密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 茶樹 因克隆與親環(huán)素基因 的鑒定及其表達(dá)分析 碩士研究生：張亞麗 指 導(dǎo) 教 師：陳 亮 申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士 專 業(yè)：茶 學(xué) 研 究 方 向：分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：中國(guó)農(nóng)科院茶葉研究所 提交日期 2007 年 6 月 2007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 本研究受 國(guó)家 863 計(jì)劃項(xiàng)目(2006浙江省“ 錢江人才” 計(jì)劃 (2006人事部和教育部留學(xué)回國(guó)人員科研基金(2005005資助 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)名單表 論文題目 論文作者 專 業(yè) 研究方向 指導(dǎo)教師 陳亮 培養(yǎng)單位（研究所） 茶葉研究所 姓名 職稱 碩 （博）導(dǎo)師 單 位 專 業(yè) 簽 名 張志芳 研究員 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所分子生物學(xué) 評(píng) 閱 人 梁月榮 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 茶樹分子生物學(xué) 答辯 主席 朱誠(chéng) 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物學(xué) 梁月榮 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 茶樹分子生物學(xué) 成浩 研究員 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 魯成銀 研究員 碩導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 江和源 副研究員 碩導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 答 辯 委 員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 會(huì)議記錄（秘書） 論文答辯時(shí)間地點(diǎn) I 摘 要 乙烯是一種重要的植物激素，參與植物整個(gè)生理過(guò)程。 成酶（1 化酶（1是植物乙烯合成過(guò)程中的重要酶，對(duì)乙烯的合成具有重要的調(diào)控作用，所以這兩個(gè)基因的研究具有理論與實(shí)際意義。 在茶樹新梢 庫(kù)測(cè)序所獲得的 礎(chǔ)上，利用 技術(shù)，克隆得到編碼這兩個(gè)酶的全長(zhǎng)基因序列，在 分別登錄為 中 1579 碼 478 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為 D，等電點(diǎn) 1237 碼 320 個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為 D，等電點(diǎn) 現(xiàn) 與柿樹中的同類基因同源性最高，親緣關(guān)系最近。這兩個(gè)基因的獲得為以后進(jìn)一步研究其在茶樹抗逆中的作用打下一定的基礎(chǔ)。 根據(jù)所得到的茶樹 因序列設(shè)計(jì)引物，利用為陽(yáng)性對(duì)照，取安吉白茶、6/8、杭州大葉、龍井長(zhǎng)葉、藪北、龍井 43 和福鼎大白茶 7 個(gè)品種在經(jīng)歷高溫和低溫，以及龍井43 在冬天不同時(shí)期樣品逆轉(zhuǎn)錄的 行 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 因的表達(dá)量與品種的抗逆性強(qiáng)弱有一定程度的相關(guān)性；在不同時(shí)期龍井 43 樣品中， 因的表達(dá)也有類似的結(jié)果。 親環(huán)素廣泛存在于多種生物體內(nèi)，在植物的發(fā)育和新陳代謝等生理過(guò)程中具有重要作用。通過(guò)對(duì)茶樹新梢 庫(kù)大量隨機(jī)測(cè)序，獲得了一個(gè)編碼親環(huán)素的全長(zhǎng)基因，在 錄，登錄號(hào)為 樹親環(huán)素基因 長(zhǎng) 949 中開放閱讀框全長(zhǎng) 495 碼蛋白質(zhì)含有 164 個(gè)氨基酸，分子量約為 電點(diǎn)約為 具備 5端非編碼區(qū)的“標(biāo)志及 3端非編碼區(qū)的”尾信號(hào)。其推測(cè)的氨基酸序列經(jīng)與 26條其他生物親環(huán)素蛋白氨基酸序列進(jìn)行 多序列聯(lián)配并以 現(xiàn)與水稻和小麥的相似性較高，達(dá)到 85%以上。根據(jù)親環(huán)素基因開放閱讀框序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了原核表達(dá)載體 在大腸桿菌 成功誘導(dǎo)出了一個(gè)分子量為 23 親環(huán)素融合蛋白。這將便于后期在基因以及蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步研究親環(huán)素蛋白在茶樹生理和調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮的作用。 關(guān)鍵詞： 樹 基因克隆 親環(huán)素 原核表達(dá) is of it in of 1CC 1in of in of on on of CS CS 579 bp in 78 D pI CO 237 bp in 20 D pI by CS CO to of do of on of in on CS CO 6/8, 3 of in in as 3 in as a CS CO of in of 3. in It in A of of 5364 W pI kD A “ a of of of 6 . on 5% of on of of to A 3kD in do to on in of 目 錄 縮略表 . 0 第一章 文獻(xiàn)綜述及研究思路 . 1 物 . . . . .環(huán)素基因研究概況 .樹中這三個(gè)基因相關(guān)研究 .物基因克隆的常用方法 . 簡(jiǎn)并 . . 表達(dá)序列標(biāo)簽法 .因表達(dá)的分析方法 .論文的研究目的及意義 .二章 茶樹. 11 料 . 11 驗(yàn)材料 . 11 用溶液 . 11 法 . 12 . . 端序列的獲得 . 端序列的獲得 . 不同茶樹品種、龍井 43 冬季不同時(shí)間.果與分析 . 19 . . 端序列的擴(kuò)增 . 端序列的擴(kuò)增 . 三段序列的拼接 . 茶樹. 進(jìn)化樹構(gòu)建 . . 不同時(shí)期龍井 43 中.論 . 27 第三章 茶樹. 29 料 . 29 法 . 29 . 不同茶樹品種、龍井 43 冬季不同時(shí)間.果與分析 . 31 . . . 進(jìn)化樹構(gòu)建 . . 不同時(shí)期龍井 43 中.論 . 37 第四章 茶樹親環(huán)素基因. 38 料與試劑 . 38 料 . 實(shí)驗(yàn)試劑 .法 . 38 樹新稍. 親環(huán)素基因的序列分析、多序列聯(lián)配及進(jìn)化樹構(gòu)建 . 親環(huán)素基因的原核表達(dá) .果與分析 . 41 環(huán)素基因克隆的鑒定 . 親環(huán)素蛋白的多序列聯(lián)配 . 親環(huán)素基因進(jìn)化分析 . 親環(huán)素基因的克隆與酶切鑒定 . 親環(huán)素基因表達(dá)載體的構(gòu)建 . 親環(huán)素基因誘導(dǎo)表達(dá) .論 . 45 第五章 全文結(jié)論與展望 . 47 文結(jié)論 . 47 望 . 47 參考文獻(xiàn) . 48 致 謝 . 54 作 者 簡(jiǎn) 歷 . 55 V 縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 酸 酸氧化酶 酸合成酶 卞青霉素 苷三磷酸 基對(duì) 磷酸二乙酯 化乙錠 達(dá)序列標(biāo)簽 丙基硫代半乳糖苷 種培養(yǎng)基 A 光值 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 哚- 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 第一章 文獻(xiàn)綜述及研究思路 茶樹原產(chǎn)中國(guó)，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它在我國(guó)已經(jīng)有四千多年的栽培歷史。茶葉為世界的三大無(wú)酒精飲料之一。茶葉中含有如兒茶素等多種次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人體有重要的保健作用，如抗菌抗病抗氧化、降血降壓降膽固醇等(et 1998) 。隨著茶葉的需求越來(lái)越大，消費(fèi)者對(duì)茶葉品質(zhì)要求也越來(lái)越高，所以選育優(yōu)良品種任重而道遠(yuǎn)。茶樹是一種多年生木本植物，傳統(tǒng)的茶樹育種周期比較長(zhǎng)、效率也不高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子輔助育種和基因工程育種也開始逐漸在茶樹上得到應(yīng)用，這不僅可以縮短茶樹育種的周期，也可以提高育種的效率。 基因序列的克隆是進(jìn)行基因工程育種研究的基礎(chǔ)與前提。選取茶樹一些與抗逆境相關(guān)重要功能基因（如乙烯生物合成相關(guān)基因）克隆其全長(zhǎng)序列，并有目的地研究其在不同品種與逆境條件下的表達(dá)差異，為從分子水平認(rèn)識(shí)其機(jī)理和利用基因工程手段培育抗逆茶樹新品種提供依據(jù)。 物 因研究概況 乙烯(是一種植物氣體激素，高等植物個(gè)體器官都能產(chǎn)生乙烯，但不同組織、器官和發(fā)育時(shí)期乙烯的釋放量都不相同。乙烯的生理作用非常廣泛，其對(duì)植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、果實(shí)成熟等有廣泛的影響，同時(shí)與逆境脅迫如機(jī)械傷害、冷害、漬水、病原菌入侵等方面有關(guān)；并參與植物細(xì)胞的程序性死亡，促進(jìn)花凋謝和 解；同時(shí)乙烯含量與脫落有密切關(guān)系。 乙烯的生物合成主要由蛋氨酸在腺苷蛋氨酸合成酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?， 1- 氨基環(huán)丙烷 酸合成酶（ 1用下形成 1酸（1 有氧條件下經(jīng) 1酸氧化酶（1催化形成乙烯。可在二?；D(zhuǎn)移酶作用下形成 失活的最終產(chǎn)物( 如圖1示) 。 成酶以及 化酶是乙烯合成過(guò)程中非常重要的關(guān)鍵酶，在植物體內(nèi)乙烯的生成量主要這兩個(gè)酶的活性大小決定，所以這兩個(gè)酶基因的研究非常廣泛。 1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 二?；D(zhuǎn)移酶 1物乙烯合成途徑示意圖 因克隆 (1)因的克隆 研究表明 多基因家族編碼，有多種同工酶，受多種因素調(diào)控，其在植物組織中含量很低，因而分離提純很困難( 黃瓊珍，1997) 。 早在番茄果皮組織中發(fā)現(xiàn)，但最早在夏南瓜中分離到編碼 基因(1989) 。自從 (1990) 從番茄果實(shí)的 庫(kù)中分離得到 來(lái)，目前已從筍瓜(et 1990) 、蘋果(et 1991)、馬鈴薯(et 1995) 、番茄( 張永清和邱并生，1992；劉傳銀和田穎川， 1998；劉中大， 1998)、香蕉( 金志強(qiáng)和彭世清， 1998；金志強(qiáng)等, 2001a, 2001b ； et 2006)、柑橘(et 1999) 、哈密瓜、桃( 金勇豐和張耀洲， 2000；鄒愛蘭和陳崇順， 2005)、獼猴桃( 徐昌杰等，2001) 、柿( 饒景萍等，2001 ；唐霞等，2005) 、玫瑰花瓣(et 2004) 、番木瓜(et 2005) 、菠蘿 (2006)、薄皮甜瓜( 郭慶勛等，2006) 等作物中克隆得到 成酶基因。 比較已發(fā)表的 因核苷酸和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)所有已知植物的 基因家族的編碼區(qū)內(nèi) 列都有約 60%的同源性，氨基酸序列同源性一般為 48% 97%，蛋白質(zhì)同源性為 50%95% ，分子量為 右。其中，最大的同源性部分在多肽的中部，差異最大的是在 C 端。 (2) 因的克隆 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 在同工酶，其基因由多基因家族編碼，化酶基因最早從番茄 庫(kù)中克隆出來(lái)(et 1988) ，現(xiàn)已從桃(et 1992) 、蘋果(et 1992) 、鄂梨(1992)、甜瓜(et 1996) 、哈密瓜( 陸璐和王鳴，2000)、柿果實(shí) (饒景萍等， 2002)、康乃馨 (張樹珍等， 2002a， 2002b)、櫻桃 (王俊英等， 2002)、香石竹( 余義勛等， 2002；劉會(huì)超等， 2005)、甘蔗 (王自章等， 2003；王愛勤等， 2006)、番木瓜(et 2004) 、蕪箐葉(et 2004) 、歐洲山毛櫸(et 2004)、河套蜜瓜( 邰麗華等，2004) 、香蕉 (Do et 2005；黃俊生等，2005) 、白蘭瓜( 楊甲定和鐘海文， 2005)、花椰菜( 陳銀華等， 2005)、粉蕉 (黃永紅等， 2006)、辣椒 (陳銀華等， 2006)、梨 (胡鐘東等， 2006)、酸橙 (吳波等， 2006)、富有柿果( 張麗等， 2007)等植物中克隆得到 化酶基因。 比較已報(bào)道的 基酸序列，發(fā)現(xiàn) 因編碼 320 個(gè)左右的氨基酸，最大的同源性部分也是在多肽的中部，差異最大的在 C 端。在多肽的中部其編碼氨基酸同源性均比 80%以上。 動(dòng)子研究 啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起重要的作用，目前對(duì)植物 因啟動(dòng)子的研究主要集中在果實(shí)相關(guān)基因啟動(dòng)子上。研究較深入的有番茄 因、因、多聚半乳糖酸酶 因和 2因的啟動(dòng)子，蘋果的果實(shí)成熟相關(guān) 因及 因啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子都與果實(shí)成熟過(guò)程中的基因表達(dá)有關(guān)，但彼此同源性很小, 僅在 29%以下。已有一些蛋白質(zhì)因子結(jié)合區(qū)及順式作用元件序列被確定，這些序列表明果實(shí)特異性表達(dá)相關(guān)順式元件和乙烯應(yīng)答反應(yīng)元件處于啟動(dòng)子的不同區(qū)域。通過(guò)構(gòu)建 因的 5和 3兩側(cè)的不同缺失類型及分析 因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)以上的 5區(qū)和一個(gè) 3區(qū)與果實(shí)成熟過(guò)程中 中與乙烯反應(yīng)有關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)位于，序列分析發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)區(qū)與 因啟動(dòng)子上的乙烯反應(yīng)區(qū)(存在多個(gè)短的同源序列(et 1992) 。從病原相關(guān)蛋白基因 啟動(dòng)子上游區(qū)鑒定出的部分序列與菜豆幾丁質(zhì)酶基因中應(yīng)答乙烯的元件有部分的同源性(et 1993) 。香蕉果實(shí) 因啟動(dòng)子區(qū)與番茄 因、因、果實(shí)特異性蛋白基因 果果實(shí) 因、因；獼猴桃 因啟動(dòng)子序列相比較，其相似性為 該啟動(dòng)子中雖未發(fā)現(xiàn)有與番茄 點(diǎn)及乙烯應(yīng)答元件相一致的序列，但功能表達(dá)研究表明，該基因 5旁側(cè)區(qū)確有啟動(dòng)子的功能，即指導(dǎo)基因在果實(shí)中特異性轉(zhuǎn)錄的活性(et 2001) 。 因表達(dá)研究 植物 因的表達(dá)受激素誘導(dǎo)。已報(bào)道的誘導(dǎo) 因的激素主要有生長(zhǎng)素(赤霉素（脫落酸(、乙烯、細(xì)胞分裂素等。誘導(dǎo) 因的激素僅見乙烯、 時(shí)機(jī)械傷害、漬水、臭氧、病原體侵染、光溫、干旱等環(huán)境脅迫以及植物在自然條件下開花、傳粉、果實(shí)成熟、衰老等過(guò)程均可誘導(dǎo)植物 因的表達(dá)。3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 植物 因在植物的營(yíng)養(yǎng)器官的表達(dá)上，以根部和葉片表達(dá)效果好。而在生殖器官上，花和果實(shí)均有表達(dá)，花以子房組織表達(dá)最為強(qiáng)烈，而果實(shí)以中柱組織表達(dá)最為強(qiáng)烈。 基因表達(dá)研究表明，大多數(shù) 因主要在轉(zhuǎn)錄水平上受調(diào)節(jié)，而 因不僅在轉(zhuǎn)錄水平上存在差異，在翻譯水平上也存在明顯差異。因的轉(zhuǎn)錄水平并不與 活性水平同步遞增。番茄 因家族中，各成員雖是同工酶基因，但在轉(zhuǎn)錄水平上，不同的條件或因素均可誘導(dǎo)不同的基因家族成員表達(dá)，且各成員在轉(zhuǎn)錄水平上也有差別，目前未發(fā)現(xiàn)有能在傷害型、激素型、成熟型三種條件下高效表達(dá)的 因。獼猴桃不同品種間乙烯釋放量差異較大，轉(zhuǎn)錄水平也不同，但 因 轉(zhuǎn)錄水平上沒有大的差異，說(shuō)明因的表達(dá)水平和翻譯水平的高低，可能是導(dǎo)致植物乙烯生成的組織差異性的主要原因之一，因的表達(dá)可能是在翻譯水平上協(xié)同其他因子調(diào)控成熟與衰老的進(jìn)程 。 在乙烯生物合成過(guò)程中，盡管 和 的活性都在不斷提高，與乙烯釋放量的增加趨勢(shì)一致，但兩種酶的基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化趨勢(shì)不同。 因的轉(zhuǎn)錄水平與酶活性及乙烯產(chǎn)量增加是一致的，但 因的轉(zhuǎn)錄水平并不總是反映到酶的活性水平上去(et 1997)，且不同的 因在轉(zhuǎn)錄水平上也有明顯的差異(et 1992) 。有研究表明，誘導(dǎo)乙烯合成達(dá)到高峰以后，乙烯產(chǎn)量會(huì)迅速下降，這可能是 或 活性下降的結(jié)果。但 活性的下降可能是 白質(zhì)迅速降解造成的(1992)，而 活性的下降則可能是其他生理因素造成的，其蛋白質(zhì)還可繼續(xù)積累(1992)。 基因研究 乙烯是控制果實(shí)成熟的主要激素，而 成酶和 化酶是控制乙烯合成的主要酶類，所以通過(guò)構(gòu)建 成酶和 化酶的反義基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因來(lái)抑制 成酶和 化酶的表達(dá)，從而控制乙烯的合成已成為一個(gè)熱點(diǎn)。 在番茄中有關(guān) 成酶的轉(zhuǎn)基因研究最多。（ 1991）將 成酶的反義基因?qū)敕阎腥カ@得轉(zhuǎn)基因植株；1994 年湯福強(qiáng)等也獲得了 成酶反義基因轉(zhuǎn)基因番茄植株并對(duì)其部分生理特性進(jìn)行了研究；劉傳銀等（1998 ）將 成酶 過(guò)農(nóng)桿菌途徑轉(zhuǎn)化番茄外植體獲得了表達(dá) 義 轉(zhuǎn)基因番茄植株，進(jìn)而獲得了耐儲(chǔ)藏轉(zhuǎn)基因番茄純合體系；張曉海等（2001）將 成酶反義 核酶嵌合 列重組于植物表達(dá)載體 43 中，用三親融合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌 404 中，葉盤法轉(zhuǎn)化番茄子葉，獲得了再生小植株。 在其他植物中，也有大量的轉(zhuǎn)基因研究。利用從番茄果實(shí)中分離得到的 成酶向置于 動(dòng)子的控制之下，轉(zhuǎn)入煙草進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致了反義基因的導(dǎo)入導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因煙草在組織培養(yǎng)過(guò)程中芽再生能力的增強(qiáng)，表明乙烯在芽形成過(guò)程中具有重要的調(diào)控功能( 馬慶虎和宋艷茹， 1997)；王春霞等(1997) 完成 成酶反義基因?qū)ξ鞴系倪z傳轉(zhuǎn)化；李天然等(1999) 將番茄 成酶反義基因轉(zhuǎn)化河套蜜瓜；鮑國(guó)強(qiáng)等（2002 ）人工合成番茄 U 3因上游啟動(dòng)