.,1,Protein-proteinInteraction蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,03/27/2009,.,2,Protein-ProteinInteractions-ACommonThemeinCellBiology蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用細胞生物學(xué)領(lǐng)域的普遍主題,.,3,*DNA*RNA*Protein,Cellassemblyandfunction/細胞組裝與功能,Messenger,Headquarter,Executor,Stable,DNAmutation,Stable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNA,Versatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction,Protein-ProteinInteractions,.,4,SingleproteinProteincomplexProteincomplexinteractionProteincomplexnetworkCell,Versatile,Dynamic,Accurateregulation,Cellassemblyandfunction,Protein-ProteinInteractions,.,5,InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用區(qū)域是蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),*信號蛋白，調(diào)節(jié)蛋白以及大多數(shù)其他的蛋白質(zhì)都具有包括相互作用區(qū)域在內(nèi)的好幾個結(jié)構(gòu)域；*有些多肽僅由相互作用區(qū)域組成，從而充當?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合物的核心。,.,6,InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用區(qū)域是蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),*SH2domain:phosphotyrosine-containingpeptidesrecognitiondomain。SH2分布最為廣泛，識別特定的含有磷酸化Tyr的多肽模塊。,SH3,SH2,Ykinase,SH3,SH2,SH3,pYEEI,pYVNV,SrcSH2domain:Grb2SH2domain:,.,7,InteractiondomainandProteininteractionSignalingtransductionpathway,.,8,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalization蛋白質(zhì)的亞細胞定位,*蛋白質(zhì)的亞細胞定位與其功能密切相關(guān)；*涉及：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)與磷脂的相互作用；*蛋白質(zhì)的組織特異性與亞細胞定位的研究是蛋白質(zhì)功能研究的起始步驟,.,9,Protein-proteininteractioncanbeusedtobuildcomplexbiologicalsystems.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是功能復(fù)合物形成的基礎(chǔ)。（如線粒體內(nèi)膜呼吸鏈）,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,.,10,Aberrantinteractionscancontributetopathogenesis;錯誤的相互作用可能導(dǎo)致病理形象的出現(xiàn)。如Alzheimersdisease,beta-淀粉樣結(jié)構(gòu)的堆積；,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,.,11,Inducibleproteininteraction細胞面對不斷改變的環(huán)境表現(xiàn)出來的動態(tài)行為有賴于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以及它帶來的蛋白質(zhì)相互作用的變化。,.,12,Techniquesandcomputation,ElucidationofProtein-ProteinInteractions,BiophysicalTechniquesMassSpectrometrySurfacePlasmonResonanceAtomicForceMicroscopyNMRX-rayCrystallography,HighThroughputTechniquesLibraryScreeningDegeneratePeptideLibrariesSpotBlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,StandardTechniquesCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,InvivoImagingFRETBRET,ProteinInteractionNetworks,.,13,Techniques：Principle,Process,AdvantageandDisadvantageGST-Pulldown,Principle:AffinitypurificationAffinitybetweenInteractionmotif/polypeptideanditsinteractionproteins;Advantage:Directinteraction/InvitroProcess:,Interactionmotif,GST,ImmobilizedonGlutathionebeads,AffinitycolumnMaking,Affinitypurificationfromtissueorcelllysate,.,14,Techniques：免疫沉淀,.,15,質(zhì)量作用定律決定IP的成功度,.,16,Techniques：免疫沉淀（非變性）,免疫沉淀的靈敏度取決于ProteinA(orG)與IgG的Kd、IgG與抗原的Kd值。所以增加抗原或抗體的濃度、使用與抗體直接共價偶聯(lián)的珠子進行免疫沉淀可以提高靈敏度；,ProteinABead,IgG,Antigen,Kd,Kd,*,*,IgG,Kd,Antigen,.,17,Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀,Principle:Affinitypurification/親和純化Advantage:Invivo(Physiologicalstatus)/代表生理狀態(tài)下的相互作用,X,Y,X,Y,Cell,CellLysisandImmunoprecipitationofproteinX,Z,Z,細胞裂解與蛋白質(zhì)X的免疫沉淀,.,18,Techniques：免疫沉淀（非變性）,生理活性的保持：a.全程低溫操作；b.裂解液中加入蛋白酶抑制劑；2.免疫沉淀的靈敏度取決于ProteinA(orG)與IgG的Kd、IgG與抗原的Kd值。所以增加抗原或抗體的濃度、使用與抗體直接共價偶聯(lián)的珠子進行免疫沉淀可以提高靈敏度；,ProteinABead,IgG,X,Kd,Kd,*,*,IgG,X,Kd,.,19,Techniques：免疫沉淀（非變性）,免疫沉淀的產(chǎn)物如用于SDS-PAGE及及免疫印跡進一步分析時，*需要去除鹽的干擾，PBS或其它洗滌緩沖液應(yīng)可能去除；大量IgG摻入也影響電泳的效果，如脫尾和擴散。檢測信號十分微弱時，這種條帶的擴散可能導(dǎo)致根本無法獲得信息；,.,20,Techniques：免疫沉淀（非變性）,免疫沉淀的產(chǎn)物如用于SDS-PAGE及及免疫印跡進一步分析時，大量的IgG摻入樣品后導(dǎo)致免疫印跡時出現(xiàn)非特異性條帶；對免疫共沉淀的結(jié)果分析影響尤其大；,IgG,目的蛋白,用目的蛋白的抗體進行免疫沉淀，再用免疫印跡法進行檢測；,.,21,GFP,WT,YFMut(6),-+,-+,-+,IP:GFPIB:4G10(pTyr),MTSS1-GFP,GFP,PDGF,115,93,49.8,35.8,29.2,198,-+,-+,-+,Reblot:GFP,MTSS1-GFP,GFP,WT,YFMut(6),.,22,Techniques：免疫共沉淀（非變性）,操作同非變性免疫沉淀，只是檢測的是相互作用蛋白；其效率還涉及復(fù)合物中蛋白質(zhì)X，Y，Z的Kd值。,ProteinABead,IgG,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,.,23,Techniques：免疫共沉淀（非變性）,1.免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)X，Y，Z的Kd值越小，即越穩(wěn)定，有利于免疫共沉淀的進行;2.免疫沉淀中提高靈敏度的方法同樣適用于免疫共沉淀；,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,.,24,Techniques：免疫共沉淀（非變性）,細胞裂解液的幾點考慮：1.復(fù)合物的穩(wěn)定，提高靈敏度，但會降低特異性；2.針對特定的復(fù)合物，細胞裂解液中可能加入磷酸酯酶抑制劑或者ATP及一些金屬離子以維持復(fù)合物的穩(wěn)定；,.,25,Techniques：免疫共沉淀,免疫共沉淀中的非特異性：,B,A,x,Y,細胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,A,X,.,26,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型I）,B,A,x,Y,細胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,A,X,原因：抗體的非特異性,.,27,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型I）,1.抗體的質(zhì)量：抗體的特異性；2.盡可能的設(shè)置多種陰性對照；一般采用兔子免疫前的血清(pre-immuneserum)同時進行免疫沉淀及后續(xù)分析;3.使用目標蛋白的多種抗體進行免疫沉淀并比較；4.采用不表達目標蛋白的細胞裂解物同時進行免疫沉淀并比較；5.增強細胞裂解液的嚴謹性，降低非特異性；6.檢測兩種蛋白質(zhì)的相互作用時，同時用兩個蛋白質(zhì)的抗體進行實驗；,.,28,B,A,x,Y,細胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,X,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型II）,抗原復(fù)合物與其它蛋白質(zhì)的非特異性相互作用；抗原復(fù)合物解離,X,.,29,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型II）,*當X-Y的復(fù)合物不很穩(wěn)定或解離常數(shù)大時，可以考慮使用細胞可滲透的交聯(lián)劑(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基團,活性基團,A,B,A,x,Y,細胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,.,30,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型II）,*當X-Y的復(fù)合物是瞬間形成的或解離常數(shù)大時，可以考慮使用細胞可滲透的交聯(lián)劑(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基團,活性基團,A,.,31,B,A,x,Y,細胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀,X,Y,Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特異性的實驗設(shè)計考慮（類型II）,.,32,研究方案:AffinitypurificationMattilaetal,JBiolChem,278,8452,2003;Bompardetal,JCellSci,118,5393,2005.Linetal,Oncogene,24,2059,2005.,.,42,利用亞細胞定位及蛋白質(zhì)相互作用等信息進行蛋白質(zhì)功能歸屬,例1：從免疫共沉淀中得到的蛋白質(zhì)中篩選重要功能相關(guān)蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9個p53(胞漿和核定位）結(jié)合蛋白1.GRP-94GRP-942.Alpha-actinin1GRP-78分子伴侶*3.MCM3GRP-754.GRP-785.GRP-752MCM3DNA復(fù)制準許因子*6.LaminA/C7.Ezrin/CytovillinAlpha-actinin胞漿8.CD98antigen3LaminA/C核纖層細胞骨架？9.ProteinkinaseCEzrin/cytovilin胞漿4ProteinKinaseC激酶？5CD98antigen跨膜糖蛋白X,1,.,43,例3Sra1與Nap