密 級 ： 論 文 編 號 ：中國農(nóng)業(yè)科學院學 位 論 文蓖 麻 蠶 體 液 胰 凝 乳 蛋 白 酶 抑 制 劑 調(diào) 查 及 其 基 因 克 隆 研 究 生 ： 趙 秀 振指 導 教 師 ： 趙 巧 玲 研 究 員申 請 學 位 類 別 ： 農(nóng)學碩士專 業(yè) ： 特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)研 究 方 向 ： 蠶分子生物學培 養(yǎng) 單 位 ： 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院 中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所提 交 日 期 207年 6月， ，207207獨 創(chuàng) 性 聲 明本人 聲 明 所 呈 交 的 論 文 是 我 個 人 在 導 師 指 導 下 進 行 的 研 究 工 作 及 取 得 的 研 究 成果。 盡 我所知， 除 了文中特別加以標注和致謝的地方外， 論 文中不包含其他人已經(jīng) 發(fā)表或撰寫過的研究成果，也 不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其它教育機構的學位或 證書而使用過的材料。與 我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作 了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日關 于 論 文 使 用 授 權 的 聲 明本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關保留、 使 用學位論文的規(guī)定， 即 ： 中 國農(nóng)業(yè) 科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤， 允 許論文被查閱和借閱， 可 以采用影印、 縮印或掃描等復制手段保存、 匯 編學位論文。 同 意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在 不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。(保 密 的 學 位 論 文 在 解 密 后 應 遵 守 此 協(xié) 議 )論文作者簽名： 時間： 年 月 日導師簽名： 時間： 年 月 日蛋白 酶抑 制劑 在自 然界 中無 處不 在， 它 們以 多種 形式 存在 于動 物、 植 物甚 至微 生物 的各 種 組織中 ， 主 要 的生 理功 能是 防止 不必 要的 蛋白 水解 。 胰 凝 乳蛋 白酶 抑制 劑 （ 是 絲 氨酸 蛋白 酶 抑制劑 的一 種， 對 維持 昆蟲 正常 的生 長發(fā) 育起 著重 要的 作用 。 同 時 也是 昆蟲 體內(nèi) 非細 胞免 疫系 統(tǒng) 的重要 組成 部分 。 蓖 麻 蠶是 我國 三大 產(chǎn)絲 昆蟲 之一 ， 對 其 體內(nèi) 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 劑的 研究 不但 有 助于蓖 麻蠶 本身 生理 、生 化的 研究 ，也 必將 對其 他野 生鱗 翅目 昆蟲 生理 、生 化 的研 究產(chǎn) 生重 要意 義 。本研 究通 過非 變性 聚丙 烯酰 胺凝 膠電 泳和 活性 染色 技術 ， 對 20個蓖 麻蠶 品種 血液 和同 一品 種不 同發(fā) 育時期 化 進行 了調(diào) 查。 由 于各種 不 同， 引 起遷 移速 度有 快慢， 在堿 性電 泳中 檢測到 7種 定 名為 電 點依 次減 小 ；在 酸 性電 泳中 檢測到 2種 I，定 名為 中 品 種所 共有 ， 表明 它們 是蓖 麻蠶 生長 發(fā)育 所必 需的 。 對 同一 蓖麻蠶 品系 不同 發(fā)育 時期 血液 顯 示，隨 5齡期 發(fā)育 ， 有 逐漸 遞增 的趨 勢。根據(jù)家蠶中編碼成熟 計引物，利用 8個蓖麻蠶品種的 果在 8個品種中克隆的基因相同，基因序列長為 189測編碼 62個氨 基酸 殘基 的成 熟蛋 白， 對 蛋白 結構 預測 表明 該蛋 白有 一個 典型的 。 核 苷 酸序 列同源 性比 較顯 示， 克隆 的序 列包 含了 編碼 家蠶 成熟 核 酸序 列。將蓖 麻蠶 隆 到表 達載體 轉(zhuǎn)化 大腸 桿菌 表達 菌株 ，并 用聲裂解后經(jīng) 導的重組蛋白主要以包涵體的形式存在 ，融 合蛋 白的 分子 量大 約為 15佳 誘導 時間為 8小時 。關 鍵詞： 蓖麻 蠶， 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 劑， 非變 性聚 丙烯 酰胺 凝膠 電泳 ，基 因克 I)第一章 緒論 .蛋白酶抑制劑研究背景 .蛋白酶抑制劑的研究進展 .抑 制劑 的分 類 .抑 制劑 的研 究與 應用 .蛋白 酶抑 制劑 在動 物中 的研 究與 應用 .植物 蛋白 酶抑 制劑 的研 究與 應用 .昆蟲 蛋白 酶抑 制劑 的研 究與 應用 .胰凝乳蛋白酶抑制劑研究進展 .蛋 白酶 .蛋 白酶 抑制 劑 .蛋 白酶 抑制 劑的 研究 .究的目的和意義 .料和方法 .實驗材料 .品 種 .菌 種 .及 試劑 盒 .養(yǎng) 基 .液 和緩 沖溶 液 .驗 儀器 和設 備 .常規(guī)實驗方法 .血 液的 收集 .量 提取 質(zhì)粒 .內(nèi) 切酶 反應 .分 離與 回收 . . .粒 的鑒 定 .丙 烯酰 胺凝 膠電 泳 .麻蠶血液中胰凝乳蛋白酶抑制劑多型性研究 .材料與方法 .主 要試 劑 .結果與分析 .血 液中 .不 同發(fā) 育階 段血液 變 化 .與 家蠶 血液 電泳 圖譜 比較 .討論 .麻蠶血液中 .材料和方法 .料 、菌 種、 載體 和試 劑 .脂肪 體總 .引物 設計 .目的 片段 的純 化和 回收 .重組 載體 的構 建 .序列 分析 .結果與分析 . .果 .隆 .析 .討論 .麻蠶胰凝乳蛋白酶抑制劑基因的原核表達 .材料和方法 .料 .法 .重組 表達 載體 的構 建 .重組 蛋白 的誘 導表 達及 表達 形式 的檢 測 .表達 條件 的優(yōu) 化 .結果與分析 .體 的構 建 .白 的誘 導表 達 .達 量與 表達 條件 的關 系 .討論 .文結論 .蓖麻蠶體液中胰凝乳蛋白酶抑制劑種類的調(diào)查 .蛋 白酶 蛋白 酶抑 制劑 的種 類 .期 的調(diào) 查 .胰 凝乳 蛋白 酶抑 制劑 的對 比調(diào) 查 .胰凝乳蛋白酶抑制劑的基因克隆和序列分析 .克隆基因的表達 . . 簡 歷 . 縮 略 表英 文 縮 略 表英 文 縮 略 表英 文 縮 略 表英文縮寫 英文全稱 中文名稱水 乙二 胺四 乙酸 二鈉硫 代 苷二 烷基 磺酸 納T 硫 蘇糖 醇性 聚丙 烯酰 胺凝 膠電 泳聚 丙烯 酰胺 凝膠 電泳白 酶抑 制劑凝 乳蛋 白酶 抑制 劑蛋 白酶 抑制 劑胰 蛋白 酶抑 制劑豆 蛋白 酶抑 制劑疫 缺陷 病毒轉(zhuǎn) 錄 聚合 酶鏈 式反 應合 酶鏈 式反 應鐘 /分 L 升mL 升h 時光 值補 脫氧 核糖 核酸使 核糖 核酸基 對道 爾頓芐 青霉 素抗 性那 霉素 抗性中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論1第 一 章 第 一 章 第 一 章第 一 章緒 論 緒 論 緒 論緒 酶 （ 幾乎 在所 有的 生物 體內(nèi) 都發(fā) 揮著 重要 作用 。 975認 為蛋白 酶不 僅僅 是一 種消 化酶 ， 而 且 在組 織和 器官 中具 有更 多的 功能 ； 他 指 出， 蛋 白 酶對 生物 體 是有益 的， 但 也 存在 著危 險性 。 為 了 避免 這種 危險 的產(chǎn) 生， 機 體 自身 形成 許多 調(diào)控 機制 ， 其 中 蛋 白酶抑 制劑 （ 是 研 究的 最多 、 最 廣 泛、 最 重 要的 一種 調(diào)控 機制 。 蛋 白 酶 抑制劑 與蛋 白酶 一樣 ， 是 自 然界 含量 最為 豐富 的蛋 白種 類之 一， 一 般 分子 量都 很小 ， 廣 泛分 布在 動物、 植 物甚 至微 生物 中 980。 1936年 936首 次 從 牛 的 胰 臟 ( 分 離 一 種 堿 性 蛋 白 酶 抑 制 因 子 （ 之 后 又從 大豆 中分 離了 一種 胰蛋 白酶 抑制 因子 ， 并 將 其純 化結 晶， 證 明 了兩種 均為 蛋白 質(zhì)， 由此 揭開 了蛋 白酶 抑制 劑研 究的 序幕 。 抑 制 劑 是 對 蛋 白 水 解 酶 有 抑 制 活 性 的 一 種 小 分 子 蛋 白 質(zhì) 或 多 肽 ,是蛋 白 酶 的 一 種 基質(zhì)， 它 能 夠與 酶的 活性 部位 和變 構部 位結 合， 形 成 穩(wěn)定 的復 合體 ， 從 而抑 制酶 的催 化活 性或 阻 止酶原 轉(zhuǎn)化 為有 活性 的酶 。 在 生 物體 內(nèi)一 系列 的生 理、 病 理 過程 ， 如 對 凝血 、 纖 溶 、 補 體 活化 、 感染、 細 胞 遷移 等方 面發(fā) 揮著 關鍵 性的 調(diào)控 作用 ， 同 時 也是 生物 體內(nèi) 免疫 系統(tǒng) 的重 要組 成部 分。 迄今為 止， 根 據(jù)蛋 白酶 抑制 劑所 作用 的酶 的活 性基 團的 不同 及其 氨基 酸序 列的 同源 性， 可 將蛋 白 酶抑制 劑分 為四 類 曲小 華等 ， 2003： 對 胰 蛋白 酶、 胰 凝 乳蛋 白酶 、 彈 性蛋 白酶 有抑 制作 用的 絲 氨酸（ 白酶抑制劑，對木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶有抑制作用的巰基 (白酶抑制劑 ， 對 膠原 酶起 抑制 作用 的金 屬 (白 酶抑 制劑 ,抑制 胃蛋 白酶 的酸 性 （ 蛋 白酶抑 制劑 。 其 中 絲氨 酸蛋 白酶 抑制 劑在 自然 界中 分布 的最 為廣 泛， 因 此 對其 研究 的也 最多 ， 目 前在其 作用 機理 、氨 基 酸序 列及 衍 射圖 譜方 面都 研究 的比 較清 楚。這 類 抑制 劑的 數(shù)量 最 多 ，根據(jù) 序 列 同 源 性 特 別 是 活 性 中 心 的 位 置 及 半 胱 氨 酸 數(shù) 目 和 二 硫 鍵 所 形 成 的 架 橋 結 構 又 被 分 為至少 16個家族 992。 和 家族研究的最多。 白 酶抑 制劑 是絲 氨酸 蛋白 酶抑 制劑 的主 要類 型， 它的 分子 內(nèi)通 常含有 7對二 硫鍵 ， 具 有 兩個 相同 或不 同的 蛋白 酶作 用的 活性 中心 。 目 前應 用最 多的 白酶抑制劑基因是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（ 它 有 兩 個 抑 制 活性中 心， 可 同時 競爭 性抑 制兩 個胰 蛋白 酶分 子。 白 酶抑 制劑 三維 結構 高度 保守 ： 由中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論2一個明顯的疏水核心、三對高度保守的二硫鍵架橋、三鏈 端螺旋以及一個 袁春 華 ,梁宋 平， 2003。 和 家族 是一 類創(chuàng) 傷誘 導類 型表 達的 蛋白 酶抑 制 劑982。其中 家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑 （ ,） ,只有 一個 活性 中心 ，主 要抑 制胰 凝乳 蛋白 酶。 家族 包括 馬鈴 薯蛋 白酶 抑制 劑 （ ,）和 番 茄蛋 白酶 抑制 劑 （ ,） ,有兩 個活 性中 心， 可同 時抑 制胰 蛋白 酶和 胰凝 乳蛋 白酶 。 由于 絲氨 酸蛋 白酶 抑制 劑的 活性 位點 的突 變頻 率比 較高 ， 所 以 導致 抑制 劑特 性的 變化 ， 同 時顯示 了這 些突 變體 可能 對機 體的 防御 系統(tǒng) 有重 要的 調(diào)節(jié) 作用 ， 因 此 ， 它 們 在哺 乳動 物、 植 物 和 昆蟲中 被研 究的 最多 ，并 且在 許多 領域 得以 開發(fā) 和應 用。 酶抑制劑在動物中的研究 與 應用 蛋 白酶抑制劑在動物中的研究 與 應用 蛋 白酶抑制劑在動物中的研究 與 應用蛋 白酶抑制劑在動物中的研究 與 應用高等 動物 的血 液中 存在 多種 蛋白 酶抑 制劑 ，每 100中 ，各 種蛋 白酶 抑制 劑的 總量超過 200980。通常認為，血液中存在的高含量的抑制劑對血液的凝結和其他蛋 白水 解的 形成 進程 如激 素的 產(chǎn)生 、 釋 放 和補 體的 定位 具有 重要 的作 用。 廣 譜的 蛋白 酶抑 制 劑可抑制體內(nèi)廣泛分布的絲氨酸蛋白酶活性 ,起到調(diào)節(jié)炎性細胞因子釋放、抑制血細胞激活和白細胞跨內(nèi)皮遷移、減少炎細胞浸潤以及組織毒性物質(zhì)釋放等作用 ,表現(xiàn)為多層次的抗炎效應。近年來的 研究 發(fā)現(xiàn) 蛋白 酶抑 制劑 能通 過抗 過氧 化反 應、 抗 蛋 白水 解、 保 存 細胞 能量 、 抑 制炎 性介 質(zhì) 釋放等 多種 方式 發(fā)揮 功效 ,減輕 器官 損傷 和炎 性損 傷。蛋白 酶抑 制劑 具有 抗炎 抗感 染的 作用 。在 臨 床上 應用 最廣 的 主要 是胰 蛋白 酶抑 制劑 （ I）， 主要 有： 人 尿胰 蛋白 酶抑 制劑 （ 從 牛 肺 或 牛 胰 臟中提 取的 抑肽 酶 （ 及 人 工合 成的 假黃 酸胍 己苯 酯及 衍生 物。 其 中 許 多對 急性胰 腺炎 起關 鍵作 用的 酶， 如胰 蛋白 酶、 磷脂 酶 A、胰 凝乳 蛋白 酶及 彈性 蛋白 酶等 ，并 能抑 制溶酶體 酶， 穩(wěn)定 溶酶 體膜 ，從 而起 到保 護胰 腺的 作用 ； 制 腦血 管通 透性 增高 的作 用， 防止腦 血管 破裂 后遲 發(fā)性 腦血 管痙 攣， 預防 肺、 腦缺 血再 灌注 引起 的損 傷 凌賢 龍， 1992。動 物臟器中 提取 的抑 肽酶 是一 特異 性的 蛋白 酶抑 制劑 ， 在 臨 床上 用于 治療 胰腺 炎， 肺 氣 腫， 腦 水 腫， 腦 、肺、腸 缺 血再 灌注 損傷 ，心 臟 ，子 宮 等術 后出 血，燒 、燙 傷 外用 及腫 瘤的 輔助 性治 療 蔡祖 花 ,2000。蛋白 酶抑 制劑 有抗 病毒 感染 的作 用， 可抑 制 、 感染 新細 胞及 復制 所必 需的 蛋白 前體的 裂解 ，阻 止病 毒前 體多 聚蛋 白質(zhì) 的分 裂， 并干 擾新 的病 毒顆 粒的 成熟 ，使 不 太成熟、 無感 染性 的病 毒顆 粒， 并導 致病 毒繁 殖的 停止 ，阻 止病 毒的 幾率 約 99%。同 時由 于病 毒顆 粒仍處 于未 成熟 狀態(tài) 中，故 可延 遲在 間 的 蔓 延 。 人巨 細胞 病毒 ( 皰 疹 病 毒 ， 為 絲氨 酸蛋 白酶 類， 在 裝配 蛋白 產(chǎn)生 和病 毒殼 體成 熟中 有重 要作 用， 所 以 抑 制劑是 最有 前景 的抗 病毒 類藥 物。 此外 ，蛋 白酶 抑制 劑還 可阻 止發(fā) 生新 的感 染病 灶，延 緩 疾病 的進 展。主 要表 現(xiàn)在 抗腫 瘤方 面 ，如從 人尿 中提 取的 胰蛋 白酶 抑制 劑可 與腫 瘤細 胞上的 合 ， 調(diào) 節(jié)纖 維蛋 白酶 的活 性， 從而抑 制腫 瘤細 胞的 浸潤 和轉(zhuǎn) 移。 抑 肽酶 也可 以作 為腫 瘤的 輔助 治療 藥物 。 巰 基 蛋白 酶抑 制劑 可 對中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論3胃癌 體外 侵襲 轉(zhuǎn)移 具有 抑制 作用 沈潔 等， 1999。在禽 類的 蛋清 中也 存在 蛋白 酶抑 制劑 卵類 粘蛋 白和 卵清 蛋白 酶抑 制劑 。 卵 類 粘蛋 白可 抑制豬 、 羊 和 牛的 胰蛋 白酶 的活 性， 但 對 人的 胰蛋 白酶 活性 無抑 制作 用。 卵 清 蛋白 酶抑 制劑 可抑 制牛和 羊的 胰蛋 白酶 及糜 蛋白 酶的 活性 。它 們 的存 在可 以防 止蛋 白質(zhì) 的分 解，阻 止 細菌 在蛋 中繁 殖 ，因而 具有 保護 蛋黃 和卵 胚的 作用 。它 們也 是攝 食生 禽蛋 后不 易消 化和 易引 起腹 瀉的 原因 。蛋白酶抑制劑的研究 與 應用 植 物蛋白酶抑制劑的研究 與 應用 植 物蛋白酶抑制劑的研究 與 應用植 物蛋白酶抑制劑的研究 與 應用來自植物天然的蛋白酶抑制劑基因本身就是植物對害蟲及病原菌侵染的一種天然防御體系。早在 1947年， 些 昆蟲 在取 食大 豆后 就不 能正 常生 長、 發(fā) 育 。 之后 中 分離 出一 種抑 制物 ， 證 明 是一 種胰 蛋白 酶抑 制劑 ， 這 一 發(fā)現(xiàn) 啟示 人們 蛋白 酶抑 制劑 可 以作為 一種 新的 抗蟲 物質(zhì) ，從 此人 們開 始了 對蛋 白酶 抑制 劑抗 蟲的 研究 。表 白酶 抑制劑 及其轉(zhuǎn) 基因 葉 片在 正常 情況 下蛋 白酶 抑制 劑的 含量 很低 ， 當 它 受到 蟲害 或機 械損 傷時 ， 其 含 量 可在幾 小時 內(nèi)明 顯增 加， 主 要是 植物 在受 到蟲 害或 病原 菌侵 害時 ， 誘 導 了某 些組 織產(chǎn) 生蛋 白酶 抑 制劑， 這些 抑制 劑能 影響 昆蟲 消化 道內(nèi) 蛋白 酶的 分泌 ，從 而抑 制害 蟲對 植物 組織 的食 用 994， 是 一 類特 殊的 組織 創(chuàng)傷 誘導 型表 達蛋 白酶 抑制 劑 ,這種 誘導 表達 貫穿 著植 物的 一生 ， 但是它 的 誘 導 能 力 隨 著 植 物 體 的 成 熟 日 益 減 弱 這是 植 物 體 在 生 長 和 繁 殖 之間所尋 求的 一種 平衡 。 植 物 體幼 小時 ， 蟲 害 對它 來說 是致 命的 ， 所 以它 只能 合成 大量 的蛋 白酶 抑 制劑， 如 許 多植 物的 種子 、 果 實 、 以 及 一些 塊根 、 塊 莖 中都 含有 大量 的蛋 白酶 抑制 劑。 對 食性 比 較專一 的食 草性 害蟲 而言 ， 由 于 體內(nèi) 蛋白 酶的 種類 單一 ， 容 易 受到 蛋白 酶抑 制劑 的作 用， 而 雜 食 性害蟲，其體內(nèi)有多種蛋白水解酶，不異受到蛋白酶抑制劑的抑制。 白酶抑制劑影 響昆 蟲神 經(jīng)系 統(tǒng)、 免 疫 系統(tǒng) 和蛻 皮過 程， 因 此 蛋白 酶抑 制劑 是最 有優(yōu) 勢的 作物 抗性 基因 。 自蛋白酶抑制劑 靶標害蟲 獲得的轉(zhuǎn)基因作物豆絲氨酸蛋白酶抑制劑 ) 鞘翅目、鱗翅目 煙草、馬鈴薯、番茄、油菜麥胰蛋白酶抑制劑 ) 鱗翅目 煙草瓜胰蛋白酶抑制劑 ) 鱗翅目 煙草豆胰蛋白酶抑制 ) 鞘 翅 目 、 鱗 翅 目 、 直翅目 煙草 、 馬 鈴 薯 、 番 茄 、 甘 薯 、 水 稻、 油菜菜絲氨酸蛋白酶抑制劑 ) 鱗翅目 煙草、擬南芥稻疏基蛋白酶抑制劑 ) 鞘翅目、同翅目 煙草、油菜豆絲氨酸蛋白酶抑制劑 ) 鱗翅目 煙草、馬鈴薯鈴薯蛋白酶抑制劑 I) 鱗翅目、直翅目 煙草鈴薯蛋白酶抑制劑 I) 鱗翅目、直翅目 煙草、水稻豆 鱗翅目 煙草、馬鈴薯I(番茄蛋白酶抑制劑 I、 I) 鱗翅目 煙草、番茄芋蛋白酶抑制劑 ) 鱗翅目 煙草中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論4從 1987年英國 用 農(nóng)桿 菌葉 盤轉(zhuǎn) 化法 ，首 次 將豇 豆蛋 白酶 抑制 劑 ( 目前為止，至少有 15種不 同來 源的 蛋白 酶抑 制劑的 。 其 中主 要是 絲氨 酸蛋 白酶 抑制 劑， 因 為 許多昆 蟲尤 其是 鱗翅 目昆 蟲腸 道中 主要 的消 化蛋 白酶 是絲 氨酸 蛋白 酶。 （表 一 些已 被 克隆的植物蛋白酶抑制劑基因和轉(zhuǎn)基因植物）。實驗證明這些轉(zhuǎn)基因植株對昆蟲都有明顯的抗性。尤其是 且抗 蟲譜廣，對鱗翅目、鞘翅目、直翅目等幾乎所有的昆蟲都有殺傷作用。 豆的 為多基因家族，可抑制不同來源的胰蛋白酶的活性，尤其是對鱗翅目有較強的抑制作用 李海燕等， 2000。 巰基蛋白酶抑制劑（）對玉 米根 部害 蟲和 根結 線蟲 有明 顯的 抑制 作用 。蛋白酶抑制劑的研究 與 應用昆蟲作為地球上出現(xiàn)最早、種類最多的動物群體，在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要的位置。在長期的進 化過 程中 ， 它 自 身形 成了 獨特 的防 御體 系。 由 于昆 蟲體 內(nèi)沒 有高 等動 物所 具有 的淋 巴細 胞 和免疫 球蛋 白， 所 以分 解異 物的 酶， 特 別是 蛋白 酶及 調(diào)控 昆蟲 體內(nèi) 蛋白 酶作 用的 蛋白 酶抑 制劑 更 是引起 了人 們的 關注 。 蛋白 酶 是 所 有 昆 蟲 體 液 中 最 重 要 的 生 化 酶 類 ， 其 主 要 的 功 能 是 在 昆 蟲 的 生 長 、 發(fā) 育 、 蛻皮和變 態(tài) 過 程 中 參 與 蛋 白 質(zhì) 的 降 解 和 合 成 ， 而 蛋 白 酶 的 活 性 又 受 蛋 白 酶 抑 制 劑 （ 調(diào) 節(jié) 。 關于昆蟲蛋白酶抑制劑研究的歷史比較短 ,最初也只是對昆蟲體液中粗提液的蛋白酶抑制因子進行調(diào)查 ,后來 才漸 漸用 純化 的樣 品。 1960報 道 了 來 自 蛔 蟲 （ 內(nèi) 的 蛋白 酶抑 制劑 。 森田 等 森田 敏照 ， 吉 川 秀夫 ， 1961在家 蠶幼 蟲血 液分 離純 化了 一種 對 胰凝乳 蛋白 酶和 胰蛋 白酶 有抑 制作 用的 蛋白 酶抑 制劑 。 果 蠅 （ 液中純化了一種可抑制牛 對胰蛋白 酶 沒 有 抑 制 活 性 ， 穩(wěn) 定性 都很 高 1974,1980。 975實驗 證明在 7個不 同目 昆蟲 血液 中有 蛋白 酶抑 制劑 的存 在， 這 些 抑制 劑中 多數(shù) 對注 射到 血液 中 的滅活 菌有 抑制 作用 ， 并 且 隨著 致死 濃度 的增 加它 們對 胰蛋 白酶 、 胰 凝 乳蛋 白酶 、 鏈 酶蛋 白酶 胞 桿菌 銅綠 素胞 外蛋 白酶 的抗 性也 增強 ， 認 為 這些 抑制 劑可 能是 昆蟲 血液 中抗 菌防 御系 統(tǒng)的一 種活 性因 子。 麻蠅 (發(fā) 現(xiàn)多 種可 以抑 制血 球半 胱氨 酸蛋 白酶 活性 的 蛋白酶 抑制 因子 族 并 純化 了其 中的 一種 抑制 因子 ，發(fā) 現(xiàn)該 抑制 因子在 3齡幼 蟲蛻皮 后及 圍蛹 殼完 成之 后， 有 增 加的 傾向 煙 草 天蛾 （ 幼 蟲 中也 存 在 多 種 抑 制 劑 ， 兩 種 分 子 量 分 別 為 14000000 制 劑 已 經(jīng) 被 純 化 998，這兩 種抑 制劑 對 性 都很 高 ,酸 序列 與牛 胰蛋 白酶 抑制 劑相 同。990從煙草天蛾幼蟲血液中純化了四種絲氨酸蛋白酶抑制劑，這四種蛋白酶抑制劑 中， 一 種對 豬的 胰肽 酶和 牛的 胰凝 乳蛋 白酶 有抑 制作 用， 另 外兩 種對 胰凝 乳蛋 白酶 有特 異 性的抑 制作 用， 另 一種 則對 胰蛋 白酶 的活 性有 特異 的抑 制性 。 這 些 蛋白 酶抑 制劑 都是 昆蟲 自身 產(chǎn) 生的調(diào) 節(jié)性 的抑 制因 子， 對 自身 的酶 有調(diào) 節(jié)作 用， 將 編碼 這些 抑制 劑的 基因 倒入 作物 中也 能阻 遏 昆蟲的 正常 的生 理代 謝， 產(chǎn) 生對 害蟲 的抗 性。 目 前已 經(jīng)成 功轉(zhuǎn) 入作 物中 的昆 蟲蛋 白酶 抑制 劑基 因 見（表 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論5表 昆蟲 的抗蟲 基因在 植物 中的表 稱糜蛋白酶、 胰乳酶、 是胰腺分泌的 一種蛋白水解酶，具有肽鏈內(nèi)切酶的作用 ,能切斷蛋白質(zhì)肽鏈中酪氨酸、苯丙氨酸的羧基端肽鏈 ,專一水解芳香族氨基酸 (酪氨酸、色氨酸、亮氨酸 )或大的非極性脂肪族側鏈的氨基酸的羧基形成的肽鍵。胰凝乳蛋白酶在生物體內(nèi)首先合成無催化活性的胰凝乳蛋白酶原，具有 5對二硫鍵的單肽鏈蛋白， 當受到胰蛋白酶的作用后， 這種高活性的 它們再與其他的 使另一分子 的 ， 形成穩(wěn)定的 A、B、 活性只有 ，酶活性中心的氨基酸殘基來自 B、 同，王鏡巖，生物化學）。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶都可以消化溶解變性蛋白質(zhì)， 對 未變性的蛋白質(zhì)無作用， 因 此能分解炎癥部位纖維蛋白的凝結物 ,促進血凝塊、 膿性分泌物及壞死組織的溶化分解 ,從而 凈化創(chuàng)面 ,促進組織新生和傷口愈合 實用藥物手冊， 1982，在臨床上對抗炎、防止水腫、積血、扭傷水腫、術后浮腫、中耳炎、鼻炎等具有良好的作用。但胰凝乳蛋白酶 比胰 蛋白 酶的能力 強， 毒性 低， 副作 用小 ，所 以在 臨床 上具 有更 大的 應用 前景 。 胰蛋 白酶 和胰 凝乳 蛋白 酶都 屬于 絲氨 酸蛋 白酶 ， 在 生 物體 的多 種組 織和 器官 中發(fā) 揮重 要作 用 ，但如果不正常釋放也會導致病理反應， 為 避免這種情況， 有 機體通過積累特異性的蛋白酶 抑制劑來調(diào)節(jié)這些酶的作用。 蛋 白酶 抑制 劑屬 于絲 氨酸 蛋白 酶抑 制劑 ， 它 的 主要 作用 是停 止、 阻 止或 降低 胰凝 乳 蛋白酶 活性 ， 根 據(jù) 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 劑的 結構 和分 子量 ， 將 其 分為 兩大 類： 一 類 是小 分子 量的 蛋 白酶抑制劑，主要有 一類是大分子量的蛋白酶基因產(chǎn)物 靶標害蟲 轉(zhuǎn)基因植物煙草天蛾中的反式糜蛋白抑制劑 同翅目 煙草、棉花煙草天蛾中的反式彈性蛋白酶抑制劑 同翅目 苜蓿、棉花、煙草制劑 鱗翅目 馬鈴薯煙草天蛾的反式胰蛋白酶抑制劑 同翅目 棉花、煙草煙草天蛾的幾丁質(zhì)酶抑制劑 鱗翅目 煙草中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論6抑制 劑， 主要有 小分 子量 的胰 凝乳 蛋白 酶抑 制劑 通常 含有 多個 二硫 鍵， 結 構非 常穩(wěn) 定， 通 常是 以單 體或 結 構域的 形式 存在 。 劑 約有 50個氨 基酸 殘基 ， 主 要 是對 胰凝 乳蛋 白酶 、 彈 性 蛋白 酶和 枯草桿 菌蛋 白酶 起抑 制作 用 001。 抑 制劑 有兩 個獨 立非 重疊 的 活性位點，分別對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制活性，這類抑制劑的核心區(qū)域有 18個氨基酸殘基是 不可 缺少 的， 序 列中 其余 氨基 酸殘 基的 替換 率相 當高 ， 顯 示 了它 們在 機體 防御 中有 重要 調(diào) 節(jié)作 用 。 蛋 白酶 抑制 劑，在 氨 基酸 序列 中分 散有 數(shù)個 半胱 氨酸 殘基 ， 形 成 幾個 二硫 鍵 ，這種 結構 決定 了它 有較 強的 熱穩(wěn) 定性和 1947。 制 劑主 要是 具有的 絲氨 酸蛋 白酶 抑制 劑，這 種 類型 的抑 制劑 分子 量較 大，一 般為 40 350酸 組成 ， 并 具 有高 度保 守的 三級 結構 ， 具 有 活性的 制 劑有 多種 構象 ， 包 含 了一束 螺旋 和 折疊 形成 多個 結構 域的 交迭 ，活 性中 心環(huán) 常位 于肽 鏈的 通常有 20個氨