EB病毒檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用,概述,Epstein-Barr病毒（EBV）皰疹病毒科，亞科，嗜淋巴細(xì)胞病毒屬，1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲兒童的惡性淋巴瘤組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)。EBV是是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，也是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒，與鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖癥等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，被列為致癌性病毒之一。,概述,傳播途徑：EBV感染主要通過唾液接觸傳播，也可通過血液傳播；人感染EBV后建立終身潛伏感染，人群感染率超過90%。1-6歲兒童、14-20歲青少年及年輕成年人高度易感，發(fā)展中國家EBV感染多發(fā)生在兒童早期。,病原學(xué),皰疹病毒科，皰疹病毒亞科，淋巴隱病毒屬，人皰疹病毒4型球形雙鏈DNA病毒，基因組平均大小約為172 kb,EBV致病機(jī)制,原發(fā)EBV感染時(shí)，EBV先是在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染附近的B淋巴細(xì)胞，受到感染的B淋巴細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)可以造成全身性感染。EBV原發(fā)感染后，大多數(shù)無臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒大多表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，但在兒童期、青春期和青年期 ，約50%的原發(fā)性感染均表現(xiàn)為IM。,EBV在人體B細(xì)胞建立潛伏感染，EBV只表達(dá)潛伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者將成為終身帶毒者。在機(jī)體免疫功能下降和某些因素觸發(fā)下，潛伏的EBV可以被再激活，引起病毒復(fù)制及臨床疾病。,EBV致病機(jī)制,EBV常見相關(guān)疾病,傳染性單核細(xì)胞增多癥 （Infectious mononucleosis,IM)慢性活動(dòng)性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV）EB病毒相關(guān)性嗜血細(xì)胞綜合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)Burkitts淋巴瘤 何奇金淋巴瘤,EBV感染的抗原表達(dá),EBV溶解性感染期，可表達(dá)：早期抗原（EA）：EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； EA出現(xiàn)表明EBV活躍增殖，EA抗體出現(xiàn)在感染早期；衣殼蛋白（VCA）晚期表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白VCA-IgM出現(xiàn)在急性感染早期，VCA-IgG出現(xiàn)在急性感染期并持續(xù)存在膜抗原（MA）：細(xì)胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原抗MA-IgM可用于早期診斷,EBV潛伏感染期，選擇性表達(dá)早期抗原以及： 核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：為DNA結(jié)合蛋白，在感染的B細(xì)胞核內(nèi)；EBNA-1與感染有關(guān)，EBNA-2與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化有關(guān)；EBNA抗體出現(xiàn)在感染晚期。 潛伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：在感染B細(xì)胞表面，與細(xì)胞惡化有關(guān)， 未翻譯的轉(zhuǎn)錄物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目標(biāo),EBV感染的抗原表達(dá),原發(fā)性EBV感染過程中首先產(chǎn)生針對衣殼抗原（capsid antigen, VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（early antigen, EA）抗體出現(xiàn)在恢復(fù)期晚期，抗核抗原（nuclear antigen, NA）抗體產(chǎn)生，抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持續(xù)終身,EBV感染的血清學(xué)診斷,傳統(tǒng)檢測策略的問題,EBV感染的血清學(xué)診斷,抗VCA-IgM和IgG可以同時(shí)出現(xiàn)，通常IgG出現(xiàn)較IgM晚，但偶爾較IgM出現(xiàn)早12周，抗VCA-IgM幾周后檢測不到抗EA-IgG在發(fā)病后3-4周后升高，34月后檢測不到抗EBNA-1-IgG在發(fā)病后34周被檢測到，持續(xù)終身，部分慢性EBV感染者檢測不到抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG終生持續(xù)陽性,EBV常見相關(guān)疾病,傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)infectious mononucleosis,特指由EBV感染引起的發(fā)熱、咽炎和淋巴結(jié)腫大的綜合征1889年被首次描述為“glandular fever”1920年正式定義為IM1932年發(fā)現(xiàn)嗜異性凝集實(shí)驗(yàn)1968年實(shí)驗(yàn)室工作人員感染EBV，出現(xiàn)IM臨床癥狀和嗜異性凝集抗體，明確EBV是IM的病原,IM臨床表現(xiàn),25-30%的青少年和102.5copies/g 原位雜交：檢測出EBER-1陽性細(xì)胞Southern雜交：受累組織或外周血中檢測出EBV DNA免疫熒光：檢測到抗原（EBNA、LMP）感染的B、T、NK細(xì)胞、單核/巨噬/組織細(xì)胞檢測到EBNA、EBER、EBV-DNA,EBV相關(guān)的噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH,是一種與EBV感染有關(guān)的淋巴增殖伴隨吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象的一類疾病EBV感染所致CD8+T細(xì)胞的異常增殖及其激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子大量釋放產(chǎn)生高細(xì)胞因子血癥（細(xì)胞因子風(fēng)暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征臨床表現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、黃疸、全血細(xì)胞減少、DIC，骨髓和其他組織見嗜血細(xì)胞、LDH、鐵蛋白、微球蛋白EBV-HLH常見于兒童和青少年,抗EBV病毒藥物,無環(huán)核苷擬似劑acyclovir（阿昔洛韋），ED50 0.3ganciclovir（更昔洛韋）， ED50 0.05valaciclovir（纈昔洛韋 ）無環(huán)核苷酸cidofovir，adefovir焦磷酸鹽 擬似劑 foscarnet（磷甲酸鈉）作用機(jī)制作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒復(fù)制,EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,外周血分類淋巴細(xì)胞50% WBC不典型淋巴細(xì)胞10% WBC（系激活的CD8+ CTL）血清學(xué)檢查嗜異性凝集實(shí)驗(yàn)（heterophile test/spot test）VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG病毒學(xué)標(biāo)志在PBMC、血清、全血或感染組織檢測EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP,EBV感染疾病的血清學(xué)診斷,臨床需要回答的問題,是否感染EBV?EBV感染的時(shí)相？是否EBV活動(dòng)性感染？疾病是否與EBV感染相關(guān)？,EBV實(shí)驗(yàn)室檢測方法,病毒培養(yǎng)免疫學(xué)技術(shù)（免疫熒光法，免疫組化技術(shù)） 血清學(xué)方法（ELISA法，化學(xué)發(fā)光法） 基因診斷技術(shù),嗜異凝集抗體試驗(yàn)：也稱“Monospot”試驗(yàn)。在EBV還未確定為IM的病因之前，1932年引入臨床實(shí)踐診斷IM。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)IM患者的血清或血漿可以凝集馬或綿羊的紅細(xì)胞。該抗體在病程第12周出現(xiàn)，持續(xù)約6個(gè)月。在青少年原發(fā)性EBV感染中其陽性率可達(dá)80-90，約10的青少年缺乏對嗜異性抗體的陽性反應(yīng)。,EBV實(shí)驗(yàn)室檢測方法,EBV感染的血清學(xué)診斷評(píng)價(jià),嗜異性抗體（heterophile antibody，HA）凝集實(shí)驗(yàn)（“spot” test）嗜異性抗體（IgM）在發(fā)病后7天內(nèi)出現(xiàn)，2-5周達(dá)高峰，可以持續(xù)6-12個(gè)月，偶有12個(gè)月后以低水平存在HA陽性提示原發(fā)急性感染，EBV再激活感染幾乎陰性陽性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5歲兒童50%假陰性：發(fā)病第1周內(nèi)假陰性率25%，10%成人始終陰性假陽性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心內(nèi)膜炎、HAV肝炎,缺點(diǎn)需要硬件設(shè)備成本昂貴,優(yōu)點(diǎn)敏感性高特異性強(qiáng)操作簡便,化學(xué)發(fā)光技術(shù),膠體金是氯金酸HAuCl4的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),簡便，快捷，敏感度和特異度較差,EBERS原位雜交試驗(yàn) EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大量的EBERlEBER2（EBERS）轉(zhuǎn)錄子，其主要功能是抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)和凋亡。該轉(zhuǎn)錄子不翻譯成蛋白質(zhì)，每個(gè)EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大約106拷貝EBERS，被認(rèn)為EBV潛伏感染的最好標(biāo)志物，因此原位雜交檢測腫瘤細(xì)胞中EBERS是診斷腫瘤是否EBV相關(guān)的金標(biāo)準(zhǔn),EBV實(shí)驗(yàn)室檢測方法,EBV病毒核酸檢測,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法鑒別EBV健康攜帶者的低水平復(fù)制與EBV相關(guān)疾病患者高水平活動(dòng)性感染。,EBV載量檢測有多種方法，Real-time PCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法，有較強(qiáng)的敏感性和特異性。不同的EBV疾病進(jìn)行Real-time PCR檢測時(shí)，需要的標(biāo)本不同。,EBV病毒核酸檢測,EBV相關(guān)性疾病的病毒DNA定量檢測,血清游離的EBV-DNA提示原發(fā)感染或者再激活健康攜帶者血清EBV-DNA通常檢測不到,傳單的EBV感染實(shí)驗(yàn)室診斷,血清學(xué)檢測：同時(shí)滿足下列2條者可以診斷為EBV-IM:1.下列臨床癥狀中的3項(xiàng)：發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴結(jié)腫大、肝腫大、脾腫大；2.原發(fā)性EBV感染的血清學(xué)證據(jù)，滿足下列2條中任一項(xiàng)： （1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG陽性，且抗EBV-NA-IgG陰性（2）抗EBV-CA-IgM陰性，但抗EBV-CA-IgG陽性，且為低親和力抗體,傳單的EBV感染實(shí)驗(yàn)室診斷,DNA檢測？:IM患者外周血中EB病毒載體在2周內(nèi)達(dá)到峰值，隨后很快下降。至病程14天，多數(shù)EBV-IM患者血清中已檢測不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均檢測不到病毒核酸。IM患者不推薦進(jìn)行EB病毒載量檢測,慢性活動(dòng)性EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,EBV抗體檢測,慢性活動(dòng)性EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,DNA檢測絕大多數(shù)CAEBV患者PBMC中EBV-DNA水平高于102.5拷貝/ug DNA部分CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA陰性CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA水平與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān),EB病毒相關(guān)噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥,EBV-HLH可以發(fā)生在原發(fā)性EBV感染時(shí)期，既往EBV感染再激活時(shí)期EBV-HLH患者血清中EBV抗體反應(yīng)呈多種反應(yīng)類型，單純血清EBV抗體檢測對EBV-HLH的診斷意義不大。,EB病毒相關(guān)噬血淋巴組織細(xì)胞增生癥,DNA檢測:EBV-H