分類號學(xué)校代碼10426密級學(xué)號2010051009碩士學(xué)位論文MASTERDEGREETHESIS基于納米粒子放大的生物傳感器檢測P53蛋白作者王楠楠指導(dǎo)教師丁彩鳳學(xué)科專業(yè)應(yīng)用化學(xué)專業(yè)代碼081704研究方向生物分析化學(xué)2013年6月1日基于納米粒子放大的生物傳感器檢測P53蛋白學(xué)位論文完成日期2013年6月1日指導(dǎo)教師簽字答辯委員會成員簽字基于納米粒子放大的生物傳感器檢測P53蛋白摘要癌癥的死亡率極高，近幾年來，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。對腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確靈敏的檢測，對于腫瘤的診斷、預(yù)防、治療和療效觀察的研究具有重要的作用。其中，P53蛋白是一種重要的腫瘤抑制蛋白，它與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞衰老、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞代謝狀態(tài)改變或發(fā)生自噬等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。在高于50的癌癥中，P53基因出現(xiàn)異常，因此，對于P53蛋白的臨床檢測具有著重要的意義。本論文主要結(jié)合了納米技術(shù)，生物條碼，滾環(huán)復(fù)制等技術(shù)，得到信號的放大作用，通過石英晶體微天平檢測、表面增強(qiáng)拉曼檢測等方法實(shí)現(xiàn)了對野生型P53蛋白及全部P53蛋白的高靈敏度檢測。以下是論文包含的內(nèi)容1、研制了一種新穎的基于納米金粒子質(zhì)量放大石英晶體微天平（QCM）的頻移信號，檢測腫瘤標(biāo)記物P53蛋白的新方法。該方法將抗體先固定在芯片上，對金納米粒子修飾共識雙鏈DNA，通過抗體與抗原的特異性免疫反應(yīng)及共識雙鏈DNA對野生型P53蛋白的識別作用，將能放大QCM頻移信號的金納米粒子固定在QCM芯片上，實(shí)現(xiàn)對野生型P53蛋白的檢測，具有較高的靈敏度和良好的選擇性。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對野生型P53蛋白的檢測限為01PGML1。此方法靈敏度高，選擇性好，就有廣泛的應(yīng)用前景。2、研制了一種基于納米粒子，免疫金及雙抗體夾心技術(shù)，通過石英晶體微天平（QCM）的頻移信號檢測P53蛋白的方法。該方法將抗體先固定在芯片上，二抗與金納米粒子制成免疫金，利用抗體對P53蛋白進(jìn)行識別，將放大QCM頻移的金納米粒子固定在芯片上，實(shí)現(xiàn)對P53蛋白的靈敏檢測，其檢測限為01PGML1。將該方法與上章檢測野生型P53蛋白的方法相結(jié)合，可以得到野生型P53蛋白同突變型P53蛋白的比例，判斷是否是癌細(xì)胞，故能為臨床醫(yī)學(xué)和生物分析提供了一種新的分析方法。3、報(bào)道了一種基于循環(huán)信號放大以及生物條碼技術(shù)，通過表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對野生型P53蛋白的檢測。該方法將拉曼信號分子羅丹明標(biāo)記的SINGALDNA和PROBEDNA修飾到金納米粒子上，制成生物條碼；通過滾環(huán)放大將固定在修飾有抗體的聚苯乙烯微球上的PRIMMERDNA復(fù)制得到的長鏈可以接合許多的拉曼信號分子編碼的生物條碼探針；另外，對金納米粒子修飾上共識雙鏈DNA；由于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)及共識雙鏈DNA對野生型P53蛋白的識別作用，將它們都固定在納米金磁微粒上。這樣，通過表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）就可以來完成對野生型P53蛋白的檢測。關(guān)鍵詞P53蛋白，金膠納米粒子，腫瘤細(xì)胞，石英晶體微天平，滾環(huán)復(fù)制，表面增強(qiáng)拉曼光譜ANEWBIOSENSORBASEDONNANOPARTICLESANDAPPLICATIONINASSAYOFP53PROTEINABSTRACTINRECENTYEARS,THEMORTALITYRATEOFCANCER,ONEOFTHEMOSTTHREATENINGDISEASESOFTHEHUMANBEING,ISBECOMINGINCREASINGLYHIGHTHEACCURATEANDSENSITIVEDETECTIONOFTRACETUMORMARKERISCAPABLEOFDIAGNOSINGCANCER,PREVENTION,TREATMENTANDCLINICALOBSERVATIONTHEREINTO,P53,ATUMORSUPPRESSORPROTEINANDATRANSCRIPTIONFACTOR,PLAYSANIMPORTANTROLEINCELLGROWTHCONTROL,DNAREPAIR,ANDPROGRAMMEDCELLDEATHINMORETHAN50OFCANCERCASES,THEP53GENEHASBEENFOUNDTOBEMUTATED,THEREFORE,THEDETECTIONOFP53PROTEINISTHEESSENTIALNEEDTHISTHESISREPORTEDNEWMETHODSBASEDONNANOTECHNOLOGY,BIOBARCODEANDRCA,WHICHWEREUSEDTODETECTWIDETYPEP53ANDTAOTALP53PROTEINBYQCMANDSERSTHISTHESISMAINLYCONSISTSOFTHEFOLLOWINGTHREEPARTS1WEDESIGNEDANOVELMETHODTODETECTWIDETYPEP53PROTEINWITHAQUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCMSENSORBASEDONTHEAMPLIFICATIONOFGOLDNANOPARTICLESAUNPSTOACHIEVETHEQCMASSAY,GOLDCRYSTALCHIPAUCHIPWASIMMOBILIZEDWITHPRIMERANTIBODYAB1OFP53PROTEINSTHROUGHTHELINKINGOFCYSTEAMINETHENTHEWIDETYPEP53PROTEINANDCONSENSUSDOUBLESTRANDEDDSDNAMODIEDWITHAUNPSWEREINJECTEDSEQUENTIALLYACCORDINGTOTHEHIGHAFNITYOFTHECONSENSUSDSDNATOTHEWILDTYPEP53PROTEINANDTHEANTIBODYTOP53PROTEIN,ASTABLEFRAMEWORKWASFABRICATEDTHEDETECTIONLIMITOFTHISASSAYFORWIDETYPEP53PROTEINDETERMINEDIS01PGML1THEMETHODHOLDSGREATPROMISEINTHEBIOCHEMICALASSAYFORTHEEARLYDIAGNOSISOFCANCERS,WHICHHASHIGHSENSITIVITYANDEXCELLENTSELECTIVITY2BASEDONTHEAMPLIFICATIONOFQUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCMSIGNALSBYGOLDNANOPARTICLES,ANOVELANDSENSITIVEASSAYFORTHETOTALP53PROTEINDETECTIONHASBEENDEVELOPEDBYUSINGNANOPARTICLES,IMMUNOGOLDANDSANDWICHTYPETECHNIQUESTOACHIEVETHEQCMASSAY,GOLDCRYSTALCHIPAUCHIPWASIMMOBILIZEDWITHPRIMERANTIBODYAB1OFP53PROTEINSTHROUGHTHELINKINGOFCYSTEAMINETHENTHETOTALP53PROTEINANDAB2MODIEDWITHAUNPSWEREINJECTEDSEQUENTIALLYACCORDINGTOTHEANTIBODYTOP53,ASTABLE“SANDWICH”FRAMEWORKWASFABRICATEDTHEDETECTIONLIMITOFTHISASSAYFORTOTALP53PROTEINDETERMINEDIS01PGML1COMBINEDWITHTHEFIRSTPART,THEDIFFERENCEINTHEQCMSIGNALSBETWEENTHETOTALP53ANDWIDETYPEP53PROTEINREVEALSTHEEXTENTOFP53MUTATION,WHICHISINDICATIVEOFCANCERDEVELOPMENTTHUS,THEQCMSENSORCOULDPOTENTIALLYSERVEASANATTRACTIVETECHNIQUEFORRAPID,SENSITIVE,RELIABLE,ANDLABELFREECANCERDIAGNOSES3THEDETECTIONOFWIDETYPEP53PROTEINISACHIEVEDBYSURFACEENHANCEDRAMANSPECTROSCOPYSERS,BASEDONROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONRCAANDBIOBARCODESIGNALAMPLIFICATIONTECHNOLOGYTOACHIEVETHESERSASSAY,THEPRIMERDNAMODIFIEDONJS,WASDEVELOPPEDINTOALONGCHAINDNAATTHEPRESENCEOFROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONTHELONGCHAINDNACANHYBRIDIZEWITHBIOBARCODETOAMPLIFYTHESERSSIGNALSACCORDINGTOTHEHIGHAFNITYOFTHECONSENSUSDSDNATOTHEWILDTYPEP53PROTEINANDTHEANTIBODYTOP53,ALLTHESEPARTSWEREIMMOBILIZEDONTHEGOLDCSATLAST,WECANDETECTWILDTYPEP53BYSERSKEYWORDSP53,NANOPARTICLESAUNPS,CANCERCELLS,QUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCM,ROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONRCA,SURFACEENHANCEDRAMANSPECTROSCOPYSERS目錄第1章前言111生物傳感器1111生物傳感器的概念、組成及分類1112生物傳感器的工作原理2113生物傳感器的特點(diǎn)2114免疫傳感器31141免疫傳感器的概念31142免疫傳感器的分類3115DNA生物傳感器41151DNA生物傳感器的工作原理41152DNA生物傳感器的分類41153DNA生物傳感器的應(yīng)用512生物分析中納米材料的應(yīng)用5121納米材料的定義及特征5122納米粒子的制備和修飾51221DNA修飾的納米金粒子61222蛋白質(zhì)修飾的納米金粒子7123納米粒子的應(yīng)用71231納米金在免疫傳感器中的應(yīng)用71232納米金在表面增強(qiáng)拉曼光譜中的應(yīng)用81233納米金粒子在電化學(xué)DNA傳感器中的應(yīng)用813腫瘤細(xì)胞及腫瘤標(biāo)志物9131腫瘤的概念及分類9132癌細(xì)胞的特點(diǎn)10133腫瘤標(biāo)志物及其分類10134目前對腫瘤標(biāo)志物的檢測方法111341酶聯(lián)免疫分析方法111342膠體金免疫分析方法12135P53基因及P53蛋白121351P53基因及其蛋白的概述121352P53蛋白的檢測1214滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)14141滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)概述14142RCA技術(shù)基本原理14143RCA技術(shù)的種類15144RCA技術(shù)的應(yīng)用1515課題意義及主要內(nèi)容15參考文獻(xiàn)17第2章基于納米粒子放大作用的QCM傳感器檢測野生型P53蛋白2121引言2122實(shí)驗(yàn)部分22221儀器與試劑222211試劑222212儀器22222實(shí)驗(yàn)方法222221AU納米粒子的制備232222修飾有互補(bǔ)雙聯(lián)DNA的金納米粒子的合成232223石英晶體微天平芯片的預(yù)處理232224P53蛋白及其抗體的預(yù)處理232225固定P53蛋白的抗體AB1242226石英晶體微天平檢測野生型P53蛋白2423結(jié)果與討論24231QCM檢測野生型P53蛋白的原理24232紫外可見吸收光譜圖譜25233共識雙鏈DNA對野生型P53蛋白的識別25234實(shí)驗(yàn)最佳條件的優(yōu)化262341P53蛋白抗體（AB1）濃度的優(yōu)化262342共識雙鏈DNA用量的優(yōu)化272343粒子粒徑的優(yōu)化28235實(shí)驗(yàn)方法選擇性研究28236QCM對于野生型P53的檢測2924小結(jié)30參考文獻(xiàn)32第3章利用金膠放大作用的QCM傳感器檢測腫瘤細(xì)胞中的P53蛋白3531引言3532實(shí)驗(yàn)部分36321儀器與試劑363211試劑363212儀器36322實(shí)驗(yàn)方法373221細(xì)胞培養(yǎng)373222從MCF7細(xì)胞中提取P53蛋白373223金納米粒子的制備373224免疫金的制備373225石英晶體微天平芯片的預(yù)處理383226固定P53蛋白的抗體AB1383227石英晶體微天平檢測P53蛋白383228ELISA方法檢測P53蛋白3833結(jié)果與討論38331設(shè)計(jì)方案及工作原理38332實(shí)驗(yàn)最佳條件的優(yōu)化393321制備免疫金時第二抗體用量優(yōu)化393322所用金納米粒子粒徑的優(yōu)化40333實(shí)驗(yàn)方法選擇性研究40334QCM對于P53蛋白的檢測41335ELISA對于P53蛋白的檢測42336實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性43337實(shí)際樣品分析測定4434小結(jié)44參考文獻(xiàn)45第4章基于滾環(huán)復(fù)制放大作用的拉曼傳感器檢測野生型P53蛋白4841引言4842實(shí)驗(yàn)部分49421儀器與試劑494211試劑494212儀器49422實(shí)驗(yàn)方法504221生物條碼的制備504222抗體（AB1）修飾的PS的制備504223滾環(huán)復(fù)制放大（RCA）步驟504224生物條碼的組裝504225修飾有互補(bǔ)雙聯(lián)DNA的納米金磁微粒的合成504226表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測野生型P53蛋白5143結(jié)果與討論51431QCM檢測野生型P53蛋白的原理51432生物條碼的紫外表征52433對照實(shí)驗(yàn)53434實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化534341生物條碼中捕獲SIGNALDNA與PROBEDNA比例的優(yōu)化534342滾環(huán)復(fù)制時間的選擇544343共識雙鏈DNA用量的優(yōu)化55435實(shí)驗(yàn)方案的選擇性研究5544小結(jié)56參考文獻(xiàn)57結(jié)論60致謝61碩士期間發(fā)表論文62聲明63第1章前言11生物傳感器生物傳感器是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)換器緊密的結(jié)合，對某些特定種類的化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性及可逆性的分析裝置1。敏感元件通常是將生物體的某種成分（如抗原、抗體、DNA等）或生物體本身（如組織、細(xì)胞等）固定在一器件。生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、成本低、分析速度快、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，是發(fā)展生物技術(shù)不可缺少的一種先進(jìn)的檢測及監(jiān)控方法，同時也是對物質(zhì)在分子水平上進(jìn)行快速和微量分析的方法之一2。生物傳感器36作為一門新興高科技技術(shù)，它涉及的多種學(xué)科包括生物、物理、化學(xué)、材料、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等在內(nèi)，在生物、醫(yī)學(xué)、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、軍事等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力有著巨大的，已經(jīng)成為二十一世紀(jì)生命科學(xué)和信息科學(xué)發(fā)展的一個重要方向。111生物傳感器的概念、組成及分類生物傳感器是將一種生物材料（如組織、細(xì)胞、細(xì)胞器、酶、抗原、抗體、DNA等）或生物衍生材料、生物模擬材料等與物理化學(xué)傳感器或傳感微系統(tǒng)緊密結(jié)合或聯(lián)系起來，發(fā)揮其分析功能7。生物傳感器由生物敏感膜（分子識別元件）、信號轉(zhuǎn)換器及信號處理器三部分構(gòu)成（如圖11所示）。其中，生物敏感膜主要有酶、抗體、DNA聚合物、細(xì)胞受體、細(xì)胞、組織等生物活性單元，它們均具有特異選擇性作用的功能。信號轉(zhuǎn)換器8主要有電化學(xué)電極、光敏管、熱敏電阻、場效應(yīng)管、壓電晶體和表面等離子共振器件等。信號轉(zhuǎn)換器是將被測物與生物敏感膜特異性結(jié)合后所產(chǎn)生的生物的、化學(xué)的和物理的等信息轉(zhuǎn)變成電信號、光信號、熱信號等，通過檢測這些信號就能達(dá)到分析檢測被測物的結(jié)果。圖11生物傳感器的結(jié)構(gòu)FIG11THESTRUCTUREOFBIOSENSORS生物傳感器生物敏感元件的特異選擇性決定了生物傳感器的選擇性，而它的整體組成則對它的其他性能存在影響。關(guān)于生物傳感器的分類方法很多中，其中，根據(jù)生物物質(zhì)分類，可分為酶傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞器傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、基因（DNA）傳感器等9；根據(jù)轉(zhuǎn)換器分類，可分為半導(dǎo)體式、光敏電阻式、熱敏電阻式、電化學(xué)電極式、壓電晶體式、等離子體共振式等（如圖12所示）。圖12生物傳感器的分類FIG12THECLASSIFICATIONOFBIOSENSORS112生物傳感器的工作原理生物傳感器是一門高新技術(shù)，它涉及多個學(xué)科及領(lǐng)域，其基本原理是當(dāng)被分析物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入生物敏感元件，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)；這些反應(yīng)所產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的聲、光、電等信號，再經(jīng)檢測放大器放大并輸出，便可知道被分析物質(zhì)的量或濃度10（如圖13所示）。圖13生物傳感器的原理FIG13PRINCIPLEOFOFBIOSENSORS113生物傳感器的特點(diǎn)在生物、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)和軍事等領(lǐng)域，生物傳感器有著相當(dāng)重要的應(yīng)用價(jià)值。與其他方法技術(shù)相比，生物傳感器具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）測定范圍廣泛；（2）成本低；分析速度快；（3）準(zhǔn)確度高；（4）靈敏度高；（5）操作系統(tǒng)，易于實(shí)現(xiàn)自動分析；（6）專一性強(qiáng)，不易受其他因素，如顏色、濁度等的影響；（7）可進(jìn)入生物體內(nèi)。114免疫傳感器免疫傳感器是生物傳感器中重要的、新興的一種，由于它的高度特異性、敏感性和穩(wěn)定性受到關(guān)注，它的問世給傳統(tǒng)的免疫分析帶來了很大的發(fā)展。免疫傳感器是將傳統(tǒng)的免疫測試和新興的生物傳感技術(shù)結(jié)合在一起，從而具有兩者的許多優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠提高靈敏度及測試精度，還可以減少分析時間，也可以使測定過程變得更加簡單，更容易實(shí)現(xiàn)自動化?；谶@些特點(diǎn)，免疫傳感器的應(yīng)用前景非常廣闊，應(yīng)加大力度發(fā)展11。1141免疫傳感器的概念免疫傳感器的概念是在20世紀(jì)90年代首次由HENRY等提出的，它是在特異性免疫放映的技術(shù)上，引入了高靈敏的傳感技術(shù)，將兩者結(jié)合起來，檢測抗原抗體特異性反應(yīng)的生物傳感器，它的生物敏感膜上偶聯(lián)有抗原或抗體分子，與信號轉(zhuǎn)換器相結(jié)合，構(gòu)成了一種新型的生物傳感器12。免疫傳感器的測定原理是基于抗原（或半抗原）和其特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物?？乖涂贵w結(jié)合而發(fā)生的免疫反應(yīng)，特異性很高，即它是具有極高的選擇性和靈敏度。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的免疫傳感器也具有了選擇性高、靈敏度高以及快速、操作簡便等特點(diǎn)。隨著研究的不斷發(fā)展，現(xiàn)代的免疫傳感器以廣泛的應(yīng)用在各個領(lǐng)域。1142免疫傳感器的分類免疫傳感器按是否進(jìn)行標(biāo)記，主要分為標(biāo)記免疫傳感器和非標(biāo)記免疫傳感器13。在檢測前就對被測物進(jìn)行了標(biāo)記，通過對標(biāo)記物的量變監(jiān)控免疫反應(yīng)的免疫傳感器，被稱為標(biāo)記免疫傳感器。這種傳感器的非特異性影響小，但檢測過程很復(fù)雜。非標(biāo)記免疫傳感器是通過直接測定抗原抗體的復(fù)合物形成時的物理化學(xué)變化，能夠極大地簡化制備及操作的過程（如圖14所示）。非標(biāo)記免疫傳感器已成為生物傳感器的一個重要發(fā)展方向。近幾年來，石英微天平型免疫傳感器、表面等離子共振型免疫傳感器以及電容型免疫傳感器成為研究的熱點(diǎn)1415。圖14非標(biāo)記免疫傳感器的原理FIG14PRINCIPLEOFLABELFREEIMMUNOSENSOR免疫傳感技術(shù)結(jié)合了生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)與醫(yī)學(xué)為一體，有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，將影響臨床、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域里的實(shí)用性研究。隨著生物技術(shù)、納米技術(shù)、材料科學(xué)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等技術(shù)的發(fā)展及其在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域的迫切需要，免疫傳感器在各個方面將會得到改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的發(fā)展16。115DNA生物傳感器DNA生物傳感器與免疫生物傳感器相同，都是20世紀(jì)90年代逐漸發(fā)展起來的一種新的傳感器技術(shù)。從其發(fā)明至今，DNA傳感器一直引起了人們的廣泛的關(guān)注，這是由于它簡單、無毒、快速、成本低、靈敏度高、可用于活體檢測等優(yōu)勢1718。特別是近幾年來，DNA傳感器成為當(dāng)今生物傳感器領(lǐng)域中的前沿性課題之一。它是以DNA作為生物敏感元件，與相應(yīng)的換能器結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對特定化學(xué)物質(zhì)的作用，產(chǎn)生相應(yīng)的可檢測信息（如熱效應(yīng)、電效應(yīng)、光效應(yīng)、場效應(yīng)及質(zhì)量變化等）19的傳感裝置。1151DNA生物傳感器的工作原理DNA生物傳感器和其他生物傳感器一樣，包含兩部分分子識別元件（DNA）和信號轉(zhuǎn)換器。通過一些生物、化學(xué)或物理作用，待測物、分子識別元件以及信號轉(zhuǎn)化器件之間彼此相互聯(lián)系。識別元件主要用來感知樣品中待測物質(zhì)的含量；轉(zhuǎn)換器則將識別元件（DNA）感知的信號轉(zhuǎn)化為可以觀察記錄的信號（如電流