密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 傳染性法氏囊病病毒 白抗原表位分析與定位研究 P2 交日期 2007 年 6 月 碩士研究生: 鄧小蕓 指導(dǎo)教師:王笑梅 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別 : 農(nóng)學(xué)碩士 專(zhuān) 業(yè):預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研究方向:分子病毒學(xué)和 免疫學(xué) 培養(yǎng)單位:研究生院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 P2 s. 007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果， 也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評(píng)閱人、答辯委員名單 論文題目 傳染性法氏囊病病毒 白抗原表位分析與定位研究 論文作者 鄧小蕓 指導(dǎo)教師 王笑梅 培養(yǎng)單位 哈爾濱獸醫(yī)研究所 姓名 職稱(chēng)職務(wù) 導(dǎo)師類(lèi)別 單位 專(zhuān)業(yè) 張永光 研究員 博士生導(dǎo)師 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 評(píng) 閱 人 劉湘濤 研究員 博士生導(dǎo)師 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 答辯 主席 李景鵬 教授 博士生導(dǎo)師 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 王君偉 教授 博士生導(dǎo)師 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 蔡雪輝 副研究員 碩士生導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 崔尚金 副研究員 碩士生導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 答 辯 委 員 曲連東 副研究員 碩士生導(dǎo)師 哈爾濱獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 答辯時(shí)間、地點(diǎn) 2006 年 6 月 15 日上午于哈爾濱獸醫(yī)研究所學(xué)術(shù)報(bào)告廳 記 錄 周?chē)?guó)輝 要 本研究利用傳染性法氏囊病病毒 白的四株單克隆抗體（ 噬菌體隨機(jī) 15 肽庫(kù)進(jìn)行了 3 輪篩選，得到了 8 個(gè)模擬表位，在競(jìng)爭(zhēng)抑制 模擬表位與單抗的反應(yīng)可被 白競(jìng)爭(zhēng)抑制。 為了更進(jìn)一步詳細(xì)研究 位結(jié)構(gòu)，本研究設(shè)計(jì)表達(dá)了一組總數(shù)為 17 個(gè)部分重疊且覆蓋 長(zhǎng)的短肽融合蛋白， 利用肽掃描技術(shù)對(duì)這四株 單克隆抗體針對(duì)的抗原表位進(jìn)行了研究，鑒定出了兩個(gè)新的 性表位： 109聚蛋白的 864（針對(duì) ， 177聚蛋白的 932(針對(duì) 同源性分析結(jié)果顯示， 這兩個(gè)表位在多種血清 I 型 （除變異株 ） 和血清型毒株中同源性為 100%，是 守的群特異性表位。這兩個(gè)表位具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，說(shuō)明這兩個(gè)表位可以作為制備多表位疫苗和診斷試劑的候選肽段。 利用肽掃描技術(shù)對(duì)三株 在 187源性分析結(jié)果顯示，該表位僅在血清型 ，說(shuō)明這個(gè)表位是保守的型特異性抗原表位。 該研究將有助于進(jìn)一步闡明 討其表位生物學(xué)功能，對(duì)設(shè)計(jì)科學(xué)合理的疫苗和診斷試劑具有重要的意義。 關(guān)鍵詞 ：傳染性法氏囊病病毒，抗原表位，肽掃描，噬菌體隨機(jī) 15肽庫(kù)，單克隆抗體 he P3 by P3 to 5of 8 15as of be P3 In to 17 or P3 109864of 77932of in ) so of c P3 P2 A 187 to in so it is P2 P3 15 一章 緒論 . 1 染性法氏囊病的研究概況 . 1 原學(xué) . 1 行病學(xué) . 2 床癥狀 . 3 理變化 . 3 因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白功能 . 3 原表位的研究方法及 原表位研究進(jìn)展 . 5 原表位的研究方法 . 5 原表位的研究意義 . 7 原表位研究進(jìn)展 . 8 斷方法的研究進(jìn)展 . 9 斷方法的研究 . 9 于表位的診斷方法研究 . 9 苗的研究進(jìn)展 . 10 苗的研究 . 10 位疫苗的研究 . 11 研究目的與意義 . 12 第二章 利用噬菌體展示隨機(jī) 15 肽庫(kù)鑒定 原表位 . 13 料與方法 . 13 料 . 13 抗與隨機(jī)肽庫(kù) . 13 庫(kù)的生物淘洗 . 14 菌體效價(jià)測(cè)定 . 14 菌體擴(kuò)增 . 14 菌體的制備 . 14 菌體短肽的間接 測(cè) . 15 爭(zhēng)抑制 測(cè) . 15 菌體短肽測(cè)序分析 . 15 果 . 15 庫(kù)的生物淘洗的產(chǎn)率 . 15 菌體短肽的 測(cè) . 16 爭(zhēng)抑制 測(cè) . 16 菌體短肽測(cè)序 . 16 位序列分析 . 17 論 . 17 第三章 利用 術(shù)鑒定 原表位 . 19 料與方法 . 20 料 . 20 位預(yù)測(cè)及短肽設(shè)計(jì) . 20 段擴(kuò)增、克隆與表達(dá) . 22 術(shù)篩選抗原表位 . 22 定抗原表位 . 22 位免疫原性檢測(cè) . 22 位反應(yīng)原性檢測(cè) . 22 位的同源性分析 . 22 位作圖 . 23 果 . 23 位預(yù)測(cè)及短肽設(shè)計(jì)結(jié)果 . 23 段擴(kuò)增、克隆與表達(dá) . 24 術(shù)篩選抗原表位 . 24 定抗原表位 . 25 原表位的免疫原性檢測(cè)結(jié)果 . 26 原表位的反應(yīng)原性檢測(cè)結(jié)果 . 26 位的同源性分析 . 26 位作圖結(jié)果 . 27 論 . 27 第四章利用 術(shù)鑒定 原表位 . 30 料與方法 . 30 料 . 30 肽設(shè)計(jì) . 30 段擴(kuò)增、克隆與表達(dá) . 31 術(shù)篩選抗原表位 . 32 定抗原表位 . 32 位的同源性分析 . 32 位作圖 . 32 果 . 32 肽設(shè)計(jì) . 32 段表達(dá) . 33 術(shù)篩選抗原表位 . 34 定抗原表位 . 34 位的同源性分析 . 35 位作圖結(jié)果 . 35 論 . 36 第五章 結(jié)論 . 37 參考文獻(xiàn) . 38 致謝 . 44 作者簡(jiǎn)歷 . 45 文縮寫(xiě) 英文全稱(chēng) 中文名稱(chēng) 染性法氏囊病 染性法氏囊病病毒 染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒 染性胰壞死病毒 F 蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒草地貪夜蛾（又稱(chēng)秋粘蟲(chóng)）系統(tǒng) 城疫病毒 痘病毒 of 雞皰疹病毒 腺病毒 毒蝕斑單位 胚成纖維細(xì)胞 0%雞胚感染量 特定病原體 NA NA 賴(lài) 合酶 毛尿囊膜 克隆抗體 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 轉(zhuǎn)錄 丙基 道爾頓 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 毒中和試驗(yàn) 脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 接免疫熒光檢測(cè) 放閱讀框 B 液體培養(yǎng)基 乙二醇 酸鹽緩沖溶液 沖鹽溶液 苯二胺 ,3氨基聯(lián)苯胺 酸纖維素 翻譯區(qū) 二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳 根過(guò)氧化酶 補(bǔ)脫氧核糖核酸 氧核糖核酸 糖核酸 芐青霉素 那霉素 環(huán)素 酸疫苗 胞免疫應(yīng)答 酸疫苗 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1第一章 緒論 傳染性法氏囊?。?由傳染性法氏囊病病毒（ 引起的雞和火雞的急性、 高度接觸性、 殺淋巴細(xì)胞性的傳染病 （殷震等， 2001） 。它對(duì)于養(yǎng)禽業(yè)有兩個(gè)方面的危害：一是直接的危害， 感染可以使雞群致病、致死、致生產(chǎn)性能下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；尤其是 80 年代以來(lái)，出現(xiàn)了毒力大大增強(qiáng)的 ，常常使感染雞群出現(xiàn)全群覆滅的慘痛局面。二是間接的危害， 其是抗原性發(fā)生漂變的 異株，雖然不會(huì)導(dǎo)致雞群的大面積死亡，但會(huì)使感染雞群免疫機(jī)能低下，而對(duì)其它疫苗的免疫應(yīng)答能力降低，對(duì)其它疫病的易感性增強(qiáng)，常常繼發(fā)細(xì)菌感染，抗生素投喂量的增加，飼養(yǎng)成本增加，同時(shí)導(dǎo)致藥物殘留，危害人類(lèi)健康，影響出口貿(mào)易，間接損失更為嚴(yán)重。 在世界范圍內(nèi)引起了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，為 研究提供了更為豐富的方法和手段。已取得了很多突破性進(jìn)展， 眾多的科學(xué)工作者從 基因結(jié)構(gòu)、主要結(jié)構(gòu)蛋白及其功能方面作了較為深入的研究。 明確了病毒的結(jié)構(gòu)和基因組的主要功能，為基因工程疫苗研制和新型診斷方法的建立提供了理論依據(jù)。 染性法氏囊病的研究概況 清型共有 2 個(gè)，雞源性的為 清 I 型，火雞源為 清 ，血清 毒株對(duì)雞無(wú)致病性（ et 1980） 。根據(jù)致病特征和抗原性的差異，血清 I 型中又可以分為經(jīng)典毒株、變異毒株和超強(qiáng)毒株。經(jīng)典毒株以導(dǎo)致法氏囊水腫為特征，世界各地廣泛流行；變異株于 1985 年首次分離于美國(guó)特拉華州，未見(jiàn)有水腫的過(guò)程，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，主要流行于美國(guó)、澳大利亞、中國(guó)；超強(qiáng)毒株導(dǎo)致法氏囊出血，嚴(yán)重的外觀(guān)似 “紫葡萄 ”樣，死亡率高達(dá) 70%以上，最早分離于比利時(shí)，現(xiàn)已大面積流行于歐洲、東南亞、非洲等。目前，該病已經(jīng)遍布全球養(yǎng)禽地區(qū)，在工業(yè)化養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家尤為嚴(yán)重。我國(guó)于 1979 年先后在北京、上海、廣州等地發(fā)現(xiàn)了本?。ㄖ茯缘?， 1982） 。 1990 年以后，我國(guó)報(bào)道分離到 變異株，使該病呈現(xiàn)了新的流行特點(diǎn)，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。除雞之外，鴨、鵝、鷗、麻雀等均存在 自然感染，這些動(dòng)物感染 通常不表現(xiàn)臨床癥狀，可能成為病毒攜帶者或貯藏宿主，不僅可能引發(fā) 傳播和續(xù)源流行，也為 變異提供了特殊的生態(tài)條件。 原學(xué) 毒學(xué)分類(lèi)與結(jié)構(gòu)特性： 于雙 毒科 （ ， 禽雙 。本科成員還包括水生雙 毒屬和昆蟲(chóng)雙鏈 毒屬。水生雙毒屬包括魚(yú)的傳染性胰壞死病毒（ ，昆蟲(chóng)雙毒屬于果蠅的 x 病毒（ ，它們的基因組均由兩個(gè)節(jié)段的雙鏈 成。本科病毒呈二十面體對(duì)稱(chēng)，球形，粒子直徑大小約 55 65 圖 1。無(wú)囊膜，表面無(wú)突起。負(fù)染電鏡觀(guān)察表明， 毒顆粒并非球形，呈 T=13 對(duì)稱(chēng)，五倍軸延伸直徑為 72三倍軸延伸中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2直徑為 66白形成 3 亞基攜帶中和性抗原表位，暴露于病毒粒子的外殼，構(gòu)成直徑為26 200 個(gè) Y 字形的三聚體； 與病毒基因組 用于顆粒內(nèi)部，構(gòu)成直徑為26 200 個(gè) Y 字形的三聚體一些物質(zhì)性結(jié)構(gòu)；在顆粒內(nèi)部，一些物質(zhì)性結(jié)構(gòu)包裹著五倍軸，可能是由 成（ et 1997; et 1999; et 2001） 。 理化特性：完整的病毒粒子在氯化銫中浮密度為 完整病毒粒子低于這個(gè)密度值范圍。 在蔗糖中的沉降系數(shù)為 460s。 常穩(wěn)定，對(duì)低 、氯仿、乙醚等脂溶劑不敏感，對(duì)熱和干燥有相當(dāng)?shù)牡挚沽Γ?56 5 小時(shí)或 60 30 分鐘仍有活力。 70 30 分鐘或 化氨作用 10分鐘能殺滅病毒。 生物學(xué)特性： 體內(nèi)增殖的靶器官是雞的中樞免疫器官 法氏囊組織，對(duì)法氏囊中未成熟的 B 淋巴細(xì)胞或 B 淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞具有很強(qiáng)的親嗜性，另外可通過(guò)雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)體外增殖。 雞胚培養(yǎng)是 殖的最好手段， 實(shí)踐證明， 絨毛尿囊膜 （ 種途徑最為敏感。雞胚通常在感染后 4 6 天死亡，感染雞胚發(fā)育阻滯，水腫和出血，雞胚和 含有大量病毒，尿囊液中病毒含量較低。尿囊腔途徑接種比 徑接種病度滴度（ 滴度。適應(yīng)于雞胚的 在雞胚成纖維細(xì)胞（ 增殖，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。形成肉眼可見(jiàn)的蝕斑。因此可利用病毒蝕斑單位（ 定法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒的定量分析，比雞胚接種法更為敏感。 能在雞胚法氏囊細(xì)胞、腎細(xì)胞中增殖，產(chǎn)生細(xì)胞病變和形成蝕斑。 行病學(xué) 高度接觸性傳染病， 3 6 周齡的幼雞最為易感。最近有研究報(bào)道， 感年齡已向兩端延伸，最早發(fā)生于 1 日齡雛雞群，最大為 150 日齡左右剛產(chǎn)蛋雞群。新近研究表明，麻雀、鴨、鵝均可自然感染 并非是唯一的 然動(dòng)物宿主。但麻雀、鴨、鵝等感染 通常不表現(xiàn)臨床癥狀，可能成為病毒攜帶者或貯存宿主，這就為 區(qū)感染的持續(xù)存在和進(jìn)一步傳播提供了特殊的生態(tài)條件。 病季節(jié)以六、七、八圖 1毒顆粒電鏡照片 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3月份常見(jiàn)，其它季節(jié)發(fā)病較少。 行形式隨雞群密度大小和免疫狀態(tài)，可分為散發(fā)性或地方流行性。一旦出現(xiàn)超強(qiáng)毒株，再加上雞群免疫狀態(tài)差，可呈暴發(fā)式流行（于幼平， 1993） 。本病潛伏期短，人工感染后 2出現(xiàn)臨床癥狀，突出的表現(xiàn)為突然發(fā)病，發(fā)病率較高，死亡集中發(fā)生于很短的幾天內(nèi)， 過(guò)后雞群的康復(fù)較為迅速。 持續(xù)存在于雞舍的環(huán)境中，可通過(guò)雞體之間的直接接觸，或通過(guò)污染病毒的各種媒介物如飼料、飲水、塵土、器具、墊料、人員衣鞋、昆蟲(chóng)機(jī)械等間接接觸傳播。 目前我國(guó)傳染性法氏囊病發(fā)生情況主要有以下特征： 兩端延伸， 3140 天都有報(bào)道。 前大多疫苗都不能有效控制 生。 發(fā)感染新城疫、大腸桿菌等細(xì)菌和病毒病嚴(yán)重。 床癥狀 在易感雞群中，初發(fā)的 呈急性型。雞表現(xiàn)自啄泄殖腔、減食，精神沉郁，羽毛蓬亂，頭及翅膀下垂；嗜睡，眼瞼閉合，呆立一隅，不愿走動(dòng)，步態(tài)不穩(wěn)，臥地，震顫；白色或水樣腹瀉，肛門(mén)周?chē)鹈心嗤痢⒓S便，啄肛。感染后的第二天開(kāi)始陸續(xù)有死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，死亡高峰期一般在感染后的第 3 4 天，第 5 7 天后開(kāi)始恢復(fù)。亞臨床感染，不表現(xiàn)明顯可見(jiàn)的臨床癥狀，但體重減輕，有時(shí)可查出特異性抗體。 理變化 死雞剖檢可見(jiàn)脫水而法氏囊充血和水腫比正常腫大約 2 倍。 法氏囊是本病毒的主要侵害器官，變化明顯，嚴(yán)重病例法氏囊漿膜明顯發(fā)炎，有漿液性滲出物，法氏囊的粘膜表面有出血性淤點(diǎn)或淤斑，甚至呈 “紫葡萄樣 ”外觀(guān)。少數(shù)雞腎腫大，顯白色，尿酸鹽沉著。腿部肌肉及腺胃、肌胃交界處出血。脾臟腫大、出血。病理組織學(xué)檢查可見(jiàn)淋巴樣器官受到損害，法氏囊受損最為嚴(yán)重。其次為脾、胸腺、腸扁桃體和哈德氏腺，法氏囊濾泡和脾的血管周?chē)蕛?nèi) B 淋巴細(xì)胞破裂、崩解，法氏囊內(nèi)大量異嗜性細(xì)胞侵潤(rùn)和增殖。 因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白功能 因組是由 A、 B 兩個(gè)雙鏈 段組成，包括 5端非編碼區(qū)、編碼區(qū)和 3端非編碼區(qū)。較大的 A 節(jié)段約 3260A 節(jié)段的 前（ et 1986; et 1990；et 1995） ，長(zhǎng)為 435碼 145 個(gè)氨基酸的 小為 21后，長(zhǎng)度為3036碼一個(gè)由 1012 個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白（ ，大約110加工變成成熟的 個(gè) 分重疊。 B 節(jié)段含有一個(gè)連續(xù) 2827右，編碼一個(gè)有 878 個(gè)氨基酸組成的蛋白 小約 901987） （見(jiàn)圖 1。此外 A、 B 節(jié)段存在末端非編碼區(qū)（ 。 血清型特異性抗原， 既是 主要結(jié)構(gòu)蛋白， 又是病毒的主要宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異、細(xì)胞凋亡等有關(guān)（ et 1994） 。病毒粒子二十面體結(jié)構(gòu)的衣殼蛋白僅由 成（ et 2005; et 2006; et 2006） ，并且它攜帶有宿主保護(hù)性抗原決定簇，可以誘生保護(hù)性中和抗體，具有血清型特異性。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4該蛋白具有高度疏水性和構(gòu)象依賴(lài)性，試驗(yàn)證明，所有的中和性單克隆抗體可以通過(guò)免疫沉淀而不是 之發(fā)生反應(yīng)。毒力相關(guān)性抗原表位位于 可變區(qū)，屬中和性表位