密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 利用酵母雙雜交系統(tǒng)從番茄中篩選稻瘟菌激活蛋白的互作蛋白 士研究生：尚 威 指 導 教 師：邱德文 研究員 申請學位類別：理學碩士 專 業(yè)：生物化學與分子生物學 研 究 方 向：微生物分子生物學與基因工程 培 養(yǎng) 單 位：中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院 植物保護研究所 提交日期 2007 年 6 月 s. 007 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學院有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 論文評閱人、答辯委員名單 論文題目 利用酵母雙雜交系統(tǒng)從番茄中篩選稻瘟菌激活蛋白的互作蛋白微生物分子生物 生物化學與論文作者 尚威 專 業(yè) 研究方向?qū)W與基因工程 指導教師 邱德文研究員 培養(yǎng)單位（研究所） 植物保護研究所 碩 （博）姓名 職稱 單 位 專 業(yè) 簽 名 馮潔 研究員 碩導博導中國農(nóng)科院植保所 植物病理學 評 閱 碩導向華 研究員 中科院微生物所 分子微生物學 人 博導答辯 碩導李懷方 教授 中國農(nóng)業(yè)大學 植物病理學 主席 博導生物化學與 碩導李贊東 教授 中國農(nóng)業(yè)大學 分子生物學 博導碩導簡恒 教授 植物病理學 中國農(nóng)業(yè)大學 博導答 張春義 研究員 碩導博導中國農(nóng)科院生物所 分子生物學 辯 曾凡榮 研究員 碩導博導中國農(nóng)科院植保所 生物化學與 分子生物學 委 碩導博導員 碩導博導會議記錄（秘書） 楊秀芬 論文答辯時間地點 中國農(nóng)科院中日中心 116 房間 I 摘 要 激活蛋白是從多種真菌中分離、純化出的一類原發(fā)、外源性的蛋白激發(fā)子。不同來源的激活蛋白在理化性質(zhì)上略有差異，但生物學功能相近，具有較強的誘導抗病防蟲、促進植物生長等生物活性。然而目前對它們的信號傳導途徑等方面的作用機理研究還比較薄弱。稻瘟菌激活蛋白作為從稻瘟菌（中分離的一種激活蛋白，揭示其分子作用機理和植物體內(nèi)的受體蛋白具有十分重要的意義。 本論文借助酵母雙雜交技術(shù)，首先將稻瘟菌激活蛋白（基因 后篩選克隆在庫，以期獲得稻瘟菌激活蛋白的互作蛋白，最終實驗得到了十二組陽性克隆。 序列分析表明稻瘟菌激活蛋白可能影響了番茄的蛋白質(zhì)合成和修飾過程，并可能與一種植物肽類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)相互作用，促進植物細胞的生長和分化。在抗病機理方面發(fā)現(xiàn)：與稻瘟菌激活蛋白作用的4- 香豆酸 在苯丙烷類生物合成途徑中是關(guān)鍵酶，這就暗示激活蛋白可能影響了苯丙烷類生物合成途徑，同時影響黃酮類植保素、木質(zhì)素、水楊酸等與抗病有關(guān)的植物次生代謝物的生物合成，起到激發(fā)抗病防蟲功能的作用。 關(guān)鍵詞： 稻瘟菌激活蛋白，酵母雙雜交，蛋白互作 I a of is a of to of as in is It is a to of in In of D of by be in of a to In we 4 is a in an on It of to as to I 目 錄 第一章 引言 .獻綜述酵母雙雜交系統(tǒng) . 1 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 . 1 酵母雙雜交系統(tǒng)的類型 . 3 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢和局限性 . 3 酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 . 3 雙雜交的其他形式 . 5 酵母雙雜交系統(tǒng)的未來展望 . 7 究背景 . 8 蛋白激發(fā)子 . 8 過敏蛋白（ . 9 隱地蛋白（ . 10 激活蛋白（ . 10 究目的和意義 . 11 第二章 酵母雙雜交系統(tǒng)載體構(gòu)建和自激活作用檢測 .驗材料 . 13 株和質(zhì)粒 . 13 要試劑 . 14 規(guī)儀器 . 14 驗方法 . 14 因 . 14 化物 . 15 切物 . 16 收酶切產(chǎn)物 . 16 備誘餌質(zhì)粒載體. 17 餌載體的酶切和回收 . 18 建重組誘餌載體. 18 母感受態(tài)細胞的制備 . 19 組誘餌載體的酵母轉(zhuǎn)化及自激活作用檢測 . 19 果與分析 . 20 因的擴增 . 20 組誘餌載體酶切鑒定 . 20 序結(jié)果比對 . 21 激活檢測 . 22 結(jié)與討論 . 23 成功構(gòu)建重組誘餌融合質(zhì)粒. 23 無自激活作用 . 23 第三章 利用酵母雙雜交篩選稻瘟菌激活蛋白的互作蛋白 . 驗材料 . 24 株和文庫 . 24 要試劑 . 24 規(guī)儀器 . 24 驗方法 . 24 劑配制 . 24 母感受態(tài)細胞制備 . 27 庫質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化 . 27 平板 . 27 選文庫假定陽性共轉(zhuǎn)化子 . 28 母質(zhì)粒的提取 . 28 D/文庫質(zhì)粒插入片段 . 29 酶切物進行分組 . 30 腸桿菌電轉(zhuǎn)化 . 30 腸桿菌性質(zhì)粒提取 . 32 定陽性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與提取 . 32 D/文庫質(zhì)粒自激活的檢測 . 32 性質(zhì)粒的酵母雙雜交再次轉(zhuǎn)化驗證 . 32 性克隆的測序比對分析 . 32 果與分析 . 33 化效率 . 33 庫共轉(zhuǎn)化子的篩選 . 33 定陽性克隆的分組 . 34 性克隆的測序比對分析 . 34 結(jié)與討論 . 36 化效率 . 36 陽性的排除 . 37 對結(jié)果討論 . 37 用機理探討 . 38 第四章 結(jié)論 .考文獻 .謝 .者簡歷 .V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 基酸 活結(jié)構(gòu)域 甲基甲酰胺 甲基亞砜 NA 合結(jié)構(gòu)域 磷酸脫氧核苷酸 省成分添加劑 乳糖 氨酸 氨酸 合酶鏈式反應 子糖 導培養(yǎng)基，半乳糖和棉子糖作碳源 SD SD D 培養(yǎng)基：合成缺陷培養(yǎng)基，葡萄糖作碳源 SD 氨酸 游激活序列 嘧啶 哚- 半乳糖苷V 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 第一章 引言 獻綜述 酵母雙雜交系統(tǒng) 蛋白質(zhì)相互作用幾乎是所有生物學過程都必需的重要的生理過程，從遺傳物質(zhì)的復制、基因的表達調(diào)控到細胞的代謝過程、細胞的信號轉(zhuǎn)導，以及細胞與細胞之間的短程、遠程通訊，生物體的形態(tài)形成、病原微生物的致病、宿主對病原微生物的免疫等，蛋白質(zhì)相互作用都在其中扮演著重要的角色。蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)成為國內(nèi)外生命科學研究的熱點之一。 近十年來，多個諾貝爾生理醫(yī)學獎項目都與蛋白質(zhì)相互作用研究有關(guān)。一般認為諾貝爾獎對社會產(chǎn)生社會經(jīng)濟效益約需要40年左右時間，但蛋白質(zhì)及其相互作用研究在實際應用方面已經(jīng)顯示出了良好的前景。了解蛋白質(zhì)相互作用的方式、作用強度、作用結(jié)果，進行蛋白質(zhì)功能分析、生命發(fā)育探索，不僅具有重要的理論意義，還可以為探明致病微生物的致病機理，開發(fā)新藥，提高人民的生活質(zhì)量提供指導（唐澤耀等，2005 ）。 隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，目前研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)方法主要有酵母雙雜交系統(tǒng)（ 1989）、噬菌體展示技術(shù)（1985 ）、 et 2000 ；et 2002）、免疫共沉淀（ et 1995）、串聯(lián)親和純化技術(shù)（ et 1999；2001）、表面等離子共振技術(shù)（ et 1992）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（ ， 1948）、蛋白質(zhì)芯片（ et 2001）、射線晶體衍射、核磁共振等多種，這些技術(shù)為蛋白質(zhì)相互作用研究做出了重大貢獻，也積累了寶貴的資料。 酵母雙雜交系統(tǒng)自建立以來就成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強有力的方法之一，經(jīng)過不斷完善，如今不僅可以用來檢驗體內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互作用，還可以用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡的認識上發(fā)揮了重要的作用。據(jù) 2001年估計，當時已經(jīng)發(fā)表的研究蛋白質(zhì)相互作用的文獻中超過一半的發(fā)現(xiàn)來源于酵母雙雜交實驗（ et 2001）。 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代中后期的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有合結(jié)構(gòu)域(稱為和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(簡稱為，它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的（ 1984； et 1985； et 1986），單獨的然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄，而單獨的有它們在空間上彼此聯(lián)系時才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。同樣，不同來源的轉(zhuǎn)錄激活因子的能具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能（ 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 1985）。酵母雙雜交正是基于以上原理，將空間上可以分離，功能上相對獨立的兩個結(jié)構(gòu)域分別融入外源蛋白，與合的蛋白“X ”一般稱為“誘餌蛋白”(，與 ”一般稱為“獵物蛋白”或“靶蛋白”(or 。如果分別融合于餌蛋白”和“獵物蛋白”之間存在相互作用，那么而激活相應報告基因(的轉(zhuǎn)錄與表達。相反，通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，就可以判別“誘餌”和“獵物”兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用（圖1高寧& 胡寶成，2006 ）。 圖1母雙雜交原理 of ： 白形成融合蛋白， 合，但在缺少激活結(jié)構(gòu)域時，不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄； B：同樣，激活結(jié)構(gòu)域與Y 蛋白形成融合蛋白，但在缺少合結(jié)構(gòu)域時也不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄； C：X 蛋白和Y 蛋白之間的相互作用導致合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域的重組而形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子，激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。 2 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 酵母雙雜交系統(tǒng)的類型 目前，酵母雙雜交主要有兩套系統(tǒng)，主要區(qū)別在于轉(zhuǎn)錄因子組成和使用的報告基因不同。 989 ），是利用酵母的錄因子的和激活結(jié)構(gòu)域（以及使用為報告基因。因的表達產(chǎn)物可以通過在缺少組氨酸的培養(yǎng)基上生長來選擇相互作用的細胞。而統(tǒng)“ 作用陷阱”是由其同事們（ et 1993）建立的，是利用細菌的皰疹病毒大腸桿菌D 來作為轉(zhuǎn)錄因子的組分，這種非酵母轉(zhuǎn)錄因子組分的應用降低了其他方式產(chǎn)生的假陽性數(shù)量。同時用為報告基因，并且用誘導型啟動子使獵物有在相互作用時表達，因此降低了有毒獵物蛋白對細胞生長的抑制。 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢和局限性 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢：酵母是真核細胞，表達的蛋白可保持天然狀態(tài)下在細胞中產(chǎn)生相互作用，一定程度上代表了細胞內(nèi)的真實情況；易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒，而酵母菌能同時容納兩種質(zhì)粒；具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因；酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合，避免了對文庫編碼蛋白的干擾；具有高度敏感性，可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或瞬時性的相互作用；可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料來構(gòu)建分析細胞質(zhì)、細胞核及膜蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白；酵母菌有很多營養(yǎng)缺陷型標記，篩選方便。 酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性：有些誘餌蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的作用，使在無特異激活結(jié)構(gòu)域情況下激活轉(zhuǎn)錄；有些雜交蛋白質(zhì)不能穩(wěn)定地在酵母中表達或定位于酵母細胞核內(nèi)，比如有些蛋白質(zhì)相互作用通常要在細胞表面發(fā)生；有些合蛋白或者破壞了蛋白質(zhì)的正確折疊，從而影響了蛋白間作用的能力；有些蛋白質(zhì)的正確折疊、修飾和功能有賴于其它非酵母蛋白的輔助，這限制了某些胞外蛋白（如哺乳動物）和細胞膜受體蛋白等的研究；反之，在酵母中相互作用的哺乳動物蛋白并不一定反映其天然環(huán)境下的相互作用；有些蛋白質(zhì)本身對酵母細胞具有毒性作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 酵母雙雜交技術(shù)創(chuàng)立至今的十幾年中，在基因和蛋白質(zhì)研究中已得到廣泛應用，并取得了許多有價值的結(jié)果。除了在酵母中應用外，此項技術(shù)已擴展到哺乳動物和植物細胞的研究中（et 1992）。用酵母雙雜交技術(shù)鑒定的多種受體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、磷酸化酶、腫瘤發(fā)生蛋白、細胞骨架蛋白以及參與細胞周期調(diào)控的因子不勝枚舉（張樹民& 陳英碚，1999 ）。 3 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 檢驗已知蛋白質(zhì)之間的相互作用 檢驗已知蛋白間的相互作用，就是將已知的兩個蛋白基因分別克隆到求開放閱讀框正確，然后分別進行自激活檢測，最后共轉(zhuǎn)入酵母菌株中進行相互作用的檢驗。例如，在篩選大豆庫時，得到了與體相結(jié)合的兩個具有97 % 同一性的蛋白們具有參與植物光呼吸作用的一個重要的酶依賴 羥基丙酮酸還原酶) 特性，但是為了檢驗是否兩個或其中之一結(jié)合于受體于是將因克隆到體（上，與克隆在體(上的 因共表達，最終證明受體與 蛋白結(jié)合（et ，2002 ）。 研究蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域 可應用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測定了多種重要的結(jié)構(gòu)域（ et 1997；et ，1999），當證實了兩個蛋白有相互作用后，可以對其進行缺失實驗而找到相互作用發(fā)生所必須的氨基酸殘基。通過該方法還能研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。通常需要對待測蛋白做點突變或缺失突變的處理。 發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的信號傳遞途徑 用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白，是雙雜交系統(tǒng)目前應用最廣泛和最有價值的應用之一。戴良英等用酵母雙雜交系統(tǒng)研究了從擬南芥的茉莉素信號轉(zhuǎn)導鏈中分離得到的第一個基因 良英等， 2002）。 花青素生物合成途徑調(diào)節(jié)機制，并證實特異 子 與另一個 子及含與光誘導子 則不發(fā)生作用。他們認為 花青素生物合成基因有調(diào)節(jié)作用（et 2003）。嚴景華等應用酵母雙雜交技術(shù)，以誘餌蛋白，從卵巢文庫中篩選到了與IM 。并通過其他生物化學方法證明不與構(gòu)域結(jié)合?；プ饔玫陌l(fā)現(xiàn)為研究及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用打下了堅實的基礎（嚴景華等，2003）。齊兵等從人肺細胞系(互作用蛋白基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)與因一樣， 生長，誘發(fā)細胞凋亡，但效率比（齊兵等，2000 ）。 分析新基因的生物學功能 即以功能未知的新基因克隆在體上，酵母雙雜交篩選克隆在據(jù)篩選到的已知基因的功能推測該新基因的功能。已從基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了一族參與籠形蛋白包被小泡運輸?shù)闹参?南芥含 蛋白）。通過亞細胞結(jié)構(gòu)分級和免疫定位研究證實，現(xiàn)在內(nèi)膜系統(tǒng)，集中在籠形蛋白上。體外進行脂類結(jié)合鑒定法證明， 一結(jié)合在內(nèi)陷的小窩或內(nèi)吞小泡中累積的脂類家族。另外，免疫組織化學研究和肌動蛋白結(jié)合鑒定法分析表明： 調(diào)控沿肌動蛋白細4 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 胞骨架的膜泡運輸。酵母互補研究表明與了胞吞作用和肌動蛋白排列。通過酵母雙雜交篩選、免疫定位和體外結(jié)合鑒定法試驗證明，在輔助蛋白類蛋白間有一種新的相互作用。這種相互作用是通過域和輔助蛋白的富集脯氨酸區(qū)域介導的。輔助蛋白類蛋白通過激籠形蛋白包被的囊泡脫殼，這一反應明顯受生所抑制。因此，籠形蛋白包被囊泡分裂和脫殼過渡過程中起調(diào)節(jié)或支架作用（et ， 2001）。 尋找具有藥物治療作用的小分子多肽 通過雙雜交系統(tǒng)篩選和目標蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是藥物設計的目標，則有可能得到一些具有藥物治療作用的小分子多肽藥物。胡承香等通過將隨機段與而成功構(gòu)建了一個可篩選、擴增的酵母雙雜交隨機肽庫，可用于篩選和設計靶蛋白相互作用多肽，主要用于藥