疫苗免疫佐劑,Vaccine adjuvant,Vaccine adjuvant,自從1925 年法國(guó)免疫學(xué)家Ranmon 發(fā)現(xiàn)在疫苗中加入某些與之無(wú)關(guān)的物質(zhì)可以特異性地增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)以來(lái), 至今免疫佐劑的發(fā)展已近80年。特點(diǎn):佐劑本身可以有抗原性；也可以不具備抗原性。,Vaccine adjuvant,一、佐劑（Adjuvant）：能非特異性地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異 性免疫應(yīng)答，發(fā)揮輔佐作用的物質(zhì)。佐劑作用： 使抗原緩慢釋放 延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)停留時(shí)間 擴(kuò)大抗原的表面積 促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng) 增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬與抗原提呈,vaccine adjuvant,二、佐劑的類(lèi)型：油水乳劑：礦物油、乳化劑微生物及代謝產(chǎn)物：脂多糖、分支桿菌、霍亂毒素等細(xì)胞因子：白介素、干擾素等脂質(zhì)體：膽固醇類(lèi)蜂膠：蜂蜜人工合成：胞壁酰二肽,vaccine adjuvant,1.具備免疫原性的佐劑：如卡介苗、枯草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。2.不具備免疫原性的佐劑：如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、多聚核苷酸、胞壁肽等。,vaccine adjuvant,應(yīng)用最多的是福氏佐劑、細(xì)胞因子佐劑。 （1）福氏佐劑：完全福氏佐劑（石蠟油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐劑（石蠟油+羊毛脂）兩種。（2）細(xì)胞因子佐劑：細(xì)胞因子佐劑與抗原合用，可有效激發(fā)機(jī)體的免疫功能。IL-2、IL-1、IFN、IL-12、GM-CSF。經(jīng)典的鋁鹽佐劑，在提高抗體水平和安全方面已獲得長(zhǎng)期的實(shí)踐證實(shí)。人類(lèi)疫苗基本采用此佐劑。,vaccine adjuvant,三、新型佐劑油/水乳劑型；顆粒型；微生物衍生物型佐劑。,vaccine adjuvant,油/水乳劑型佐劑：MF59、AS02、Montani2de ISA251 和ISA2720，是一類(lèi)油包水或水包油型乳化劑。MF59是在高壓條件下將鯊烯與Tween 80和Span 85混合后進(jìn)行微流化進(jìn)而形成均一的小滴狀乳液。AS02 是一種含有單磷脂A (MPL)和皂角苷(QS221)的油包水乳劑,能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答并伴有Th1 型和CTL 反應(yīng)。,Vaccine adjuvant,顆粒型佐劑：將抗原輸送系統(tǒng)與疫苗抗原復(fù)配或融合后形成顆粒狀物質(zhì)，顯微鏡下呈顆粒狀。鋁鹽氫氧化鋁、磷酸鋁等的不溶性膠狀沉淀, 顆粒大小100-1000nm, 免疫原通過(guò)靜電與膠結(jié)合。安全性佳, 靶向良好, 貯存作用中等, 誘導(dǎo)強(qiáng)Th2應(yīng)答, 常見(jiàn)強(qiáng)IgE應(yīng)答, 但誘導(dǎo)CTL和CM1作用很弱。價(jià)廉, 易制備。,Vaccine adjuvant,新型顆粒型佐劑種類(lèi)：病毒顆粒( virosome ) 聚乙交酯( PLG) 微粒免疫刺激復(fù)合體( immune responsestimulatincomp ISCOMs)脂質(zhì)DC-Chol,Vaccine adjuvant,病毒顆粒：是一種具有免疫增強(qiáng)作用的重構(gòu)病毒樣顆粒,是由病毒表面糖蛋白與磷脂嵌合形成的150nm脂蛋白體。聚乙交酯( PLG) 微粒：生物可降解和生物相容性的PLG是研究顆粒佐劑的主要材料,既可包裹抗原蛋白實(shí)現(xiàn)蛋白疫苗的投遞,有效控制抗原的釋放,也可作為DNA 疫苗的有效佐劑。ISCOMs微粒: 皂苷、膽固醇和磷脂組成的復(fù)合物,形成直徑約40nm球型結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)內(nèi)的皂苷與膽固醇結(jié)合而不與細(xì)胞膜表面結(jié)合。已用于獸用疫苗。脂質(zhì)-膽固醇（DC-Chol）：膽固醇和磷脂組成的單層或多層脂雙層膜囊結(jié)構(gòu)，親脂及兩性分子與膜結(jié)合親水分子包在膜內(nèi),脂質(zhì)體將可溶性抗原轉(zhuǎn)變成顆粒性抗原, 其粒徑大小、電荷和抗原結(jié)合能力可隨不同組份比例而變化。,Vaccine adjuvant,非顆粒性佐劑胞壁酞二肽及衍生物(MDP)：分枝桿菌肽聚糖中具佐劑活性的部分， MDP為致熱原, 與其人工合成而無(wú)毒性的衍生物都可誘導(dǎo)IL-1。親水性衍生物傾向刺激Th2, 而親脂性衍生物傾向刺激Th1。,Vaccine adjuvant,非離子阻斷共聚物：由疏水的聚氧丙烯和聚氧乙烯側(cè)向聯(lián)接而成, 后者占5%-20%，分子量2500-12500。用作添加劑加入w/o或o/w的油相中能促進(jìn)雙性分子提呈, 也有免疫調(diào)節(jié)作用, 但不能生物降解而致注射局部反應(yīng)。,Vaccine adjuvant,皂昔系：從皂樹(shù)Quillaja saponaria：樹(shù)皮提取的三菇類(lèi)混合物, Quilla A和spikoside為其部分純化物, 為精制物。皂昔能誘導(dǎo)對(duì)某些蛋白強(qiáng)和應(yīng)答、中等應(yīng)答, 可能是由于生成了蛋白一皂昔混合小體的結(jié)果。 Quilla A已廣泛用作獸用佐劑并提議用于人體, 它價(jià)廉、安全、配制簡(jiǎn)單。細(xì)胞因子一般為分子量約20KDa。,Vaccine adjuvant,碳水化合物聚合體：甘露醇、b-3葡萄糖聚合物, 與免疫原混合或結(jié)合可用作人疫苗佐劑刺激DC, 誘導(dǎo)Th1應(yīng)答。多糖衍生物系：高分子量硫酸葡聚糖或二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖, 已用于獸用疫苗。,Vaccine adjuvant,霍亂毒素及其亞單位：大腸桿菌不耐熱毒素及其亞單位,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示粘膜佐劑活性。它們可能是通過(guò)GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體靶向作用和刺激內(nèi)源性腺昔酸環(huán)化酶活性而起佐劑作用。,Vaccine adjuvant,微生物衍生物型佐劑：微生物的核酸類(lèi),CpG 寡脫氧核苷酸(CpG2ODN)佐劑 ,非核酸類(lèi)佐劑單磷脂A (MPL) 、OM2174、不耐熱腸毒素(LT)及其突變體等。,1.CpG- ODN 佐劑CpG- ODN 是指一些以非甲基化的CpG序列(CpG motif)為核心的人工合成寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides, ODN)。源于細(xì)菌DNA 和特定序列反義寡核苷酸(ODN)的免疫刺激作用。含有特定未甲基化的胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(CpG)序列。未甲基化核苷酸細(xì)菌DNA序列是DNA 具有免疫學(xué)活性關(guān)鍵, 能給免疫系統(tǒng)提供一種危險(xiǎn)信號(hào), 易被機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別。免疫系統(tǒng)通過(guò)對(duì)這些特定序列的識(shí)別, 來(lái)誘發(fā)針對(duì)外源性DNA的免疫應(yīng)答。,Vaccine adjuvant,CpG- ODN ：含有GTCGTT 模體的CpG 寡核苷酸, 對(duì)人淋巴細(xì)胞具有良好的刺激活性。能直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞, 引起這些細(xì)胞分泌IL- 12、TNF- 等Th1 型為主的細(xì)胞因子, 并刺激MHC- I 與MHC- II 類(lèi)抗原表達(dá)增加。IL- 12 協(xié)同下激活NK 細(xì)胞, 激活的NK 細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng), 并分泌IFN- , IFN- 。激活B 細(xì)胞增殖分化分泌IL- 6、IL- 10 等細(xì)胞因子和表達(dá)MHC II、B71、B7- 2 等表面分子, 阻止B 細(xì)胞的凋亡。是一個(gè)新的不依賴于T 細(xì)胞的激活途徑。,Vaccine adjuvant,2.、MPL和OM2174均屬于細(xì)菌脂多糖成分,MPL：來(lái)源于明尼蘇達(dá)沙門(mén)菌的脂多糖,含有6個(gè)脂肪酸;OM2174：是一種經(jīng)化學(xué)方法減毒的脂質(zhì)A衍生物,僅保留了3個(gè)脂類(lèi)分子,且純度高,可溶于水, 4下能穩(wěn)定保存5年。LT：來(lái)自于大腸桿菌屬于細(xì)菌腸毒素,具有較強(qiáng)的粘膜佐劑活性。,1984 年Tokunaga 最先發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌的核酸具有抑制腫瘤的功能。 之后的許多研究表明，很多細(xì)菌、病毒、非脊椎動(dòng)物的DNA 均有激活NK 細(xì)胞和誘導(dǎo)干擾素分泌的生物學(xué)活性。 1 .Tokunaga T, Yamamoto H, Shimada, et al. Antitumor activity ofdeoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I.Isolation, physicochemical characterization and antitumor activity. J Natl Cancer Inst, 1984, 72 (4): 955-962.,Yamamoto 等發(fā)現(xiàn)，具有這一功能的DNA 多以CpG為核心，屬短非表達(dá)特異重復(fù)序列。通過(guò)不同基因的克隆和人工合成單鏈寡核苷酸等方法證明具有免疫激活作用的寡核苷酸特異序列是：AGCGCT、AACGTT 等。 這些序列均有CpG 基序，其中的CpG特征結(jié)構(gòu)以未甲基化的CpG 二核苷為核心，5 端兩個(gè)嘌呤，3 端兩個(gè)嘧啶，即5- PuPu-CpG-PyPy -3序列2、Yamamoto S, Yamamoto T, Tokunaga T, et al. DNA from bacteria，butnot from vertebtates, induces interferons, activitys natural killer cellsand inhibits tumor growth J. Microbiol Immunol, 1992, 36 (9):983-997,3、司興奎, 陳建紅, 張濟(jì)培, 等CpG 寡脫氧核苷酸的免疫刺激特性 及應(yīng)用研究進(jìn)展動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29（7）：71-75,CpG-DNA 可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1 型免疫應(yīng)答，增加細(xì)胞的T 淋巴細(xì)胞（CTL）的活性，是一種強(qiáng)有力的DNA 疫苗免疫佐劑,大腸桿菌JM109細(xì)菌基因組DNA：CpG-DNA小鼠和人中有良好刺激作用的最適序列ODN-1826(GACGTT)和ODN-2006(GTCGTT)；在大西洋鮭中有刺激活性的ODN-1670(AACGTT)；對(duì)于具有免疫刺激活性：CpG-DNA 序列ODN-1670（5-AACGTT -3） CpG 1670（含有一個(gè)ODN-1670）， 5-ACC GAT AACGTT GCC GGT GAC G-3， 1670-D（含有兩個(gè)ODN-1670）序列分別為：5-ACC GAT AAC GTTGCC AAC GTT GGT-3,Vaccine adjuvant,新型佐劑的免疫途徑與方式傳統(tǒng)疫苗佐劑的投遞主要是注射途徑,類(lèi)型單一。新型疫苗佐劑：投遞途徑多樣,組成形式各異,佐劑活性更強(qiáng),免疫重點(diǎn)突出等特點(diǎn)。注射途徑型佐劑、粘膜途徑型佐劑，兩者兼?zhèn)湫妥魟?Vaccine adjuvant,油/水乳劑型佐劑：以注射投遞途徑為主,包括MF59、QS21、AS02以及Montanide等水包油或油包水型佐劑,這類(lèi)佐劑通過(guò)肌肉或皮下注射接種來(lái)增強(qiáng)疫苗抗原的免疫原性,誘導(dǎo)特異的抗體反應(yīng),激發(fā)Th1型細(xì)胞因子( IFN2、IL-2等)產(chǎn)生較強(qiáng)的CTL反應(yīng),形成短暫性劇痛,引起局部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。內(nèi)源性細(xì)胞因子：如IL-2、IL-12、GM-CSF等, 主要通過(guò)注射途徑進(jìn)行接種,所引發(fā)的免疫應(yīng)答類(lèi)型與油/水乳劑型佐劑相似。,Vaccine adjuvant,單純的粘膜途徑型佐劑：LT和LT突變體為主,誘導(dǎo)以粘膜免疫為主的應(yīng)答反應(yīng),分泌特異性sIgA,也可產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫應(yīng)答,雖然強(qiáng)度較注射途徑弱。具有投遞簡(jiǎn)便,無(wú)創(chuàng)傷等顯著優(yōu)點(diǎn)。單一的注射途徑或粘膜途徑型佐劑在疫苗設(shè)計(jì)與使用上存在一定局限性。具備兩種投遞功能的新型疫苗佐劑，不同的免疫途徑下,既可誘導(dǎo)出系統(tǒng)免疫應(yīng)答,也可產(chǎn)生粘膜免疫效果,既有體液免疫也有細(xì)胞免疫,達(dá)到免疫預(yù)防和免疫治療的目的。,Vaccine adjuvant,新型佐劑的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的臨床前試驗(yàn)乳劑型佐劑(QS221、AS02、ISA251等) 、內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)劑( IL-12、DC)以及微生物衍生物型佐劑(LT)已進(jìn)入期臨床試驗(yàn);微粒型佐劑( PLG、ISCOMs、DC-chol等)和多數(shù)微生物衍生物型佐劑(OM-174、CpG-ODN等)正處于期臨床試驗(yàn)階段；MPL已開(kāi)始期臨床試驗(yàn)研究。,Vaccine adjuvant,Montanide ISA 佐劑：油包水或水包油乳劑ISA51和ISA720,已有超過(guò)4 000人接種過(guò)以此為佐劑的各種疫苗抗原來(lái)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。佐劑常用于腫瘤疫苗和H IV疫苗的研究,可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫,但仍有個(gè)別試驗(yàn)者在接種ISA720后出現(xiàn)較強(qiáng)的局部副反應(yīng),反應(yīng)出現(xiàn)頻率具有抗原或劑量依賴性。,Vaccine adjuvant,DC-Chol新型脂質(zhì)免疫刺激劑用于幽門(mén)螺桿菌(H. pylori)和H IV疫苗的期臨床試驗(yàn)。結(jié)合H. pylori尿素酶抗原免疫健康人群；結(jié)合H IV tat抗原對(duì)接受過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的H IV感染陽(yáng)性志愿者進(jìn)行免疫,結(jié)果表明DC-Chol可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,應(yīng)答水平高于單獨(dú)抗原免疫組。,Vaccine adjuvant,酪氨酸MPL 和L-酪氨酸一種替代性佐劑,可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1 型免疫應(yīng)答和高水平特異性IgG?？捎行У卣T導(dǎo)機(jī)體快速脫敏,舌下途徑投遞L-酪氨酸-MPL 結(jié)合也可獲得有效的脫敏效果。,Vaccine adjuvant,CpG-ODN佐劑以CpG-ODN為佐劑進(jìn)行乙肝疫苗的I期臨床試驗(yàn)中, CpG可迅速刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度特異性抗體,而無(wú)CpG佐劑的對(duì)照組卻未見(jiàn)高水平抗體產(chǎn)生。CpG佐劑可通過(guò)細(xì)胞表面TLR受體來(lái)發(fā)揮佐劑效應(yīng),同時(shí)可與其他作用機(jī)制的佐劑發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。,Vaccine adjuvant,AS02 佐劑：含有MPL 和QS221的乳劑, 佐劑已在結(jié)核病、乙肝、癌癥、瘧疾和H IV 疫苗中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。主要的副反應(yīng)包括全身寒戰(zhàn)、肌痛、頭痛和局部疼痛。瘧疾RTS. S抗原與AS02佐劑結(jié)合，瘧疾疫苗，/期臨床試驗(yàn)中,采用對(duì)111歲兒童進(jìn)行免疫接種,產(chǎn)生良好的持續(xù)性的抗體應(yīng)答。副反應(yīng)：輕微疼痛、嘔吐等,具有劑量依賴性,發(fā)生頻率也可接受。正在進(jìn)行b期臨床試驗(yàn)。,Vaccine adjuvant,佐劑臨床試驗(yàn)中存在的問(wèn)題,關(guān)于疫苗中氫氧化鋁佐劑研究進(jìn)展的警示,近來(lái)動(dòng)物模型和人體研究表明氫氧化鋁佐劑具有造成自身免疫和自身免疫性疾病的能力，氫氧化鋁本身具有免疫原性。 氫氧化鋁佐劑增強(qiáng)抗原的局部免疫反應(yīng)，使T輔助細(xì)胞和肥大細(xì)胞的趨化因子等細(xì)胞因子釋放。接種疫苗后尿酸等相關(guān)分子被釋放，高濃度的尿酸可形成尿酸鈉晶體，并被細(xì)胞吞噬和溶酶體分解。這將導(dǎo)致組織蛋白酶B的釋放，可以直接或間接激活細(xì)胞內(nèi)NALP3炎性系統(tǒng)和caspase- 1。這樣，氫氧化鋁佐劑刺激產(chǎn)生和分泌了如IL - 1B，IL - 18和IL- 33等細(xì)胞因子。 氫氧化鋁佐劑還可提供對(duì)抗原的物理性保護(hù)和輔助抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至引流區(qū)域的淋巴結(jié)。這將使抗原對(duì)免疫系統(tǒng)具有更長(zhǎng)時(shí)間的曝露，增加B和T細(xì)胞的產(chǎn)生和激活，并作出更強(qiáng)力的反應(yīng)。佐劑對(duì)獲得性免疫反應(yīng)的作用是通過(guò)NALP3炎性系統(tǒng)激活介導(dǎo)產(chǎn)生的，促成和誘導(dǎo)T輔助2（TH2）細(xì)胞反應(yīng)性和活性，如 IL- 4和IgE的產(chǎn)生。Yehuda Shoenfeld and Nancy Agmon-Levin, ASIA e Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants;Journal of Autoimmunity, 36 (2011) 4-8,Journal of Inorganic Biochemistry105 (2011)14571463由氫氧化鋁引起的巨噬細(xì)胞性肌筋膜炎相關(guān)的認(rèn)知機(jī)能異常病人的長(zhǎng)期跟蹤研究。法國(guó)報(bào)告30例病例由含氫氧化鋁佐劑的免疫制劑注射導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞性筋膜炎相關(guān)的認(rèn)知障礙巨噬細(xì)胞性筋膜炎是由于早先氫氧化鋁佐劑疫苗在局部注射后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期、持續(xù)性積聚氫氧化鋁而出現(xiàn)的特殊肌肉損傷。主要受累人群為中年成人；主要癥狀：播散性麻痹、慢性疲勞和認(rèn)知機(jī)能障礙特征：額葉（dysexecutive ）綜合癥；視覺(jué)記憶（visual memory ），雙耳聽(tīng)力測(cè)試左耳失聰,應(yīng)用氫氧化鋁佐劑建議關(guān)于氫氧化鋁佐劑所致的不良反應(yīng)已有較多的報(bào)道，我國(guó)應(yīng)引起重視，對(duì)發(fā)現(xiàn)的相關(guān)病例應(yīng)進(jìn)行因果分析；應(yīng)認(rèn)真評(píng)估疫苗中使用氫氧化鋁佐劑的風(fēng)險(xiǎn)/利益；建議對(duì)于不加佐劑即能產(chǎn)生有效保護(hù)的疫苗，不應(yīng)為了降低疫苗抗原使用量而以加佐劑增強(qiáng)，更不應(yīng)為降低成本而使用佐劑；使用氫氧化鋁佐劑的疫苗，應(yīng)關(guān)注最低有效添加量，特別是吸附率，多余的游離鋁應(yīng)加以嚴(yán)格控制；對(duì)于必須使用佐劑的疫苗，應(yīng)研究安全的新型佐劑,Vaccine adjuvant,油包水佐劑：在19451960年疫苗研究中廣泛應(yīng)用的福氏不完全佐劑,有強(qiáng)烈的免疫作用，但是導(dǎo)致膿腫發(fā)生大量增加而最終于1960 年后期被終止使用。ISA720 和ISA51與抗原乳化的研究表明,這種乳化劑完全可能保持持續(xù)的安全性,乳化物顆粒大小具有良好的可控性,抗原的使用劑量可限制至低量,在乳化劑中穩(wěn)定存在?？乖c油包水佐劑乳化形成的嚴(yán)格質(zhì)量控制可確保其在臨床試驗(yàn)期間不會(huì)發(fā)生任何變化,避免產(chǎn)生不良后果。,Vaccine adjuvant,臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)佐劑為新研發(fā)的佐劑，需要單獨(dú)設(shè)立佐劑對(duì)照組；疫苗的安全性、免疫原性或有效性；疫苗有效性試驗(yàn),設(shè)立類(lèi)似的對(duì)照組；確定對(duì)疫苗的療效評(píng)價(jià)客觀公正。,Vac