密級： 論文編號: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 福壽螺多功能纖維素酶基因 克隆 與功能研究 of 士研究生： 谷 嵩 指導(dǎo)教師： 劉 昱 輝 申請學(xué)位類別： 理學(xué)碩士 專 業(yè)： 分子生物學(xué) 研 究 方 向： 分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位： 生物技術(shù)研究所 研究生院 提交日期 2007年6 月 of 2007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 摘 要 隨著石化能源等不可再生資源的日益枯竭，人們試圖尋找可以代替石化燃料的新型能源。利用纖維素酶將纖維素降解為簡單糖，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，為新能源的開發(fā)提供了一個(gè)新方法。 本研究針對福壽螺（內(nèi)源性多功能纖維素酶基因 O. 以蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 螺旋和 折疊為單位進(jìn)行末端缺失，利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)末端缺失蛋白片段，研究蛋白 N 端及 C 端螺旋和折疊的缺失對內(nèi)切 、外切- 、內(nèi)切 (活力的影響，研究其作用機(jī)理，為酶分子的蛋白質(zhì)工程改造提供理論依據(jù)。 根據(jù) 長序列，設(shè)計(jì)了 7 對引物 55 5 3用于 別得到 113210891056918281044921段，插入載體 化巴斯德畢赤酵母 醇誘導(dǎo)表達(dá)獲得 7 種末端缺失蛋白： 5N 端缺失一個(gè) 螺旋）、 5 端缺失螺旋- 折疊）、 5 端缺失螺旋- 折疊- 螺旋）、5N 端缺失螺旋- 折疊- 螺旋- 折疊）、5N 端缺失螺旋- 折疊- 螺旋- 折疊- 螺旋）、3C 端缺失 4 個(gè)折疊）、3C 端缺失 4 個(gè)折疊 螺旋）。 完成了 7 種蛋白的內(nèi)切- 切- 切- 究結(jié)果表明， 5內(nèi)切- 切- 切長蛋白近似。 5內(nèi)切- 長蛋白近似，內(nèi)切- 外切- 長蛋白相比活性下降很多。55533外切- 切- 切- N 末端第一個(gè)折疊到 C 端之間序列的完整性對內(nèi)切- 切- N 端第二個(gè)螺旋至 C 段之間序列的完整性對內(nèi)切- 在研究過程中，得到了 3 段 列，它們的蛋白序列分別含有 構(gòu)域。 關(guān)鍵詞：纖維素酶，末端缺失 I he is of O. GX is a of to of a of 5555533to of in 132108910568918281044921bp NA ,5 5 5-4（ , 5 3 of -1 to of GX -2 to of GX 5533-2 to of to , I 目 錄 第一章 引 言 . 1 維素的利用 . 1 維素的結(jié)構(gòu) . 纖維素酶的應(yīng)用 .生物和動(dòng)物纖維素酶研究近況 . 4 維素酶分類 . 微生物纖維素酶結(jié)構(gòu) . 微生物纖維素酶降解模型 .物纖維素酶的研究 . 9 維素酶應(yīng)用展望 . 10 赤酵母表達(dá)系統(tǒng) . 10 赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn) . 畢赤酵母表達(dá)宿主菌 . 畢赤酵母表達(dá)載體 . 11 源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá) . 11 本研究的目的和意義 . 12 技術(shù)路線 . 13 第二章 材料與方法 . 14 料 . 14 物材料 . 質(zhì)粒和菌株 . 培養(yǎng)基 . 試劑和儀器 . .法 . 16 粒小量提取 . . . . 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 質(zhì)粒化大腸桿菌 . 蛋白質(zhì)的丙烯酰胺凝膠電泳 . 畢赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 酵母電擊轉(zhuǎn)化 .0 酵母基因組的提取 .1 酵母重組子的測 .2 外源蛋白在畢赤酵母中甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá) .3 .4 福壽螺組織取和反轉(zhuǎn)錄 .5 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 .6 纖維素酶活力測定 .7 菌密度測定 .三章 結(jié)果與討論 . 26 果 . 26 壽螺多功能纖維素酶因的克隆 . 表達(dá)載體的構(gòu)建 . 酵母轉(zhuǎn)化及重組子表型篩選 . 酵母重組子的測 . . 酶活力的計(jì)算 . 全長序列末端缺失片段的擴(kuò)增 .論 . 41 . 46 第四章 全文結(jié)論 . 51 參考文獻(xiàn) . 52 致謝 . 57 作者簡歷 . 58 第一章 引言 第一章 引 言 纖維素是地球上資源最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。植物每年通過光合作用，中纖維素、半纖維素約占一半以上 ( 汪維云 等,1996) 。人類活動(dòng)也產(chǎn)生大量的纖維素類物質(zhì)，比如建材、造紙等。雖然纖維素的開發(fā)利用早已引起人們的重視，但目前其利用率僅有 1%左右 ( 張平平等,2004) 。除極少數(shù)部分作為飼料、燃燒和農(nóng)業(yè)渣肥為人們所利用外，絕大部分廢物都未被利用，這不僅造成極大的資源浪費(fèi)，而且有可能造成環(huán)境污染。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，世界人口激增，能源的短缺越發(fā)嚴(yán)峻。1998 年， A , H, 1998) 對現(xiàn)有石油儲(chǔ)備和石油儲(chǔ)量進(jìn)行估計(jì)后認(rèn)為，2010 年天然油產(chǎn)量開始下降，到 2050 年全球每年石油供應(yīng)量將從目前的 25 億桶下降至 5 億桶。纖維素以其巨大的自然資源貯備逐漸受到人們的青瞇。因此，如何有效地利用纖維素，使之轉(zhuǎn)化為人們可以利用的能源和物質(zhì)，一直是中外學(xué)者關(guān)注的課題。利用纖維素酶降解纖維素的優(yōu)點(diǎn)在于特異性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小。對纖維素微生物的研究始于 1912 年，到現(xiàn)在大致經(jīng)歷了 3 個(gè)發(fā)展高峰期( 王祖農(nóng),1986) ：五十年代以前主要是研究防止微生物對天然纖維素的破壞作用；六十年代到七十年代針對世界人口的劇增，主要研究利用纖維素資源生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白；七十年代以后，隨著能源危機(jī)和環(huán)境污染，研究的重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)移到開辟新能源和防止環(huán)境污染上來。近些年動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶的發(fā)現(xiàn)，其不同于微生物纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)，更為纖維素酶的應(yīng)用提供了新的思路。目前限制纖維素生物轉(zhuǎn)化的因素主要是生物轉(zhuǎn)化成本高和降解酶的效率低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，纖維素酶基因的克隆、作用機(jī)理的研究和結(jié)構(gòu)改造逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。 維素的利用 維素的結(jié)構(gòu) 纖維素分子是由萄糖殘基以- 糖苷鍵相連接的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的結(jié)晶分子。纖維素具有（中n 為葡萄糖殘基數(shù)量，稱為聚合度（。纖維素分子的聚合度變化很大，從幾百至幾千甚至幾萬，一般為 800010,000 (孟雷 等 ,2002)。纖維素結(jié)晶分子先由基本單元構(gòu)成直鏈分子，大分子經(jīng)折疊形成具有高結(jié)晶度的纖維素基本單位，再由這些基本單位構(gòu)成微小的結(jié)構(gòu)單位，最后由這些結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成自然界中種類各異、長短不同、千差萬別的纖維素。纖維素巨大的分子聚集體存在很多結(jié)晶變體。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)固態(tài)纖維存在五種結(jié)晶變體，五種變體各自有獨(dú)特的晶胞結(jié)構(gòu) ( 汪為云 等,1998) 。 天然纖維素由排列整齊而規(guī)則的結(jié)晶區(qū)域和相對不規(guī)則、松散的無定形區(qū)域組成。纖維素分子之間存在著氫鍵。在結(jié)晶區(qū)域，纖維素分子平行排列，通過氫鍵的締合作用，形成纖維束。結(jié)晶區(qū)分子密度大，排列緊密。無定形區(qū)域纖維素分子密度小，排列松散，分子空隙大，定向性差。結(jié)晶程度對纖維素的水解影響很大。結(jié)晶度高的區(qū)域分子間空隙小，葡萄糖分子的羥基或在分子內(nèi)部或與分子外部的氫離子相結(jié)合，沒有游離的羥基存在，所以生物大分子和水分子很難介入。因此結(jié)晶區(qū)比無定型區(qū)難降解。普遍認(rèn)為，纖維素的酶解優(yōu)先發(fā)生在無定形區(qū)域 ( 張平平1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 等,2004) 。此外，天然的纖維還含有約 40%纖維素、木質(zhì)素，緊緊包裹著纖維素分子 ( 周正紅等,1998) 并且與半纖維素有共價(jià)關(guān)系形成較復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，阻礙酶與纖維素的接觸 ( 王玉萬 等,1989) 。這可能是天然纖維難以被纖維素酶降解的原因之一。 一般實(shí)驗(yàn)室研究中常用的纖維素底物有：纖維素粉、水楊苷、結(jié)晶纖維素或微晶纖維素、羧甲基纖維素及其鈉鹽、羧乙基纖維素、對- 硝基酚- - 葡萄糖苷、無定形纖維素、纖維四糖、硫酸纖維素、硼酸膨潤纖維素、纖維糊精和脫脂棉等。自然界的天然底物有：木漿、糠醛渣、木屑、稻草（蔗渣、麥稈、稻殼、花生殼粉等）、濾紙、木漿紙、啤酒濾餅、制糖工業(yè)甜菜廢絲等( 王巧蘭 等,2004) 。棉花結(jié)晶度為 80聚合度為 3,50000 (宋桂經(jīng),1997) ，是纖維素中最完善、抗性最強(qiáng)的形式。濾紙是一種多重底物，既有自由末端和無定型區(qū)也有結(jié)晶纖維。一般而言，對天然底物進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理可以提高底物對酶的敏感性，例如經(jīng)酸中和脫堿處理的稻殼酶解轉(zhuǎn)化率比未經(jīng)處理的提高約 3 ( 王淑軍 等,1995) 。 半纖維素含有一種或幾種糖基，比如 - 甘露糖基、萄糖基等，其他糖基作為支鏈連接于主鏈之上。半纖維素與纖維素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的不同主要表現(xiàn)在：分子含有不同的糖基，主鏈可由一種糖基組成也可能有幾種不同的糖基組成，分子鏈短且存在側(cè)鏈。木聚糖是半纖維素中的主要組成成分 (.,1994) 。 維素酶的應(yīng)用 纖維素酶現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)、飼料加工等諸多領(lǐng)域。 在食品工業(yè)中，纖維素酶被應(yīng)用于提取水果汁和蔬菜汁。生產(chǎn)果汁的原料，有很多水果是極易腐爛的。許多熱帶水果不僅難于壓榨，而且其果汁帶有難以調(diào)和的酸澀味，不適用于單獨(dú)制作果汁飲料，必須要稀釋，和其他水果果汁一起調(diào)和口味。然而，有些熱帶水果和其他果汁一起調(diào)和后口感非常好。這樣的水果比如杏、桃、梨、李子、芒果、番石榴、番木瓜和香蕉。纖維素酶的使用不僅可以提高果肉的穩(wěn)定性，質(zhì)地和使果汁易于濃縮，而且還可以降低果汁的黏度，提高浸出率，減低浸出時(shí)間，提高營養(yǎng)價(jià)值 (,1996) 。近些年，隨著人們愈加關(guān)注健康，國際市場對橄欖油的需求日益高漲。萃取橄欖油的過程包括：（1 ）用壓榨機(jī)壓碎，碾磨橄欖。（2 ）將碾碎的糊狀碎塊送入攪拌器攪拌。（3 ）高速離心，獲得橄欖油(M,1998) 。通常 100 千克橄欖可以壓榨出 16克橄欖油。橄欖油的等級以含有的游離脂肪酸（量劃分(M,1998)，極純的（室溫或 37 放置 2 分鐘； 8) 12000溫離心 1 分鐘， 離心管中的液體即為回收的 段，可立即使用或存于備用。 段連接 1) 在一滅菌的微量離心管中，加入 體 3 倍外源 2) 加適量水，再加入 1l 10 1 l 總體積為 10l；混勻后與 16 連接過夜； 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 1) 取大腸桿菌 菌落，接種于 5 體培養(yǎng)基，于 37，200養(yǎng)過夜； 2) 取 1 1： 100 的稀釋比例倒入 100 37 振蕩培養(yǎng)17中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 34h ，使細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期（； 3) 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的 50菌離心管中，冰預(yù) 304 5000離心 5上清； 4) 每只離心管中加入 4菌體重懸，冰浴 304 、 5000上清； 5) 每只離心管中加入 1懸后分裝到無菌的 管 100l）； 6) 液氮快速冷凍后置70 冰箱長期保存。 粒 化大腸桿菌 1) 在 100輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰上放置 30 2) 將離心管放至 42 的循環(huán)水浴中 90 ) 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻； 4) 每管加 800體培養(yǎng)基，37 200 蘇 455) 取 50、 100、 200l 轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的 體培養(yǎng)基上（如要檢測 互補(bǔ)，應(yīng)預(yù)先在平板上涂好 X ，用一無菌的彎頭玻璃棒將菌液涂滿整個(gè)平板表面； 6) 將平板置于室溫下至液體被吸收； 7) 倒置平皿，于 37 培養(yǎng)，12可出現(xiàn)菌落。 白質(zhì)的 丙烯酰胺凝膠電泳（ 1) 溶液的配制 A. 30%丙烯酰胺凝膠母液（29 ：1 ）：丙烯酰胺 29g 甲叉雙丙烯酰胺 1g 用00 . 2上樣緩沖液： 1g 蔗糖 基乙醇 芬蘭 水定容至 25. 染色液：甲醇 45% （V/V ） 冰乙酸 10% （V/V ） 45%（V/V ） 考馬斯亮藍(lán) W/V ） D. 托色液：甲醇 45% （V/V ） 冰乙酸 10% （V/V ） 18中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 45%（V/V ） 2) 灌膠 A. 配制 10%分離膠溶液 9.9 0% 丙烯酰胺母液 8.3 6.3 0% 0% 過硫酸銨 體積 25 速灌膠，留出關(guān)注濃縮膠空間，小心用注射器在分離膠上覆蓋 1 厘米高的水，室溫聚合 40 分鐘。 B. 配制 5%濃縮膠溶液 5.5 0% 丙烯酰胺母液 1.3 1.0 0% 0% 過硫酸銨 體積 分離膠上灌注濃縮膠，插入梳子，室溫聚合 45 分鐘。 3) 樣品處理 a) 取蛋白樣品溶液 20l，加入等體積 2上樣緩沖液混勻，100 煮沸 3 2000心去除不溶物； b) 取 20 l 上清上樣電泳。 4） 電泳 8v/泳至染料前沿進(jìn)入分離膠，將電壓提高至 15v/續(xù)電泳至染料到達(dá)分離膠底部，下膠； 5） 染色，脫色 a) 加入至少 5 倍體積的染色液浸泡凝膠，放在平緩搖動(dòng)的搖床上室溫染色 4 個(gè)小時(shí)以上； b) 環(huán)脫色液，平緩搖動(dòng)，直至電泳條帶顯示清晰為止，其間為加快脫色效率可以更換脫色液； c) 脫色后凝膠可短暫保存于清水中或制作成干膠長期保存。 赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備 1) 挑取畢赤酵母受體菌的單菌落接種于 100 搖床培養(yǎng)過夜； 19中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 2) 再以 1%的接種量轉(zhuǎn)接于 5000 培養(yǎng)至； 3) 4 1500g 離心 5上清； 4) 500冷的無菌水將菌體重旋，4 1500g 離心 5上清； 5) 250冷的無菌水將菌體重懸，4 1500g 離心 5上清； 6) 20M 山梨醇重懸，4 1500g 離心，棄上清； 7) 沉淀溶于 1冷的山梨醇中，分裝為每管 80l，以備轉(zhuǎn)化。 酵母電擊感受態(tài)最好現(xiàn)用現(xiàn)制備。凍溶會(huì)使轉(zhuǎn)化效率大大降低。 母電擊轉(zhuǎn)化 因畢赤酵母表達(dá)載體為整合型載體，電擊轉(zhuǎn)化前載體需要做線性化處理。不同的酶切化宿主 ）會(huì)引發(fā)不同的位點(diǎn)和方式的整合，產(chǎn)生不同表型的轉(zhuǎn)化子，如下表所示： 限制性內(nèi)切酶 整合位點(diǎn)和方式 因型 在 入 在 5入 換 用 切重組表達(dá)質(zhì)粒，使其線性化； 2) 去 80l 感受態(tài)細(xì)胞與線性化質(zhì)粒（20 g）混合后轉(zhuǎn)移到冰冷的 擊杯中，點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞（1500V,25 F,200）; 3) 立即向電擊杯中加入 1冷的 1M 山梨醇，混勻后以每板 200l 菌液涂布于 板上； 4) 30培養(yǎng) 2，至長出轉(zhuǎn)化子。 母基因組的提取 z 破菌 1% 2% 100 10 1) 取過夜培養(yǎng)的 1母菌液，5000心 52) 沉淀中加入 1菌水，洗滌一次，離心； 3) 沉淀中加入 200l 破菌 烈震蕩； 4) 加入 200l 酚 /氯仿/ 異戊醇（體積比 25:24:1），劇烈震蕩，12000心 5上清； 5) 上清加入等體積氯仿，顛倒輕微震蕩，12000心 5 上清； 20中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 材料與方法 6) 上清加入 2 倍體積無水乙醇和 1/10 體積 3M 倒混勻，置于冷凍 107) 4 12000心，沉淀用 70%乙醇洗滌 2 遍，吹干，溶于 20l 水或 液，保存?zhèn)溆谩?母重組子的 測 z 用引物及退火溫度： 長引物： 56 5端缺失設(shè)計(jì)引物： 第一個(gè)： 56 第二個(gè)： 57 第三個(gè)： 57 第四個(gè)： 57 第五個(gè)： 57 3端缺失設(shè)計(jì)引物： 第一個(gè)： 60 第二個(gè)： 59 第三個(gè)： 60 z 酵母基因組 測所用酶購自華美公司 1) 50l 反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液5534 種 合物 10mM 44 版 ( 酵母基因組 1反應(yīng)混合液 95變性 5) 擴(kuò)增條件：94 變性 1不同引物相應(yīng)的退火溫度退火