淺析細菌內毒素檢測方法及常見問題,1,內容,細菌內毒素簡介細菌內毒素檢測方法常見問題及解決方案,2,一、細菌內毒素簡介,主要內容來源特性與熱源的關系在藥檢中應用,3,主要來源主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當細菌死亡或自溶后便會釋放出內毒素，其化學成分主要是脂多糖，這是一種大分子物質，分子量約為106，其粒徑約在15納米。細菌內毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內毒素的量為1至100EU/ml。,4,主要特性（實驗器材處理方法）1.耐熱性一般在100加熱1小時無影響，120加熱4小時能破壞98，180200干熱2小時或250干熱半小時才能完全破壞。故：注射劑的一般滅菌條件是不能破壞內毒素的。2.不耐酸堿性內毒素可被強酸、強堿和氧化劑破壞。故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡,5,主要特性（實驗器材處理方法）3.水溶性與不揮發(fā)性熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。故：不可用濕熱滅菌法處理實驗器具,6,主要特性（去除內毒素方法）4.濾過性原體積很小，約在15nm之間，故能通過除菌濾器而進入濾液中，但不能通過石棉濾板，也不能通過半透膜。5.吸附性能被活性炭吸附劑吸附。內毒素在溶液中帶有一定的電荷，因而可被某些離子交換介質吸附。,7,熱原=內毒素？熱原指微生物產生的某些多糖蛋白復合物等使人體發(fā)熱的物質，不僅僅是細菌內毒素。但在藥檢的范疇，細菌內毒素是主要的熱原物質，可以說無內毒素就無熱原，控制內毒素就是控制熱原。,8,熱原檢查方法簡介中國藥典熱原檢查方法是采用家兔升溫法進行檢查。將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規(guī)定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。,9,熱原檢查法,10,與熱源對比內毒素檢查法優(yōu)勢方便、快捷、經濟；重現性好、靈敏度高；避免抗原的產生，克服生物測定的誤差；近年來已經普遍采用細菌內毒素檢查法，逐漸替代了熱源法,11,在藥檢中的應用細菌內毒素檢查作為控制藥品質量的一種方法，已經廣泛的被世界各國藥典收載。成品檢查藥品安全性檢查之一半成品（生產過程）檢查事前質控手段，避免造成藥品成批報廢,12,二、細菌內毒素檢測方法,中國藥典批準使用方法：供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。但當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關原理。,測定方法,凝膠法,光度測定法,濁度法,顯色基質法,13,鱟試劑與內毒素反應機理,內毒素,C因子,活化的C因子,凝膠,B因子,凝固酶原,凝固酶,活化的B因子,凝固蛋白原,鱟凝血系統(tǒng)酶聯反應,14,名詞解釋1鱟及鱟試劑,鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內毒素形成特異凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內毒素濃度有關，是體外檢測內毒素的敏感試劑。,15,16,名詞解釋2國家標準品及工作標準品,國家標準品：（單位：EU/ml）自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價；工作標準品：經國家標準品稀釋用于試驗中鱟試劑靈敏度符復核、干擾試驗及各種陽性對照；,17,名詞解釋3細菌內毒素檢查用水,凝膠法：內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水；故：滅菌注射用水細菌內毒素檢查用水光度法：內毒素含量應小于0.005EU/ml；,18,細菌內毒素檢測之凝膠法,實驗程序1、試驗準備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復核4、供試品干擾試驗（新藥或新方法）5、供試品細菌內毒素凝膠法檢測,19,實驗材料及用具1、儀器,2、器具,20,試劑1、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準文號2、內毒素工作標準品3、內毒素檢查用水4、75乙醇常用英文縮寫B(tài)ET：細菌內毒素檢查BET水：細菌內毒素檢查用水MVD：供試品最大有效稀釋倍數NC：陰性對照MVC：供試品最低有效濃度PC：陽性對照：鱟試劑靈敏度L：供試品細菌內毒素限值,21,靈敏度復核試驗：每批鱟試劑用于檢測前都必須進行靈敏度復核。目的是為了對試劑、檢測者的操作、環(huán)境條件、水平條件進行驗證。以證實操作正常無誤，準確可靠和結果可信。試驗舉例：內毒素工作標準品為90EU/支；待測鱟試劑靈敏度0.25EU/ml。1、制備內毒素標準溶液：取工作標準品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進行稀釋，步驟如下(箭頭下方為加入BET水量)：,90EU/ml,10EU/ml,1EU/ml,0.5EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml,0.0625EU/ml,0.2ml,1.6ml,0.2ml,1.8ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,22,0.2ml,0.2ml,1ml,1ml,1ml,1ml,水,水,溶解后的標準品,水,水,水,水,90EU/ml,10EU/ml,1EU/ml,0.5EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml,0.0625EU/ml,（2）,（）,（0.5）,（0.25）,23,2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標示量加入BET水溶解，再取0.1ml分裝于標準玻璃試管（10mm75mm），將試管按如下形狀排列。3、加樣：每列每支加入相應濃度的內毒素標準品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。,12,2,30.5,40.25,BET水,2,2,2,2,0.5,0.5,0.5,0.5,0.25,0.25,0.25,0.25,24,反應及結果判斷：加樣結束后用封口膜封口，輕振動混勻，置37水浴中保溫602min，將每管拿出緩緩倒轉180，凝膠不變形為“”，凝膠不能保持完整為“”。當2.0四支管都為陽性，0.25四支管都為陰性時，試驗成立，按下面底公式計算復核的靈敏度c：clg-1(X/4)（X:反應終點濃度的對數值。）當0.5c2.0時，鱟試劑靈敏度復核合格，檢測時仍以標示靈敏度為準。,25,左側管旋轉180凝膠不能保持完整為陰性，記為“”；右側管旋轉180凝膠不變形為陽性，記為“”。,26,舉例：設待復核的鱟試劑標示靈敏度為0.125EU/ml:,clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（-0.903）（-1.22）（-1.22）/40.104（EU/ml）c在0.52.0范圍內，符合規(guī)定。,27,方法學驗證供試品干擾預試驗目的：確證產品對方法是否存在干擾（抑制或增強），得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾稀釋倍數，為正式干擾實驗提供依據。影響因素：新藥檢查方法建立；鱟試劑批號或來源的改變；檢品生產工藝，配方，成分的改變；檢品關鍵成分來源的改變；,28,方法學驗證供試品干擾預試驗,供試品溶液的最大稀釋倍數的計算MVDCL/L:供試品的內毒素限值；C：供試品溶液的濃度；當L以EU/ml表示時，C為1ml/ml;當L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當L以EU/ml表示時，C的值不是樣品的濃度，就是1)。,29,方法學驗證供試品干擾預試驗,內毒素限值(L)的確定藥典附錄有相應計算公式，即當今世界各國普遍采用的細菌內毒素計算公式，即：L=K/M，式中K為按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時可以接受的不產生任何不良反應的細菌內毒素劑量（亦稱致熱閾），它基本上是一固定值，藥典上對每一給藥途徑的K值都有具體的規(guī)定。M為按規(guī)定的給藥途徑，人每公斤體重每小時給藥的最大劑量。這一個值的確定實際上才是計算限值的關鍵。,30,方法學驗證供試品干擾預試驗,（1）原則上一般根據藥品使用說明書或國家藥典委員會編制的臨床用藥須知來確定最大劑量。如兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為準。（2）為保證安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯合用藥的藥品藥品，可根據計算值適當調整，嚴格至計算限值的1/2或1/3。,31,方法學驗證供試品干擾試驗目的：驗證預干擾中確定的濃度或倍數下的供試品對于鱟試劑與內毒素的反應有無干擾作用。試驗方法：須選擇兩家以上的鱟試劑進行試驗,32,方法學驗證供試品干擾試驗結果判定：如果有供試品和無供試品測得的鱟試劑靈敏度（c）均在0.5-2.0范圍內時，則認為供試品在該濃度下不干擾試驗，否則需要對供試品做適當處理。干擾的排除：對供試品進行更大倍數的稀釋；選擇靈敏度更高的鱟試劑；其他適宜的方法如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。,33,供試品細菌內毒素凝膠法檢測檢測方法：結果判定陰性陽性陽性陰性,注：A無干擾濃度供試品溶液；B供試品陽性對照；C陽性對照；D陰性對照。,34,三、常見問題及解決方案,1、實驗前未復核鱟試劑產品的靈敏度鱟試劑靈敏度的改變或質量不符合要求，會影響實驗結果，因此實驗前應復核鱟試劑產品的靈敏2、實驗器具的潔凈度不符合要求一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新鮮蒸餾水沖洗三道，并干熱（250）恒溫1h即可。實驗用的玻璃器具必須嚴格無菌無熱原，建議不要使用一次性塑料制品。,35,3、實驗條件達不到要求實驗室要求潔凈，無塵?？諝饬魍ǎ羰强照{室，應備有一臺超凈工作臺。4、溫度不符合要求實驗室溫度為252較好，恒溫水浴箱溫度為371為宜。5、忽視樣品本身干擾,36,供試品若經干擾試驗證實存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個重要原則是不能影響供試品中的內毒素生物活性。(1).供試品稀釋法MVD=CL/鱟試劑靈敏度()越高(數值越小)，供試品的稀釋倍數越大，干擾越小。,37,(2).物理方法如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇)(3).化學方法如調節(jié)PH值(奎諾酮類)、調節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP)(4).生物方法如抗增液的使用，阻斷G因子反應，防止假陽性；(5).其它方法如過濾法、溶劑抽提等,38,6、鱟試劑濃度達不到要求開啟內毒素標準品和鱟試劑時，要將粘附在安瓿壁上的粉末盡可能地彈落下去。用砂輪劃過安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾異丙醇的無紡布，以避免產生假陽性結果）擦拭，防止開啟時玻璃屑落入安瓿內。開啟內毒素標準品時，要在安瓿曲頸上部，并盡可能保留較長的安瓿頸，準確加入1.0ml鱟試驗用水復溶。,39,7、細菌內毒素混合不均勻（1）.內毒素工作標準品溶解后要在旋渦混合器混合15分鐘，以后的每一步稀釋前要至少混合30秒，其它國家藥典也有類似要求；（2）.具有兩極活性的內毒素分子在水中呈現不均勻