密級(jí) :無 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 蘇云金芽胞桿菌 相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)與功能研究 F 摘 要 蘇云金芽胞桿菌（ 稱 其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而成為 農(nóng)業(yè)生物防治上 應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物。 其它芽胞桿菌相比，一個(gè)顯著特 點(diǎn)就是在形成芽胞的同時(shí)，還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的伴胞晶體。有關(guān) 胞 晶體形成機(jī)制方面的研究主要是集中在殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)調(diào)控 上 ，而從代謝調(diào)控的角度研究晶體 蛋白 形成的分子機(jī)制目前尚 未 見 報(bào)道 。本論文圍繞蘇云金芽胞桿菌 中與 關(guān)基因 簇 的 結(jié)構(gòu)和功能 進(jìn)行了 一系列的研究，主要內(nèi)容包括： 本研究從國內(nèi)分離得到的蘇云金芽胞桿菌 因 ，并 分別在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)和純化。酶活測(cè)定 結(jié)果表明， 氨基酸序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)在蠟樣芽胞桿菌 群 （ B. 中具有較高的相似性，而與枯草芽胞桿菌的相似性 較低， 分別為 58%、 51%。 利用基因敲除技術(shù)分別構(gòu)建了 株的 因缺失突變株，同時(shí)也構(gòu)建了相應(yīng)的回復(fù)突變株，對(duì) 因的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明： 因敲除不會(huì)影響突變株在豐富培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)，但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含 因缺失突變株的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制； 因敲除對(duì)晶體 蛋 白 的 表達(dá)量無顯著 影響，但 體 蛋白 的 表達(dá) ； 因敲除 均 會(huì)導(dǎo)致 芽胞 產(chǎn) 量 的降低 。 通過對(duì) 株 因簇的克隆及序列分析發(fā)現(xiàn)， 因簇的 結(jié)構(gòu) 與大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的 明顯 不同，而在 蠟樣芽胞桿菌群 中基本上是一致的，說明 結(jié)構(gòu) 在 蠟樣芽胞桿菌群 中 是比較 保守 的。通過 錄分析發(fā)現(xiàn) 中 獨(dú)轉(zhuǎn)錄 ，而 其上游的轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因 根據(jù)克隆并測(cè)序的 因簇序列， 分別克隆了 因的啟動(dòng)子，并構(gòu)建了相應(yīng)的 合表達(dá)載體。通過 苷 酶活性的定性和定量分析，表明 因 的轉(zhuǎn)錄 都 是由 自身的啟動(dòng)子 調(diào)控的 。 以上研究 結(jié)果 表明 因 屬于不同的轉(zhuǎn)錄單元 ，而 因組成了一個(gè)操縱子 。 利用 敲除 載體 源重組方法敲除 變 株 發(fā)現(xiàn)突變菌株的生長(zhǎng)、產(chǎn)芽胞和晶體 蛋白 的能力與出發(fā)菌株相比并無明顯差異。但 因的缺失嚴(yán)重地影響了 活性，并通過其回復(fù)突變株恢復(fù)了 活性，說明 因?qū)σ?的表達(dá)起正調(diào)控作用。 同樣地，發(fā)現(xiàn) 因?qū)?因 的表達(dá) 也 起正調(diào)控作用 。通過對(duì) 因的表達(dá)產(chǎn)物 白 的結(jié)構(gòu)域分析， 推測(cè) 它可能是一種依賴于 54 因子的激活蛋白，在 蠟樣芽胞桿菌群 中 比較 保守，有關(guān)其調(diào)控作用需進(jìn)一步的驗(yàn)證。 總之， 本研究為深入研究蘇云金芽 胞 桿菌 為進(jìn)一步研究芽胞和伴胞晶體形成機(jī)制提供了線索。 關(guān)鍵詞 ：蘇云金芽胞桿菌 ， 殺蟲晶體蛋白 ， 琥珀酸半醛脫 氫酶 ， 因簇 ， 基因 表達(dá)調(diào)控 as Bt is on of of in is In of t We . 03 . by By of in . 03 . 68 8% 1%, To of t by of of of in of in of of in in of t is . . is . by It is . in We of by to an of of in in in a in to by a 54to it is . by in to be In a be to to of . 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 目 錄 緒 論 . 1 1 蟲晶體蛋白 . 1 態(tài)描述 . 1 理生化機(jī)制 . 2 子生物學(xué)研究 . 3 2 芽胞桿菌 . 7 . 8 . 9 . 9 . 10 謝途徑的生理功能 . 11 3 微生物功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容與方法 . 12 能基因組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容 . 12 因功 能的研究方法 . 13 4 本研究的立題依據(jù) . 21 5 本研究的目的和意義 . 21 第一章 關(guān)基因的克隆、表達(dá)及 同源性分析 . 22 1 材料與方法 . 22 驗(yàn)材料 . 22 究方法 . 26 2 結(jié)果與分析 . 34 珀酸半醛脫氫酶 因的鑒定 . 34 珀酸半醛脫氫酶的表達(dá)與純化 . 34 珀酸半醛脫氫酶的活性檢測(cè) . 36 基酸序列同源性分析 . 38 3 討論 . 39 4 小結(jié) . 41 第二章 因缺失突變株的篩選及鑒定 . 42 1 材料與方法 . 42 驗(yàn)材料 . 42 究方法 . 44 2 結(jié)果與分析 . 51 2.1 因缺失突變菌株的構(gòu)建與鑒定 . 51 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 2.2 因缺失突變菌株的構(gòu)建與鑒定 . 55 2.3 因回復(fù) 突變株 的構(gòu)建與篩選 . 57 發(fā)菌株、突變株和回復(fù)菌株的生長(zhǎng)特性比較 . 58 變株對(duì)晶體蛋白表達(dá)的影響 . 58 變株對(duì)芽胞形成的影響 . 61 3 討論 . 61 t 晶體蛋白的提 取 . 61 用 法測(cè)定 體蛋白的含量 . 62 4 小結(jié) . 62 第三章 操縱子的鑒定 . 63 1 材料和方法 . 63 驗(yàn)材料 . 63 究方法 . 64 2 結(jié)果與分析 . 69 2.1 克隆與序列分析 . 69 2.2 析 . 69 2.3 啟動(dòng)子鑒定與融合表達(dá) 分析 . 70 3 討論 . 74 . 74 動(dòng)子的識(shí)別與克隆方法 . 74 4 小結(jié) . 75 第四章 因缺失對(duì) 因表達(dá)調(diào)控的影響 . 76 1 材料和方法 . 76 驗(yàn)材料 . 76 究方法 . 77 2 結(jié)果與分析 . 78 白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及序列同源性分析 . 78 除載體 構(gòu)建與鑒定 . 82 2.3 因缺失突變株的篩選與鑒定 . 84 變株 功能恢復(fù) . 85 變株的生長(zhǎng)特性 . 85 變株產(chǎn)芽胞和晶體能力的分析 . 86 2.7 因缺失突變對(duì) 活的影響 . 87 3 討論 . 88 胞桿菌中的 54 因子 . 88 錄激活因子的調(diào)控作用 . 88 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 4 小結(jié) . 89 第五章 結(jié) 論 . 90 參考文獻(xiàn) . 91 致 謝 . 105 作者簡(jiǎn)歷 . 107 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 插圖與附表 插圖和附表 緒 論 圖 1 蘇云金芽胞桿菌中的芽胞和晶體 1 圖 2 意圖 8 圖 3 枯草芽胞桿菌中 因簇的組織結(jié)構(gòu) 10 圖 4 蘇云金芽胞桿菌 7株 因簇的結(jié)構(gòu) 示意圖 10 圖 5 B. B. B. 株親源關(guān)系遺傳進(jìn)化樹 15 圖 6 同源重組雙交換原理示意圖 18 圖 7 聯(lián)系 制與染色體動(dòng)力學(xué)之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)示意圖 20 第一章 表 1菌株和質(zhì)粒 23 表 1因擴(kuò)增引物序列 27 表 1 白 酶活測(cè)定結(jié)果 38 圖 1因 增結(jié)果 34 圖 1重組表達(dá)載體 建流程圖 35 圖 1重組表達(dá)載體 切鑒定結(jié)果 35 圖 1合蛋白鎳柱親和層析純化 泳圖 36 圖 1重組表達(dá)載體 建流程圖 37 圖 1重組表達(dá)載體 切鑒定結(jié)果 37 圖 1合蛋白谷胱 苷 肽瓊脂糖親和層析純化 泳圖 38 圖 1芽胞桿菌 屬中 A） 和琥珀酸半醛脫氫酶 （ B） 系統(tǒng)進(jìn)化 分析 39 第二章 表 2菌株和質(zhì)粒 43 表 2引物序列表 45 表 2出發(fā) 菌株、突變菌株、回復(fù)菌株活芽胞記數(shù)差異顯著性分析 61 圖 2敲除載體 建 流程圖 46 圖 2因敲除過程示意圖 47 圖 2回復(fù)載體 建 流程圖 51 圖 2敲除載體 酶切及 測(cè) 53 圖 2失突變菌株的 選結(jié)果 54 圖 2失突變菌株的 定結(jié)果 54 圖 2因突變株 因組 析 54 圖 2敲除載體 酶切及 測(cè) 56 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 插圖與附表 圖 2失突變菌株的 定結(jié)果 57 圖 2因突變株 因組 析 57 圖 2復(fù)載體 酶切鑒定及 測(cè) 58 圖 2復(fù) 突變 轉(zhuǎn)化子 58 圖 2發(fā) 菌株 、 突變菌株和回復(fù)菌株生長(zhǎng)曲線比較 59 圖 2發(fā) 菌株與突變菌株不同時(shí)期晶體蛋白 表達(dá) 的比較 59 圖 2發(fā) 菌株 、 突變菌株和回復(fù)菌株 表達(dá) 體蛋白的 測(cè)結(jié)果 60 第三章 表 3菌株 與質(zhì)粒 63 表 3引物序列表 65 表 3株 列注釋結(jié)果 69 圖 3重組質(zhì)粒 構(gòu)建流程圖 68 圖 3株 因簇的 增結(jié)果 68 圖 3株 因簇的結(jié)構(gòu)示意圖 70 圖 3因轉(zhuǎn)錄 果 70 圖 3因轉(zhuǎn)錄 果 70 圖