物體正常的氧化作用，引起物質(zhì)代謝紊亂，出現(xiàn)一系列的病癥，嚴(yán)重的將會導(dǎo)致死亡。 核黃素在機(jī)體中儲存有限，多余的部分隨尿液排出體外。在人與動物體內(nèi)，除腸道細(xì)菌能合成少量核黃素外，機(jī)體本身 不能合成，需從食物中攝取，因此機(jī)體需要經(jīng)常補(bǔ)充核黃素使核黃素的日攝入量不低于某一數(shù)值。間。若長期低于這一范圍，人體則會因缺乏核黃素而出現(xiàn)一些典型的病癥，如：陰囊炎、皮炎、口角炎、舌炎等。因此核黃素被世界衛(wèi)生組織列為評價人體生長發(fā)育和營養(yǎng)狀況的六大指標(biāo)之一。對于動物，每公斤飼料中的核黃素含量應(yīng)保持在 1 間。家禽或家畜的核黃素攝入量不足會導(dǎo)致動物生長受阻、食物的利用率降低，嚴(yán)重的還會引起腹瀉。我國規(guī)定膳食中核黃素的供給量為 000我國人群的食物結(jié)構(gòu)中維生素 量偏低。一般 100生素 們從膳食中攝入的維生素 量僅為正常需要量的 55%。因此在日常食品中添加適量的核黃素將有助于改善我國人民的核黃素營養(yǎng)狀況（ 陸海鵬 黃素的應(yīng)用 由于核黃素除具有上述廣泛生理功能，因此作為生物體所必不可少的一種營養(yǎng)物質(zhì)，在醫(yī)療保健、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、以及化裝品工業(yè) 中均有重要的價值。 黃素在醫(yī)療保健方面的應(yīng)用 核黃素早年主要用于防治核黃素缺乏病 ,如舌炎、口角炎、陰囊炎等，近年來的研究表明 ,核黃素還有利尿、防癌、降血脂和改善心功能等作用，它的重要性已引起廣泛的關(guān)注 (王林靜， 2000)。 黃素與生長發(fā)育 目前在多種動物中已進(jìn)行了核黃素缺乏的研究 ,核黃素缺乏可產(chǎn)生一些重要的影響 ,其中最主要的是生長障礙。楊煥民等人以 1日齡大鼠作實(shí)驗(yàn)時也發(fā)現(xiàn) ,低溫下補(bǔ)充適量核黃素有利于生長激素和胰島素的分泌 ,從而有利于生長；且通過增加腎上腺皮質(zhì)束狀帶寬度及 束狀帶和髓質(zhì)細(xì)胞數(shù) ,降低血清中的 促進(jìn)機(jī)體冷適應(yīng) ,提高機(jī)體耐寒力。因此耐寒環(huán)境下適量補(bǔ)加核黃素有利于動物的生長 (楊煥民， 1998)。人體研究也得出相應(yīng)的結(jié)論：孕期核黃素攝入量與新生兒出生體重呈正相關(guān)而且強(qiáng)化核黃素的食品能有效地改善小學(xué)生營養(yǎng)狀況和促進(jìn)其生長發(fā)育（ 莫靜賢， 1996）。 黃素與生殖 核黃素對維持哺乳動物正常生殖功能起重要作用。凌誠德等指出核黃素對“敵枯雙”染毒后的孕鼠有阻抑致畸作用，核黃素吸收正常的實(shí)驗(yàn)組其腦畸形率明顯低于對照組，而其活胎率、著床率則明顯高于 對照組（ 993）。 黃素與缺鐵性貧血 我國人群中，核黃素缺乏及缺鐵性貧血的發(fā)生率均較高，尤見于兒童、孕婦。因此 ,鐵、核黃素與缺鐵性貧血關(guān)系的研究是近年來國內(nèi)外學(xué)者重視的研究課題。國內(nèi)外大量的動物實(shí)驗(yàn)表明，核黃素缺乏組的血紅蛋白量及肝鐵濃度均明顯低于對照組。人群調(diào)查也證實(shí) ,核黃素缺乏者的平均血紅蛋白量與血清鐵蛋白 (度均低于正常者，且其貧血率及缺鐵率高于核黃素營養(yǎng)狀況正常中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 者。機(jī)體核黃素的缺乏 ,可能導(dǎo)致小腸粘膜 化還原酶 (即鐵蛋白還原酶 )活力降低 ,該酶可將結(jié)合型的鐵蛋白中的三價鐵還原為游離型的二價鐵 ,因此其活性降低 ,將影響腸粘膜中鐵蛋白鐵的動員 ,如果這一作用機(jī)制的解釋能進(jìn)一步得到證實(shí) ,則核黃素缺乏在實(shí)際上并不影響鐵的吸收 ,而是影響其吸收后粘膜貯存的水平 ,使暫時貯存于鐵蛋白中的鐵難以動員入血而隨腸粘膜上皮脫落重新排出，從而使進(jìn)入血循環(huán)的鐵減少，造成一定程度的“空吸收” (陳文根 ,1990)。 黃素與癌 大量的流行病學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)資料表明 ,核黃素等微量營養(yǎng)素具有防癌和抗癌作用。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn) :伊朗、中國等地居民因核黃素缺乏或嚴(yán)重攝入不足而導(dǎo)致 慢性食道炎或食管癌的現(xiàn)象普遍存在。林英等研究也證實(shí) :補(bǔ)充核黃素組的食管癌前病人的食管上皮細(xì)胞增生轉(zhuǎn)換的好轉(zhuǎn)率和穩(wěn)定率明顯高于安慰劑組?？梢姾它S素可抑制食管上皮增生或促進(jìn)其向正常轉(zhuǎn)化。除影響上皮組織完整性外 ,核黃素還有抗突變作用 ,經(jīng) 驗(yàn)檢測 ,核黃素是黃曲霉毒素 變劑的很有效的拮抗物(林英 ,1995)；周純先指出 :小鼠腹腔注射核黃素 0時 ,可顯著降低 小鼠微核作用 ; 隨后李建端等以大鼠作實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn) ,在 養(yǎng)基中添加核黃素 (26 130 )可顯著抑制甲基芐基亞硝胺 (的致細(xì)胞突變作用 (周純先 ,1995)。 黃素與心血管疾病 近年來 ,核黃素在心血管疾病防治中的作用已日益引起人們的關(guān)注。有研究顯示 ,核黃素有降血脂、抗血小板聚集、抑制脂質(zhì)過氧化等作用 ,這些都是與高血壓并發(fā)癥相關(guān)的危險因素。據(jù)左保華等報道 :高血壓患者口服核黃素 (75mg/d)后 ,與用藥前比能顯著抑制血小板聚集性、降低血清丙二醛含量和甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量 ,增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性。在核黃素對冠心病患者心功能影響的研 究中 ,左保華等也發(fā)現(xiàn) : 冠心病患者連續(xù)服用核黃素 (75d)， 30能顯著改善心臟收縮和舒張功能 ,每搏輸出量明顯增加。核黃素改善心臟功能可能是由于 : 核黃素是呼吸鏈電子傳遞過程中黃素酶類的輔基 ,該酶系參與糖的有氧代謝 ,促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A ,改善心肌能量供應(yīng) ,促使缺血性心肌細(xì)胞恢復(fù)；核黃素有抗血小板聚集作用，阻斷因果循環(huán)（因血小板聚集增加 ,加重血管內(nèi)皮損傷及心肌缺血，血管內(nèi)皮損傷又促進(jìn)血小板聚集）；核黃素可能通過提高超氧化物歧化酶活性和還原至谷胱甘肽再生發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用。核黃素能 減慢和穩(wěn)定心率、降低心率失常、有助于抗氧反常損傷 (987)。 黃素在飼料工業(yè)中的應(yīng)用 有關(guān)核黃素在機(jī)體代謝和生長中的作用及其缺乏引起各種癥狀得到了動物學(xué)家的重視并得以開展研究。大量研究表明，核黃素能夠促進(jìn)動物生長，提高動物整體及腦功能，還可以提高動物的生產(chǎn)能力及耐寒能力。因此，在動物飼料工業(yè)中核黃素作為添加劑，有廣泛的應(yīng)用前景。 高飼料轉(zhuǎn)化率促進(jìn)動物生長 顧景范研究發(fā)現(xiàn)：一組大鼠自缺乏核黃素第 3日起體重就不再增長，以后 5周均維持在原體重（只增加 10 ；后補(bǔ)充核黃素時，體重立即增加。徐京選初斷乳 2個水平蛋白質(zhì) (酪蛋白 12和 20 )、淀粉 (30和 65 ) 、核黃素（ 12g/4g/d）組成 2 2 2析因?qū)嶒?yàn)，研究大鼠核黃素營養(yǎng)狀況及需要量與膳食因素的關(guān)系。結(jié)果表明，核黃素需要與膳食中蛋白質(zhì)和淀粉攝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 入量有關(guān)，高蛋白、低淀粉組動物，核黃素需要量相對較高。在同一核黃素攝入水平下，增加蛋白質(zhì)攝入量，動物生長并未相應(yīng)改善。而且，核黃素與蛋白質(zhì)之間存在著一定數(shù)量關(guān)系，兩者比值在動物生長中起著關(guān)鍵性作用，蛋白質(zhì)的量決定了核黃素的最低需要量，當(dāng) 攝入量低于這個最低需要量時，就不能使動物得到最佳生長 (杜留云 ,2002)。 高動物繁殖能力 妊娠母豬的繁殖性能與維生素營養(yǎng)關(guān)系密切。董志巖對妊娠母豬的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，維生素要是提高早期胚胎存活率，改善母豬的繁殖性能。在現(xiàn)時規(guī)?；B(yǎng)豬多應(yīng)激因素的條件下 ,參照 加安全劑量，有利于確保母豬繁殖潛力的表現(xiàn)（董志巖 ,2000）。 高種蛋受精率和孵化率 種蛋中核黃素含量較低，胚胎常常在孵化第 4和 20天因循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育障礙而死 亡。新孵出的雛雞因胚胎蛋白質(zhì)代謝不完全導(dǎo)致羽小枝的倒溝不能打開而出現(xiàn)所謂的“棒狀絨毛”這提示種雞日糧中臨界缺乏核黃素 (龐昕 ,2000)。 高蛋雞的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì) 陳艷珍等通過研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加核黃素顯著提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低了料蛋比和死亡率，增加了采食量，蛋重、破蛋率無明顯變化。這可能是由于核黃素有利于雞體內(nèi)的能量和蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)了機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用，緩解了應(yīng)激對蛋雞產(chǎn)生的不利影響，使蛋雞生產(chǎn)性能得到了充分發(fā)揮。由此可見，在生產(chǎn)中適量補(bǔ)充核黃素是十分必要的，尤其是對集約化、高密度的雞場更為重要。另外核黃素對雞蛋品質(zhì)也有重要的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞日糧中添加核黃素顯著改善了蛋形指數(shù)，使雞蛋接近標(biāo)準(zhǔn)蛋形，蛋黃比重、蛋黃指數(shù)、哈夫單位明顯增加，蛋黃顏色加深，對其余指標(biāo)無明顯影響。這說明核黃素能顯著改善蛋品質(zhì)，有利于蛋的儲藏、運(yùn)輸和加工，增強(qiáng)了感觀效果，能夠滿足消費(fèi)者心理要求 (陳艷珍 ,2004)。 進(jìn)機(jī)體冷適應(yīng)增強(qiáng)耐寒力 分泌系統(tǒng)參與動物的冷適應(yīng)，其中甲狀腺激素起重要作用。由于低溫下動物能量代謝增強(qiáng)，核黃素又直接參與這一過程，加之，寒冷等物 理因素，可引起蛋白質(zhì)和核黃素?fù)p失增多，認(rèn)為低溫下動物對核黃素的需要量增加。有數(shù)據(jù)表明，寒冷條件下補(bǔ)充一定量的核黃素，可以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)的氧化磷酸化過程，使產(chǎn)熱升高， 有利于機(jī)體耐寒力的增強(qiáng)。楊煥民等（ 1998）在低溫下（ 10 2）飼養(yǎng)的大鼠仔，補(bǔ)充核黃素至 60日齡連續(xù)暴露 72果表明，增加核黃素供給量對大鼠的增重、腎上腺組織細(xì)胞及某些激素的變化均產(chǎn)生有益影響，而且能增強(qiáng)機(jī)體抵抗冷應(yīng)激的能力。因而在寒冷環(huán)境條件下適量補(bǔ)加核黃素將有利于動物的生活，并對低溫下飼養(yǎng)的仔鼠增重有明顯改善作用 (杜留云 ,2002)。 強(qiáng)機(jī)體免疫力 核黃素作為許多酶的輔助因子參與機(jī)體代謝，通過影響機(jī)體對養(yǎng)分的吸收與利用，從而間接參與免疫細(xì)胞增殖、分化和 建海等通過在肉仔雞基礎(chǔ)日糧中分別添加 0、 添加 第一章 緒論 5 組均能刺激法氏囊和脾臟發(fā)育，其中，脾臟的相對重量增加明顯，分別比對照組增加 各水平核黃素處理組均能刺激外周血液中白細(xì)胞和異嗜細(xì)胞數(shù)量 增加，且隨著核黃素水平呈遞增趨勢 (張建海 ,2003)。 黃素的工業(yè)化生產(chǎn) 目前核黃素的生產(chǎn)方法主要有兩種：一種為化學(xué)合成法，另一種微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法反應(yīng)步驟多、工藝長、回收率低、成本高（要用到較貴的起始反應(yīng)物 能大，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)需求。因此化學(xué)合成法正逐漸被微生物發(fā)酵法所取代 (000)。 微生物發(fā)酵法所利用的是可再生能源，廢物排放量少，生產(chǎn)成本低，是目前國際上倍受推崇的核黃素生產(chǎn)方法。能夠產(chǎn)生核黃素的菌種很多，細(xì)菌方面有枯草桿菌（ 棒狀桿 菌，節(jié)桿菌，乙酸丁梭狀桿菌，不動桿菌等。真菌方面有棉病囊霉 (季也蒙假酵母(阿舒假囊酵母 (釀酒酵母 (假絲酵母屬 ( (陸海鵬 ,2002)。但是真正有商業(yè)價值的菌種卻很少。 最初利用生物發(fā)酵法進(jìn)行核黃素商業(yè)化生產(chǎn)的是一株梭狀芽孢桿菌（ ,其培養(yǎng)液為麥芽汁和乳清。由于當(dāng)時發(fā)酵技術(shù)及菌 種選育技術(shù)非常落后，因此核黃素產(chǎn)量很低。到了 1940 年該方法得到了進(jìn)一步的改進(jìn)，菌種也由原來的梭狀芽孢桿菌變?yōu)榘⑹婕倌医湍?(979)。即而又改用棉病囊霉作為生產(chǎn)菌株。然而核黃素產(chǎn)量仍不理想(979)。 1965 年有三家公司（ 始利用微生物發(fā)酵法對核黃素進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。但好景不長，三年后三家公司都相繼停產(chǎn)，其原因是微生物發(fā)酵法所產(chǎn)核 黃素的量太低，根本無法與化學(xué)合成法競爭(981)。 1974 年微生物發(fā)酵法重新被 司所采用。他們利用棉病囊霉作為生產(chǎn)菌株，從中摸索出了許多發(fā)酵技術(shù)，并通過誘變育種技術(shù)獲得了許多核黃素高產(chǎn)菌株。從此微生物發(fā)酵法獲得了長足的發(fā)展。當(dāng)時常用的兩個高產(chǎn)突變株為 A. 核黃素產(chǎn)量可達(dá)15g/L(989)。由于 遺傳穩(wěn)定性差，人們更傾向于利用 為工業(yè)生產(chǎn)用菌株 (972)。 在隨后的一段時期內(nèi) 國際上一些知名公司也開始采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行核黃素的生產(chǎn)。 1990德國的 司嘗試使用 為生產(chǎn)菌株進(jìn)行核黃素的商業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)過 6 年的發(fā)展，他們最終用微生物發(fā)酵法完全取代了化學(xué)合成法 (996)。美國的 開發(fā)出了一株核黃素高產(chǎn)