細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),CellCulture,病理（腎臟）實(shí)驗(yàn)室白潔,細(xì)胞培養(yǎng),概念：取動(dòng)物組織，在體外，無菌條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境（營養(yǎng)、溫度、pH值、氣體），對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠生存、生長、保持原來生物學(xué)特性的一種實(shí)驗(yàn)方法。,內(nèi)容,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn),一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,實(shí)驗(yàn)室條件：環(huán)境、設(shè)備、器材、試劑實(shí)驗(yàn)操作者工作范疇：無菌操作、溫育、培養(yǎng)液配置、洗刷、無菌處理、細(xì)胞和用品儲(chǔ)存等back,實(shí)驗(yàn)室條件,無菌環(huán)境儀器設(shè)備普通器材一般試劑,無菌室結(jié)構(gòu)模式圖,back,儀器設(shè)備,超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮罐、低溫冰箱、重蒸水裝置、負(fù)壓真空泵、普通冰箱、消毒鍋、烤箱、水浴鍋、天平等back,二氧化碳培養(yǎng)箱back,超凈工作臺(tái)back,倒置顯微鏡,back,液氮罐,back,普通器材,玻璃瓶皿：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管、抽慮瓶等塑料瓶皿：多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等,back,一般試劑,培養(yǎng)液平衡鹽液消化液抗生素液pH調(diào)整液back,back,培養(yǎng)液,使用培養(yǎng)液：天然培養(yǎng)基5-20%合成培養(yǎng)基80-95%附加成分再加適量抗生素液，調(diào)整pH值即可back,天然培養(yǎng)基,小牛血清胎牛血清組織提取液back,合成培養(yǎng)基,RPMI1640Eagle培養(yǎng)液：DMEM、MEM、IMDMHamF12、HamF10、PC199Mc-Coy5Aback,附加成分,促貼壁物：層粘連蛋白等激素：胰島素、氫化考的松、GH等生長因子：ECGF、NGF、FGF等酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制劑等back,平衡鹽液,HanksD-HanksEarlePBSHBSSback,消化液,胰蛋白酶(0.125-0.25%)膠原酶(0.1-0.3mg/ml)EDTA(0.01-0.02%)back,抗生素液,鏈霉素(100ug/ml)青霉素(100單位/ml)制霉菌素(100單位/ml)終濃度不超過萬分之一為宜back,pH調(diào)整液,5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOHback,無菌操作,洗手著裝近火焰操作試劑瓶等斜放,實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,清洗：玻璃、塑料、橡膠、金屬類等消毒：無菌室、培養(yǎng)用液、培養(yǎng)器皿（玻璃、塑料、橡膠、金屬）等,清洗示意圖,白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品,back,消毒方法,物理消毒法：射線、紫外線、干熱、濕熱、過濾、煮沸等化學(xué)消毒法：乳酸、甲醛、過氧乙酸、新潔爾滅、乙醇等抗生素滅菌,二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本內(nèi)容,細(xì)胞傳代培養(yǎng)*細(xì)胞凍存與復(fù)蘇*,細(xì)胞計(jì)數(shù),血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：自動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)算：以活細(xì)胞計(jì)數(shù)；成團(tuán)細(xì)胞算一個(gè)細(xì)胞數(shù)4大格細(xì)胞數(shù)/4104個(gè)/ml壓線細(xì)胞計(jì)數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右,常規(guī)觀察,培養(yǎng)液：顏色：含有指示劑酚紅，顏色反應(yīng)PH值新鮮的正常：PH7.27.4，桃紅色；培養(yǎng)后，細(xì)胞產(chǎn)酸，變黃，需換液；透明度：清亮透明，混濁多為污染（懸浮細(xì)胞除外）,培養(yǎng)液短期內(nèi)變黃：,1、是否有細(xì)菌污染；2、可能培養(yǎng)皿沒清洗干凈，有殘留物；3、細(xì)胞生長太快；4、細(xì)胞接種量過大。,細(xì)胞的生長狀態(tài),貼壁細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有1-2個(gè)核仁，在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。,懸浮細(xì)胞圓形，可以單個(gè)細(xì)胞或聚集成團(tuán)生長；細(xì)胞透亮，核、膜分界清楚；可大量繁殖，鏡下可見分裂期細(xì)胞；肉眼可見在培養(yǎng)瓶中可沉底，輕輕晃動(dòng)后均勻分布；培養(yǎng)基清亮。培養(yǎng)生長不好時(shí)，聚集成團(tuán)的細(xì)胞少，生長慢，細(xì)胞有皺縮、破碎、透光性降低等現(xiàn)象。,微生物污染,傳代或換液后24h48h可觀察到；細(xì)菌、真菌污染的典型表現(xiàn)：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂浮有菌絲或細(xì)菌；支原體污染：不明顯，細(xì)胞生長明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)，但培養(yǎng)液多不發(fā)生混濁。,細(xì)胞凍存與復(fù)蘇,細(xì)胞凍存（緩慢）細(xì)胞復(fù)蘇（快速）,凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融,細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。,細(xì)胞凍存方法,配制凍存液：20%血清培養(yǎng)基10%DMSODMSO溶解要產(chǎn)熱，應(yīng)提前配，避免傷細(xì)胞。DMSO的作用收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入適量凍存液,用吸管吹打成細(xì)胞懸液（11065106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍批號(hào)。,慢凍程序,原則：當(dāng)溫度在-25以上時(shí)，12/min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)，510/min；當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中。GMP程序：將冷凍管（管口朝上）放入紗布袋內(nèi)，4冰箱0.5h；20冰箱0.5h；70冰箱0.5h；轉(zhuǎn)入液氮。簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。,細(xì)胞復(fù)蘇方法,（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心5分鐘。（