第二節(jié) 溶血性貧血的實驗室檢測,廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃 振 倩,1,溶血性貧血（hemolytic anemia）是由于各種原因?qū)е录t細(xì)胞生存時間縮短、破壞增多或加速，而骨髓造血功能不能相應(yīng)代償而發(fā)生的一類貧血。,2,溶血性貧血的分類：,3,1.按先天性、獲得性和發(fā)病機理分類：,4,2.按溶血發(fā)生的部位分類：,血管內(nèi)溶血：為紅細(xì)胞在血管內(nèi)（血液循環(huán)）中直接破壞，釋放出血紅蛋白到血漿中形成血紅蛋白血癥。多為獲得性，常急性發(fā)作。血管外溶血：為紅細(xì)胞在血管外，即脾臟等單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)被吞噬破壞，之后血紅蛋白就地分解代謝。多為先天性，呈慢性發(fā)作?；颊叱Ｓ衅⒋?。,5,3.按溶血發(fā)生的急慢分類,急性溶血：起病急，有發(fā)熱及全身癥狀。重者可發(fā)生休克、急性腎功能衰竭。紅細(xì)胞及血紅蛋白急劇下降，出現(xiàn)血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿癥。發(fā)作12小時后可發(fā)生黃疸。慢性溶血：起病緩慢。除可代償者無明顯表現(xiàn)外，常出現(xiàn)貧血、黃疸和脾腫大。,6,一、溶血性貧血的篩查試驗：,（一）血漿游離血紅蛋白測定參考值50mg/L(1-5mg/dL)臨床意義血管內(nèi)溶血時血漿游離血紅蛋白明顯升高。血管外溶血時正常。自身免疫性溶血性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血可輕度升高。,7,一、溶血性貧血的篩查試驗：,（二）血漿結(jié)合珠蛋白：（Hp）參考值0.7-1.5g/L(70-150mg/dL)臨床意義減低：見于各種溶血時，以血管內(nèi)溶血減低為顯著。肝臟疾病、傳單、先天性無結(jié)合珠蛋白血癥。增高：見于感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、SLE、糖皮質(zhì)激素、口服避孕藥、肝外阻塞性黃疸。,8,一、溶血性貧血的篩查試驗,（三）血漿高鐵血紅素清蛋白測定正常值 陰性臨床意義 陽性表示為嚴(yán)重血管內(nèi)溶血（四）紅細(xì)胞壽命測定用51Cr標(biāo)記紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞半衰期。正常紅細(xì)胞半衰期為25-32天。溶血性貧血時常小于15天。這是確定溶血性貧血的可靠方法。,9,一、溶血性貧血的篩查試驗,（五）尿含鐵血黃素試驗（Rous試驗）原理鐵離子在酸化的低鐵氰化鉀溶液中生成藍(lán)色的鐵氰化鉀，即普魯士蘭反應(yīng)。如尿液中脫落的腎小管上皮細(xì)胞有含鐵血黃素，顯微鏡下觀察可有深藍(lán)色物質(zhì)出現(xiàn)，即為陽性。正常值 陰性臨床意義 慢性血管內(nèi)溶血可呈陽性，并持續(xù)數(shù)周。常見于PNH。在溶血初期可呈陰性。,10,二、紅細(xì)胞膜缺陷的檢測,（一）紅細(xì)胞滲透脆性試驗原理 紅細(xì)胞在低滲氯化鈉溶液中細(xì)胞逐漸膨脹甚至破裂而溶血。該試驗是測定紅細(xì)胞對不同濃度低滲氯化鈉溶血的抵抗力，即紅細(xì)胞滲透脆性。將患者的紅細(xì)胞加至按比例配置的不同濃度低滲氯化鈉溶液中觀察其溶血的情況，結(jié)果以被檢紅細(xì)胞最小抵抗力（開始溶血時氯化鈉溶液的濃度）和最大抵抗力（完全溶血時氯化鈉溶液的濃度）來表示。參考值 開始溶血：0.42-0.46%（4.2-4.6g/L）NaCl溶液 完全溶血： 0.28-0.34%（2.8-3.4g/L）NaCl溶液臨床意義脆性增高：見于遺傳性球形細(xì)胞增多癥，溫抗體型自身免疫溶血性貧血、遺傳性橢圓型細(xì)胞增多癥脆性減低：見于海洋性貧血、缺鐵性貧血、某些肝硬化和阻塞性黃疸等。,11,二、紅細(xì)胞膜缺陷的檢測,（二）紅細(xì)胞孵育滲透脆性試驗原理 紅細(xì)胞孵育過程中，葡萄糖的消耗增加，儲備的ATP減少，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜對陽離子的主動傳遞受阻，鈉離子在紅細(xì)胞內(nèi)集聚，細(xì)胞膨脹，滲透脆性增加。參考值未孵育：50%溶血為4.00-4.45g/LNaCl37孵育24小時：50%溶血為4.65-5.9g/LNaCl臨床意義常用于輕型遺傳性球形細(xì)胞增多癥、遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血的診斷和鑒別診斷。脆性增高：見于遺傳性球形細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形細(xì)胞增多癥、遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血。脆性減低：見于珠蛋白生成障礙性貧血、缺鐵性貧血、廉狀細(xì)胞貧血、脾切除術(shù)后。,12,二、紅細(xì)胞膜缺陷的檢測,（三）自身溶血試驗及其糾正試驗原理先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血患者，由于紅細(xì)胞內(nèi)酶缺陷，葡萄糖酵解障礙，不能提供足量ATP,以維持紅細(xì)胞內(nèi)的鈉泵作用?；颊呒t細(xì)胞無菌條件下在自身血漿中溫育48小時，使ATP儲備減少，鈉泵作用減弱，導(dǎo)致溶血增強。在孵育過程中，分別加入葡萄糖及加入ATP作為糾正物，并以氯化鈉溶液為對照，觀察溶血是否能被糾正。參考值正常人紅細(xì)胞經(jīng)孵育48h后，僅輕微溶血、溶血度3.5%;加入葡萄糖及ATP孵育，溶血明顯糾正，溶血度均75%; 高鐵血紅蛋白 0.3-1.3g/L臨床意義減低：蠶豆病和伯氨喹型藥物溶血性貧血患者由于G6PD缺陷，高鐵血紅蛋白還原率明顯下降。,14,三、紅細(xì)胞酶缺陷的檢測,（二）氰化物-抗壞血酸試驗 原理抗壞血酸與HbO2反應(yīng)，氰化鈉能抑制過氧化氫酶以使H2O2不受影響，從而使H2O2與還原型谷胱甘肽（GSH)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG)，后者需要NADPH使其再還原為GSH。如紅細(xì)胞中催化NADPH形成的酶（如G6PD)缺乏，則GSH產(chǎn)生減少，使H2O2蓄積， HbO2 被氧化成為棕色的高鐵血紅蛋白。如紅細(xì)胞不缺乏G6PD則GSH活性正常， HbO2即被還原失效， HbO2仍呈鮮紅色。臨床意義正常血液要在幾小時以后才變成暗色。純合子G6PD缺乏的血液變成棕色（巧克力色），在2h內(nèi)即變色，雜合子者要3-4h變色。,15,三、紅細(xì)胞酶缺陷的檢測,（三）變形珠蛋白小體生成試驗原理 G6PD缺乏可致紅細(xì)胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽含量減少，隨之出現(xiàn)高鐵血紅蛋白增高。最后形成變性珠蛋白小體（Heinz bodies)。取G6PD缺陷者血液，然后加乙酰苯肼于被檢血樣及對照標(biāo)本中，37溫育2-4h，推薄血片，用1%煌焦油藍(lán)染色。計算含5個或更多珠蛋白小體的紅細(xì)胞比率。參考值 參考值30%臨床意義G6PD缺陷癥，不穩(wěn)定Hb、HbH病等常高于45%,16,三、紅細(xì)胞酶缺陷的檢測,（四）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗和活性測定原理在G6PD和NADP存在下，G6PD能使NADP還原成NADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。NADPH的吸收峰在波長340nm處，可通過單位時間生成NADPH的量來測定G6PD活性。參考值 正常人有甚強熒光。正常人酶活性為（4.971.43）U/gHb臨床意義G6PD缺陷癥熒光很弱或無熒光；雜合子或某些G6PD變異體則可能有輕到中度熒光。,17,三、紅細(xì)胞酶缺陷的檢測,（五）丙酮酸激酶熒光篩選試驗和活性測定原理 在二磷酸腺苷（ADP）存在條件下，丙酮酸激酶催化烯醇式磷酸丙酮酸變?yōu)楸幔谳o酶還原型（NADH）存在情況下，丙酮酸被乳酸脫氫酶作用轉(zhuǎn)變成乳酸，若熒光標(biāo)記于NADH上此時有熒光的NADH變?yōu)闊o熒光的NAD。參考值 正常丙酮酸激酶（PK）活性熒光在20分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.14.99）U/gHb臨床意義PK嚴(yán)重缺乏（純合子）熒光60分鐘不消失；雜合子者熒光25-60分鐘消失。,18,四、珠蛋白生成異常的檢測,(一)血紅蛋白電泳原理 基本原理與血清蛋白電泳相同。參考值正常人的電泳圖譜顯示4條區(qū)帶，最靠陽極端的為量多的HbA, 其后為量少的HbA2,再后兩條量更少的紅細(xì)胞內(nèi)的非血紅蛋白成分（NH1和NH2）。,臨床意義 HBA2增高：是診斷輕型地中海貧血的重要依據(jù)。 HBA2減低：見于缺鐵性貧血及鐵粒幼細(xì)胞貧血。,19,20,四、珠蛋白生成異常的檢測,（二）胎兒血紅蛋白酸洗脫試驗原理 HbF抗酸能力較HbA強。因此，經(jīng)固定后的血片，置酸性緩沖液中保濕一定時間，只有含HbF的紅細(xì)胞不被洗脫，再用伊紅染色而呈鮮紅色。參考值臍帶血、新生兒、嬰兒陽性，成人1%。臨床意義地中海貧血患者輕型者（雜合子）僅少數(shù)紅細(xì)胞呈陽性，重型者陽性紅細(xì)胞明顯增多。,21,四、珠蛋白生成異常的檢測,（三）胎兒血紅蛋白測定或HbF堿變性試驗原理 在堿性溶液中， HbF不易變性沉淀，其他Hb在堿性溶液中可變性被沉淀。測定其濾液中Hb含量，即HbF含量。參考值成人2%。新生兒55-85%，1歲左右同成人。臨床意義增高：地中海貧血明顯增高，重型者高達80-90%。急性白血病、再生障礙性貧血、紅白血病、淋巴瘤等也可輕度增高。,22,四、珠蛋白生成異常的檢測,（四）HbA2定量測定參考值1.1-3.2%。臨床意義 同血紅蛋白電泳。（五）限制性內(nèi)切酶譜分析根據(jù)患者DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的變化或限制性內(nèi)切酶降解DNA片段長度的多態(tài)性，來分析是否存在珠蛋白基因的突變、缺失等缺陷，為Hb病的基因診斷。 此外，還有其他檢測方法：異丙醇試驗、熱變性試驗、血紅蛋白H 包涵體檢查、紅細(xì)胞鐮變(HbS) 試驗、HbS 溶解度試驗、血紅蛋白C 試驗等。,23,五、自身免疫性溶血性貧血檢測,自身免疫性溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA）系體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生變異，產(chǎn)生自身抗體或（和）補體，結(jié)合在紅細(xì)胞膜上，使紅細(xì)胞破壞加速而引起的一組溶血性貧血。,24,五、自身免疫性溶血性貧血檢測,（一）抗人球蛋白試驗（Coombs test)原理不完全抗體無法架接兩個相鄰的紅細(xì)胞，而只能和一個紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合。抗人球蛋白抗體是完全抗體，可與多個不完全抗體的Fc段結(jié)合，導(dǎo)致紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集，稱為抗人球蛋白試驗陽性。直接抗人球蛋白試驗陽性說明病人紅細(xì)胞表面上包被有不完全抗體，而間接抗人球蛋白試驗陽性說明患者血清中含有不完全抗體?！緟⒖贾怠恐苯印㈤g接法均呈陰性反應(yīng)。,25,26,五、自身免疫性溶血性貧血檢測,（一）抗人球蛋白試驗（Coombs test)臨床意義1、陽性 見于新生兒溶血病、AIHA、SLE、RF、惡性淋巴瘤、甲基多巴等藥物性溶血反應(yīng)。2、AIHA大多屬于溫抗體型（即于37條件下作用最強，主要為IgG),但也有小部分屬冷抗體型（IgM）,必要時應(yīng)用于4 條件下進行試驗，排除假陰性反應(yīng)。3、AIHA大多為IgG型抗體，也有少數(shù)IgG亞型、IgA、IgM型，應(yīng)使用廣譜的抗人球蛋白血清進行試驗，以提高檢出陽性率。4、間接Coombs 試驗 主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生兒溶血病母體血清中不完全抗體的檢測。很少用于AIHA診斷。,27,五、自身免疫性溶血性貧血檢測,（二）冷凝集素試驗原理 冷凝集素是一種可逆性抗體，在低溫時可與自身紅細(xì)胞、“O”型紅細(xì)胞或與患者同型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，當(dāng)溫度增高時，凝集塊又復(fù)消失。參考值效價1:40,反應(yīng)最適溫度為4。臨床意義某些AIHA患者的冷凝集素效價很高，有的可達64000或更高。,28,五、自身免疫性溶血性貧血檢測,（三）冷熱雙相溶血試驗原理 陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥（PCH）患者的血清中有雙相溶血素，在0-4 時，溶血素與紅細(xì)胞結(jié)合，并吸附補體，但不溶血；當(dāng)升溫至30-37 則發(fā)生溶血。參考值陰性。臨床意義陽性見于PCH。某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、傳染性單核細(xì)胞增多癥也可有陽性反應(yīng)。,29,六、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿檢測,PNH為獲得性紅細(xì)胞膜缺陷引起的慢性血管內(nèi)溶血，常在睡眠時加重，可伴發(fā)作性血紅蛋白尿和全血細(xì)胞減少癥。（一）酸化溶血試驗原理又稱Ham試驗。PNH患者的紅細(xì)胞對補體敏感性增高，在酸化的血清中（pH6.6-6.8），經(jīng)37 孵育，易溶血。參考值陰性臨床意義陽性見于PNH, 某些AIHA發(fā)作時也可陽性。,30,六、陣發(fā)性睡眠型血紅蛋白尿檢測,（二）蔗糖溶血試驗原理蔗糖溶液離子濃度低，經(jīng)孵育可加強補體與紅細(xì)胞膜的結(jié)合，使PNH患者的紅細(xì)胞膜上形成小孔，遂使蔗糖進入紅細(xì)胞而導(dǎo)致溶血。參考值陰性臨床意義PNH常為陽性。也可見于巨幼細(xì)胞貧血、AA、AIHA和遺傳性球形細(xì)胞增多癥?？勺鳛镻NH的篩選試驗，陰性可排除PNH, 陽性應(yīng)再做Ham試驗。（三）蛇毒因子溶血試驗蛇毒因子是以眼鏡蛇毒中提取的一種分子量為144000蛋白質(zhì)，能直接激活血清中的補體C3，通過旁路途徑激活補體系統(tǒng)，進攻PNH紅細(xì)胞，造成溶血。本試驗為特異性PNH試驗。CD55和CD59陰性的紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞檢測,31,溶血性貧血的實驗診斷步驟,確定是否為溶血病史貧血？黃疸？網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)？查找溶血原因年齡、種族、職業(yè)、飲食、藥物史、家族遺傳史等,32,第四節(jié) 血型鑒定與交叉配血試驗,33,血型（blood group）是人體血液的一種遺傳性狀，各種血液成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及某些血漿蛋白在個體之間均具有抗原成分的差異，受獨立的遺傳基因控制。由若干個相互關(guān)聯(lián)的抗原抗體組成的血型體系，稱為血型系統(tǒng)。血型血清學(xué)的研究尤其在輸血、器官移植、骨髓移植等臨床實踐中發(fā)揮著重要作用。,34,一、紅細(xì)胞血型系統(tǒng),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并為國際輸血協(xié)會承認(rèn)的血型系統(tǒng)有30種，包括超過400種抗原，其中大部分都非常罕見，最重要的兩種為“ABO血型系統(tǒng)”和“Rh血型系統(tǒng)”。血型系統(tǒng)對輸血具有重要意義，以不相容的血型輸血可能導(dǎo)致溶血反應(yīng)的發(fā)生，造成溶血性貧血、腎衰竭、休克以至死亡。,35,血型分類的依據(jù)是紅細(xì)胞表面是否存在某些可遺傳的抗原物質(zhì)。紅細(xì)胞凝集Agglutination：血型不相容的血液混合后，其中的紅細(xì)胞聚集成簇并溶血。,36,37,造成凝集的機制是抗原-抗體反應(yīng)紅細(xì)胞表面上含有的特異性糖蛋白抗原物質(zhì)統(tǒng)稱為 凝集原Agglutinogen。在血漿中則含有與之相應(yīng)的特異性抗 體，稱為凝集素Agglutinin。,38,（一）ABO血型系統(tǒng),1901年Landsteiner首先發(fā)現(xiàn)1、血型系統(tǒng)的抗原和抗體：根據(jù)紅細(xì)胞表面是否具有A或B抗原，血清中是否存在抗A或B抗體，將ABO血型系統(tǒng)分為四型,39,40,（一）ABO血型系統(tǒng),2、ABO血型的亞型ABO血型系統(tǒng)中重要的亞型是A亞型A亞型：主要有A1和A2。A1亞型的紅細(xì)胞上具有A1和A2抗原，其血清中含有抗B抗體。A2亞型的紅細(xì)胞上只有A抗原，其血清中除含有抗B抗體外，可有少量的抗A1抗體。B亞型：不多見，抗原性很弱，臨床意義不大。,41,（一）ABO血型系統(tǒng),3、ABO血型鑒定和交叉配血試驗（1）ABO血型鑒定ABO血型抗體能在生理鹽水中與相應(yīng)紅細(xì)胞抗原結(jié)合而發(fā)生凝集反應(yīng)。采用標(biāo)準(zhǔn)的抗A及抗B血清以鑒定被檢者紅細(xì)胞上的抗原（Beth-Vincent 直接試驗），同時用標(biāo)準(zhǔn)的A型及B紅細(xì)胞鑒定被檢者血清中的抗體（Simonin 反轉(zhuǎn)試驗）。只有被檢者紅細(xì)胞上的抗原鑒定和血清中的抗體鑒定所得結(jié)果完全相符時才能肯定其血型類別。,42,用標(biāo)準(zhǔn)血清及標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞鑒定ABO血型結(jié)果,43,（一）ABO血型系統(tǒng),（2）交叉配血試驗采用試管法。主試驗：受血者血清供血者紅細(xì)胞懸液副試驗：供血者血清受血者紅細(xì)胞懸液結(jié)果判斷：同型血之間作交叉配血時，主側(cè)管均無凝集反應(yīng)，表示配血完全相合。,44,（一）ABO血型系統(tǒng),4、ABO血型系統(tǒng)的臨床意義溶血性輸血反應(yīng)誤輸ABO血型不合的血:嚴(yán)重的溶血反應(yīng)，危及生命。O型血作為“萬能血”輸入：緊急情況下才考慮。AB型病人輸入非同型血：也可引起溶血反應(yīng)。A1B型：抗O抗體A2B型：抗A1抗體新生兒溶血癥: 母子血型不符。O型母親發(fā)病率高，可能與其在受到A或B型抗原物質(zhì)免疫后產(chǎn)生的免疫性抗體效價較高有關(guān)。ABO血型與器官移植 血型不符易失敗 腎46%其他：用于親緣鑒定，某些疾病相關(guān)性的調(diào)查等。,45,附：血型的遺傳規(guī)律,46,（一）ABO血型系統(tǒng),（二）Rh血型系統(tǒng)Rh血型系統(tǒng)是將恒河猴(Rhesus monkey)的紅細(xì)胞免疫豚鼠和家兔,所得到抗血清能與人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng),證明人與恒河猴紅細(xì)胞具有同一抗原,取Rhesus頭兩字母稱Rh血型系統(tǒng)。漢人約99%、白人約85Rh陽性。臨床意義：溶血性輸血反應(yīng) Rh- 受血者 + Rh+ 供血者,第二次受血溶血新生兒溶血癥 母Rh- + 子Rh+, 溶血,47,Rh血型的臨床意義,新生兒溶血,48,分娩后72h內(nèi)進行Rh抗體被動免疫,胎兒紅細(xì)胞進入母體即被破壞 （不能誘導(dǎo)母親抗Rh免疫反應(yīng)）,Rh+,Rh,初孕,健康新生兒,健康新生兒,新生兒溶血的預(yù)防,49,二、其他血型系統(tǒng)1白細(xì)胞抗原系統(tǒng)： WBC自身特有的抗原、HLA抗原HLA抗原：人類白細(xì)胞抗原 組織相容性抗原 臨床應(yīng)用：1）器官移植前的HLA檢測：提高成功率。 2）親子鑒定：父母各一個單倍體 型構(gòu)成子代基因型。,2血小板抗原及抗體： （1）血小板抗原 （2）血小板抗體 原發(fā)：ITP 繼發(fā)：輸血、輸BPC、妊娠時。,3血清蛋白成分的抗原特異性： 由遺傳基因不同造成。 免疫蛋