人內皮細胞型一氧化氮合成酶（HENOS）第7外顯子GLU298ASP（894GT）單核苷酸多態(tài)性與糖尿病腎病相關性研究青島大學碩士學位論文人內皮細胞型一氧化氮合成酶（HENOS）第7外顯子GLU298ASP（894GT）單核苷酸多態(tài)性與糖尿病腎病相關性研究姓名王忠超申請學位級別碩士專業(yè)內分泌學指導教師苗志敏20040301Y618136中文摘要894GT單核苷酸多態(tài)性與糖尿病腎病相關性研究中文摘要目的探討北方地區(qū)漢族人內皮細胞型一氧化氮合成酶HENOS第7外顯子II對238方法本研究應用聚合酶鏈反應，瓊脂糖凝膠電泳和限制性內切酶BAN進行分析，其中2型糖尿病患者138例，根據(jù)尿微量白蛋白排泄率UAER的結果以及糖尿病腎病診斷標準將2型糖尿病人分為2個亞組糖尿病腎病組DN組，6L例、糖尿病非腎病組DN一組，77例同時選擇同地區(qū)年齡以及性別相近的健康人為正常對照組CON組，100例。采用高濃度瓊脂糖凝膠電泳分離技術，應用卡方檢驗比較各組間的等位基因和基因型頻率，以及根據(jù)糖尿病患者的有關臨床生化指標，應用LOGISTIC多元逐步回歸分析此臨床生化指標、等位基因以及基因型與糖尿病腎病的相關性。程、糖化血紅蛋白以及空腹血糖?；颊咛悄虿∧I病的發(fā)生有關，該多態(tài)性是糖尿病腎病的單核苷酸多態(tài)性并可作為遺獨立危險因素。關鍵詞2型糖尿?。蝗藘绕ぜ毎脱趸铣擅富?；單核苷酸多態(tài)性糖尿病腎病尿微量白蛋白排泄率。中文摘要研究生王忠超內分泌導師苗志敏教授墨苧塑量LIBETWEENOFTHEREATIONSHTHEPSTUDYOFTHEHUMANAT7NUCIEOTIDEEXONPOIYMORPHISIMSSINGIEANDCE|LNITRICOXIDEENDOTHEIIATDJABETICNEPHROPATHYABSTRACTSTOTHEBETWEENTHERELATIONSHIPOBJECTIVEINVESTIGATEEXON7OFLNITRICNUCLEOTIDEATTHEHUMANENDOTHELIALCELSINGLEPOLYMERPHISMOXIDEANDDIABETICINNORTHERNHANNEPHROPATHYPATIENTSSYNTHASEHENOSGENE2WITHDIABETESMOLLITUSTYPEMETHODSTHEANDAT7OFTHEGLU298ASP894GTALLELEEXONHUMANGENOTYPEENDOTHELIALCELLNITRICOXIDEIN238WERESYNTHASEHENOSGENESUBJECTSEXAMINEDCHAINBYANDPOLYMERASEREACTION，AGAROSEGELELECTROPHORESISRESTRICTIONWHICHTHEREWERE2138CASESOFDIABETESENZYMEBANII，OFTYPEMELLITUSAND100NORMALOFENTS2DIABETICWASSUBJECTSTHEGROUPPATJTYPEDERIDEDINTOTWOCASESSUBGROUPSDIABETICNEPHROPATHYGROUPDNGROUP，6LANDDIABETICTONONNEPHROPATHYCASESACCORDINGGROUPDNGROUP。77URINARYALBUMINEXECRETIONALLELEANDEACHWERERATEUAERTHEGENOTYPEAMONGGROUPWITHCONCENTRATIONCOMPAREDHIGHERAGAROSEGELELECTROPHORESISACCORDINGC1TOTHEINICALBIOCHEMICALRESULTSOFDIABETICRELATPATIENTS，THEJOSHIPTHECLBETWEENINICALDNBIOCHEMICALANDWASRESULTS，ALLELE，GENOTYPEINVESTIGATEDBYLOGISTICANALYSISTHEOFTRWSUITSBOTHALLELEANDTGWEREFREQUENCIESGENETYPEINTHANTHOSEINANDNORMALHIGHERDNGROUPDNGROUPWASNOTHEREDIFFERENCEBETWEENDNANDNORMAISIGNIFICANTSUBJECTSSHOWEDPO05STATISTICSTHATALLELETANDTGWEREANALYSISGENOTYPEASSOCIATEDWITHDIABETICIN2DIABETICANDNEPHROPATHYTYPEPATIENTSPO022THATTHELOGISTICREGRESSION0020，RESPECTIVELYANDANALYSISSUGGESTEDNUCLEOTIDEAT7OFEXONHENOSGLU298ASP894GTSINGLEPOLYMORPHISIMSGENEBERISKFACTORFORDIABETICA1LNDEPENDENTMAY英文摘要THETGTHISTHATOFCONCIUSIONFINDINGSSUGGESTEDGENOTYPEBENUCLEOTIDEOFHENOSASSOCIATEDWITHGENEMAYPOLYMORPHISMTSINGLEDIABETICINNORTERNHANWITH21ITUSDIABETESMELNEPHROPATHYPATIENTSTYPEANITBERISKFACTORFORCANDIABETICANDMAYINDEPENDENTBENEPHROPATHYSERVEDASANINHERITEDMARKEROFOFDNSUSCEPTIBILITY2DIABETESMEIIIIAICEIKEYITUSHUMANENDOTHEINITRICOXIDEWORDSTYPENUCIEOTIDESYNTHASEGENEHENOSSINGIESMSNPDIABETICPOIYMORPHIIAIINBUMEXECRETIONRATENEPHROPATHYDNURNARYPOSTGRADUATEWANGDIRECTEDZHIMINBYMIAO2，JI一894G,T單核苷酸多態(tài)性與糖尿病腎病相關性初步研究1引言糖尿病腎病DN是最常見的糖屎病微血管并發(fā)癥之一。眾多臨床研究表明高血糖是發(fā)生DN的必要因素，但不是唯一因素。流行病學調查顯示DN的發(fā)生均有家族集聚現(xiàn)象“3，不同種族DN發(fā)病率也有差異。1。大多數(shù)學者認為，T2DM是一種復雜的多基因疾病，表現(xiàn)為遺傳基因多態(tài)性，但是迄今何為2型糖尿病腎病的易感基因目前仍無定論，DN的發(fā)生可能是由多個不同的易感基因與環(huán)境因素共同作用的結果。關于DN遺傳易感性的研究正深入的進行，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病腎病相關的基因變異約有幾十種，涉及糖代謝及其他各可能的病理生理環(huán)節(jié)。一氧化氮NO是一種重要的血管源性細胞因子，在維持內皮依賴性血管舒張、調節(jié)腎臟微循環(huán)、維持基礎血壓以及抑制腎小球系膜細胞增生中起關鍵作用，另外，尚有抗血小板聚集以及黏附作用。N0在DM早期的生成增加，活性增強，參與了腎小球高濾過機制，并增加了大分子通透性嘲；DM中晚期腎臟的N0生成明顯下降，通過血流動力學和代謝等方面影響腎臟的微血管床，加速了腎小球基底膜和系膜基質增生，并導致腎小球血管壁結構和功髓紊亂嘲。HENOS是合成一氧化氮的關鍵酶，該酶的結構和或活性異常通過影響N0生成，參與糖尿瘸微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種HENOS基因多態(tài)可能與究表明，HENOS基因編碼的298位氨基酸并不位于酶的催化位點或輔助因子結合域，是位于其結構的延伸部分“，GLU298ASP變異使酶的結構更為緊密，從而影響了酶的一級和二級結構導致酶活性改變，使NO的生成減少“”。最近的研究表明GLU298ASP變異與冠狀動脈性疾病“”、急性心肌梗塞、原發(fā)性高血壓”1、冠狀動脈粥樣硬化變異與糖尿病腎病的相關性無統(tǒng)計學意義，但NEUGEBAUER。1等對日本人調查研究表明，2型糖尿病患者伴腎病與無腎病相比，二者基因型分布明顯不同，NOIRI”“研究認為GLU298ASP變異是終末期腎衰尤其是糖尿病腎病腎衰的預示因素。鑒于以上不同的報道，本研究對138例青島地區(qū)漢族2型糖尿病患者進行了人內皮細胞型氧資料與方法率分析，旨在探討該位點單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病患者DN的關系。2資料與方法21研究對象及分組211糖尿病組其中男67例，女71例平均年齡5929928歲，均為我院內分泌科住院和門診患者。6個月內連續(xù)兩次測定尿微量白蛋白排泄率UAER，根據(jù)UAER結果將2型糖尿病人分為2個亞組歲，UAER20200MIN。854歲，AER20PGMIN。研究對象均為本院內分泌病房和門診就診和治療的漢族人，受檢者之閶無血緣關系，經(jīng)詢問病史、查體和必要化驗排除其他引起蛋白尿疾病。212正常對照組型糖尿病患者相匹配。研究對象均為從本院健康查體中心篩查出的健康成人，經(jīng)檢查除外糖尿病、冠心病、高血壓病、高脂血癥、痛風以及腎臟疾病。22標本采集和保存221所有受檢對象均于隔夜抽空腹血，采集肘靜脈血6ML。2211取已經(jīng)消毒的5ML3M1全血，顛倒混勻，一700C冰箱保存，以備提取DNA行基因多態(tài)性分析。2212TG、總膽固醇0C、尿素氮、肌酐、谷丙轉氮酶、谷草轉氨酶以及尿酸。2資料與方法2213留取IML全血，用50ULEDTA抗凝，混勻，測定HHAIC。222所有的糖尿病患者，留取空腹8H以上的上午6OO至第二天上午6ML，置00共24小時總尿樣，二甲苯防腐，測定總量記錄，混勻后取10于15ML離心管中，一70“3冰箱保存，待測尿微量白蛋白。223所有的標本統(tǒng)一編號保存。各項指標均統(tǒng)一標準，一批完成測定。23實驗儀器1臺式離心機上海手術器械廠800型Q臺式高速離心機上海安亭科學儀器廠TGL1613型0低溫高速離心機美國BECKMAN和SIGMA冰箱4，一20和超低溫一700C冰箱日本SANYO恒溫水浴箱上海躍進醫(yī)療器械廠旋渦混合器上海醫(yī)科大學儀器廠XW一804HYBAIDUSPCR擴增儀THERO電泳儀美國BIORAD水平電泳螬北京六儀囂廠DYYIIL31BH岱0N紫外投射儀WP一92一L型NDFM一96型10管放射免疫計數(shù)器N微量移液器德國BRAND和EPPENDORFFAEL00N電子稱量儀METTLERN控溫烘干箱濰坊醫(yī)療器械廠KWI型0電熱磁力攪拌器深圳天南海北有限公司N實驗室常用的玻璃儀器N全自動生化分析儀日立公司產(chǎn)品7170型N紫外光光度分析儀電化學發(fā)光儀德國ROCHE2010ELECSYSN但，”動勖幻力的町螂糖化血紅蛋白測定儀BIORAD公司DIASTAT24實驗試劑室溫20一250C存放，上海SBS賽百勝公司產(chǎn)品。葡萄糖1479，加蒸餾水至LOOML，高壓滅菌后4“C冰箱儲存?zhèn)溆?。資料與方法3異丙醇4無水乙醇LIFE5引物一對由INVITROGENTECHNOLOGIES公司合成，溶解并稀釋至LO“MOLL，置于一200C冰箱儲存?zhèn)溆谩?5MM，置于一200C冰箱儲存?zhèn)溆茫琍ROMEGA公司產(chǎn)品。DNAINBUFFERB濃度DNA聚合酶TAQPOLYMERASESTORAGE7TAQ5UPL，置于一200C冰箱儲存，PR叫EGA公司產(chǎn)品。8MGCLZ溶液MAGNESIUMX10DNA910BUFFERLOONFLIKCL100【LMPCRTAQPOLYMERASETRISHCLPH9，AT25，1TRITONX100，PROMEGA公司產(chǎn)品10去核酸酶水心UCLEASEFREEWATERLOOML，室溫20一25存放PROMEGA公司產(chǎn)品。EDTANAPH80220ML，加蒸餾水至1000ML。12瓊脂糖凝膠AGAROSEPROMEGA公司產(chǎn)品136XLOADING14溴化乙錠EB染液LOMGML15限制性內切酶BANPR觚GA公司產(chǎn)品。16RE10XBUFFER60MMTRISCLPH75，1MMNACI，60MMMGCL2，LOMMDTT，PROMEG公司產(chǎn)品。17ACETYLATEDBSALOUUL，PROMEGA公司產(chǎn)品。18限制性內切酶BAN大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。1910HBUFFER500ULLOMMTRISCLPH75，LOOMMKCL，01MMEDNA，1枷DT。001BSA，015TRITONX一100，50GLYCER01置于一200C冰箱儲存，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。20LOXLOADINGMGCLLOMM司產(chǎn)品。21尿微量白蛋白放射免疫分析試劑盒3X100管ALB標準品S,S。4資料與方法CV15，置于4。C冰箱儲存，北京北方生物技術研究所產(chǎn)品。22尿素氮，肌酐，谷丙轉氨酶，谷草轉氨酶，谷氨酰轉肽酶以及尿酸測定試劑美國BECKMAN公司產(chǎn)品。23葡萄糖測定試劑美國BECKMAN公司產(chǎn)品，批間差異62批內差異36。24膽固醇測定試劑美國BECKMAN公司產(chǎn)品，批間差異21，批內差異16。25甘油三酯測定試劑美國BECKMAN公司產(chǎn)品，批間差異2，2，批內差異15。26胰島素測定試劑美國ROCHE公司產(chǎn)品，批間差異21，批內差異1麟，DNA27核酸分子量標準100BP低溫保存，PROMEGA公司產(chǎn)品。25實驗方法251L臨床以及生化指標1所有研究對象均行身高、體重、血壓測量，計算體重指數(shù)BMI體重身高2。2血漿葡萄糖測定用氧化酶法。3HPLC法測定糖化血紅蛋白。4電化學發(fā)光法測定空腹胰島素。5甘油三酯TG、總膽固醇TC、尿素氮、肌酐，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、谷氨酰轉觚酶以及尿酸測定用CHODPAP法。6尿微量白蛋白排泄率UAER檢測放免法A尿樣處理超低溫冰箱取出，靜置半小時，充分混勻，編號樣品管待測。B試劑重配各標準品分剮準確加入O5ML緩沖液溶解，溶解15分鐘后搖勻“JIALB標記物用LOML緩沖液溶解；兔抗ALB抗體用105ML緩沖液溶解驢抗兔免疫分離劉充分混勻。E加樣NSB管和0管分別加入緩沖液250和50UL，6個標資料與方法ALB，標準品，各樣品管加入50UL樣品設定準管各加入50UL抗體液LOOUL，旋渦混合器充分混勻；除去總T管和NSB管其余各管加入兔抗一ALB抗體200UL?；靹?。D水浴將各管同時放入恒溫水浴箱，預先設定溫度37，溫育30分鐘。E加分離劑除外總T管快速準確向其余各管加入500UL驢抗兔免疫分離劑，混勻，室溫放覆15分鐘。F離心分離各管同時置于低溫高速離心機，以3500轉分離心15分鐘，吸取上清。G測定每次10管，DFM一96型LO管放射免疫計數(shù)器測定各沉淀管的放射性記數(shù)C踟。最后根據(jù)24小時的尿量以及白蛋白含量計算出24小時尿白蛋白排泄率。252提取外周血白細胞基因組INA提取基因組DNA。具體步驟如下合。2室溫下放置3分鐘5，000RPM離心3秒，收集沉淀。3用LMLGN結合液懸浮，搖勻，5，000RPM離心3秒，收集沉淀。4用05ML漂洗液洗兩次以及IML無水乙醇洗一次混勻，5，000RPM離心3秒，收集沉淀。5用08ML無水乙醇懸浮，裝入離心純化柱，12，000RPM離心30秒，倒掉廢物收集管里的乙醇，再離心1分鐘，盡量除去無水乙醇。ULTE緩沖6將純化柱套入一個干凈的2OML的離心管中，加入100液于純化樹脂上不鏈粘在管壁上，室溫下放置3分鐘，12，000RPM離心2分鐘。7重復6步驟一次。8離心管中收集到的液體既是冼脫下來的基因組DNA，取40UL電泳2瓊脂糖，I20V，TO分鐘撿測。253吸收光譜法測定ON濃度和純度以及ON的保存I吸收光譜法測定DNA濃度在比色杯中加入LMLTE緩沖液，放入6資料與方法分光光度計中讀取325NM數(shù)值，并將儀器調零取空自杯，放入含有DNA樣品定OD值OD230OD260，OD260OD280比值在L820，表明質量較好的DNAUGLML0D260002。使用時反復的凍融會使DNA分子的斷裂，4。C存放可以避免這一點，但是同時可能有些樣品會因為各種原因降解，因此將DNA分裝成數(shù)份，近期使用的存放于40C，長期備存則存放于一200C或一700C。254HENOS基因第七外顯子894GT多態(tài)的檢測T位點的基因片段引揚序列上游引物5AAGGCAGGACAGTGGATGGA一3下游引物5_CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA一38在200UL的薄壁反應管中，按照25UI的反應體系，依次加入下列各組分去核酸酶水118PLLOXBUFFER25虬15PLMGCI25MM4DNTP25MG20兒上游引物5PMOLL15乩L5PL下游引物5PMOLLDNA聚合酶5UL0，2PLTAQ2，OPL模板DNAB吹打后輕彈管壁混勻，L，000RPM瞬時離心。C按照如下的程序進行PCR的擴增94。C預變性5分鐘，94變性30秒60退火30秒720C延伸45秒循環(huán)35次以后于72終延伸5分鐘。225瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物取PCR擴增產(chǎn)物4UL，按照4LVV與6XBUFFER混合后，上LOADING資料與方法樣子25瓊脂糖凝膠舍有05UGMLEB，05TBE中120V電壓恒流電泳30分鐘，于紫外投射儀下觀察結果。用DNAMARKER做對照，可以觀測到擴增片段長度為248BP。見附圖13BANII限制性酶切A取200UL的薄壁反應管，在20UL的反應體系中，依次加入下列各組分103PL去核酸酶水RELOBUFFER20虬BSA10UGUL02兒BANII10UUL05虬7OWLPCR反應產(chǎn)物待分離。23瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物取酶切產(chǎn)物LOUL，按照5LVV與6LOADINGBUFFER混合以后，上樣于X3瓊脂糖凝膠含有05UGMLEB，O5TBE中80V電壓恒流電泳60分鐘，05溴化乙錠染色LOMIN，于紫外投射儀下觀察結果，用DNAMARKER做對照，可以觀測到擴增片段長度有248BP、163BP、85BP。見附圖126統(tǒng)計學處理正態(tài)分布計量資料用XS表示，兩組間比較用T檢驗。運用HARDYWEINBERG檢驗確認標本的群體代表性，基因計數(shù)法計算各組基因型頻率及等位基因頻率，基因型頻率及等位基因頻率比較用X2檢驗。用LOGISTIC多元逐步回歸分析尿微量白蛋白排泄率UAER與各臨床資料以及人內皮細胞型一氧化氮合成酶各基因型或等位基因與糖尿病腎病的相關性用相對危險度表示。所有數(shù)據(jù)用SPSSL15統(tǒng)計軟件處理。結果3結果31患者一般臨床及實驗室資科糖尿病組與正常對照組的空腹血糖、甘油三酯有顯著性差異PO05年齡、體重指數(shù)、肌酐、甘油三酯、轉氨酶以及尿酸等無顯著性差異。依據(jù)尿微量白蛋白排泄率UAER將糖尿病組分為兩個亞組ON組和DN一組，兩亞組間性別構成無統(tǒng)組間臨床生化資料差異均無顯著性差異PO05，見附表1、2。32型頻率分布情況PCR產(chǎn)物以及BAN種片段。酶切以后僅見248BP片段為含突變等位基因的純臺予基因型TT少，正常組和糖尿病腎病組各測得1例和2傭；完全酶切得到大小為163BP和85BP兩個片段的是段的為雜合子基因型TG。由此記數(shù)出8946T等位基因和基因型頻率分布情況。見附表3、5。33各組等位基因頻率和基因型頻率的分析預期值差異無顯著性，符合HARDYWEINBERG遺傳平衡定律。見附表7、825257X2分析顯示，與DN一組相比，DN組TG基因型分布頻率顯著升高XTG基因型以及T等位基因分布頻率升高更為顯著，X2分別為13499、14，749，OR較，TG基因型以及T等位基因分布頻率無明顯的差異PO05。34糖尿病腎病各危險因素與糖尿病腎病相關性的分析9討論糖尿病腎病各危險因素LOGISTIC逐步回歸分析選擇年齡、性別、病程、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹胰島素、甘油三脂、總膽信區(qū)間為107797見附表9。4討論一氧化氮N0是一重要的血管源性細胞因子，在維持基礎血壓、內皮依賴性血管舒張和調節(jié)腎臟微循環(huán)以及抑制腎小球系膜細胞增生中起關鍵作用”，此外NOHENOS尚有抗血小板聚集以及黏附作用。研究顯示，N0的異常與糖尿病腎病有關TOO是合成NO的關鍵酶，該酶的異?？梢酝ㄟ^影響N0的生成參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。SCHIMASAKI成減少。日本的研究“”結果表明2銎糖尿病患者伴腎病與無腎病相比，二者的基因型分布明顯不同。本研究涉及HENOS第7外顯子基因中248對堿基。野生型有個BANII作用位G后則為純合子變異，酶切以后只有248BP片段，雜合子變異則為248BP、163BP和85BP。這種由單一堿基變異形成的多態(tài)性即為SNP，被認為是繼限制性長度片段多態(tài)性RFLP和簡短串聯(lián)重復STR之后新一代的遺傳標志，是基因變異中最多的一種，其最低的等位基因頻率大于或等于1，因而不同于其他罕見變異。盡管就單個SNP而言只含有二種變異體，變異程度不如微衛(wèi)星或小衛(wèi)星DNA，但SNP在基I0堿基中有約3X5個SNP位點，大約占整個DNA多態(tài)性的90“。在任何已知或未知疾病基因附近都能找到眾多的SNP，因此就整體而言，SNP的多態(tài)性要高得多1?，F(xiàn)己成為研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關基因的一種重要工具。DN為多基因遺傳性疾病有的學者將DN的發(fā)生分為三種遺傳模式1主效基因作用模式，即認為DN是高血糖與某一基因多態(tài)相互作用的結果；2中效基因作用模式，即認為DN是血糖控制不良與幾個基因中任意一個或幾個基因多態(tài)相互作用所致，其中每個基因都有獨立的作用，但對DN易感性有累加作用，其整體效應受人群中致病等位基因相對頻率的影響3微效基因作用模式。即蹦是血糖控制不良與多個遺傳位點的改變相互作用的結果，每個遺傳位點的作用都是微效的，其合討論力形成了洲的遺傳易感性。DN屬于哪一種遺傳模式以及遺傳因素如何影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，目前仍無定論。本研究顯示，在138例糖尿病患者中糖尿病腎病組DN組T等位基因和TG基因型分布頻率均顯著高于糖尿病非腎病組DN組基因分布頻率升高更為顯著0R值分別為306、3，863，X2分別為13499、14749，同時本研究發(fā)現(xiàn)DN一組與正常對照組相比較，TG基因型以及T等位基因分布頻率無聯(lián)，T等位基因和TG基因型可能是DN的風險修飾因子，是糖尿病腎病的單核苷酸多態(tài)性及可作為其遺傳標志之一。眾多研究證實DN是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結果，單純有遺傳基礎并不一定導致糖尿病的發(fā)生。本研究選擇糖尿病腎病可能的危險因素如年齡、病程、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹胰島素、甘油三脂、總以尿微量白蛋白排泄率作為因變量做LOGISTIC逐步回歸分析，結果顯示HENO基REGRESSION方程，統(tǒng)計學分析表明年齡、體重指數(shù)、收血紅蛋白被選入LOGISTICTTG基因型是糖尿病腎病危險因素，在逐步回歸分析過程中，除去病程、空腹OR2919，95可信區(qū)間為107797，說明其是糖尿病腎病的獨立危險因素之一。終上所述，與某些DNA編碼區(qū)中堿基突變的直接致病效應不同，HENOS第7外顯核苷酸微衛(wèi)星多態(tài)性分析等其他的研究方法更為簡便可靠，擴增后不像后者那樣重基因的頻率很容易被估計，在臨床應用中有更好的可操作性，可作為篩查DN遺傳易感人群的手段，并通過關聯(lián)分析和聯(lián)鎖不平衡分析尋找DN的易感基因，同時可以結合其他易感基因和或相關位點進行聯(lián)合分析，為DN的旱期診斷提供更為理想的理論依據(jù)。本研究僅是從基因多念性方面對DN的易感基因進行了初步研究，用單核營酸多態(tài)性分析的方法，證實了在北方漢族2型糖尿病腎病患者中有HENOS第7外顯子單核苷酸多態(tài)性的存在。迄今為止，國內外對2型糖尿病腎病易感基醫(yī)的研究尚未取得結論明確結論，DN易感基因多態(tài)位點研究能否獲得成功，并得出可靠結論，有賴于在了解DN病理生理基礎上挑選正確的候選基因。并依賴于可使基因多態(tài)位點快速而準確定位的分子生物學實驗室技術的發(fā)展。目前，中國人2型糖尿病易感基因定位已經(jīng)取得了很大的進展，隨著第三代遺傳標記一單核苷酸多態(tài)性SNP的DNA芯片技術的應用，2型糖尿病腎病的遺傳學研究必將從中受益，從而揭示DN的發(fā)病機制，有利于易感人群的早期篩查早期干預。5結論單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病患者糖尿病腎病的發(fā)生有關聯(lián)，是糖尿病腎病的單核苷酸多態(tài)性并可作為遺傳標志之一。2的獨立危險因素。附錄表1DM組與司呈掌對照組間臨慶和實驗室資料F較XS注糖尿病組與正常對照組的空腹血糖、甘油三酯有顯著性差異PO05。附錄表2DN一組與ON緝間臨床和實驗室資料比較XSP項目DN一組DN組性別女男32293938一一年585485460241013029齡歲病程年1104248120L251055687992069381143O73體重KG006身高CM163657791661679425。683。OL25，12388O33體重指數(shù)KGM21211078LO58收縮壓MMHG12180713舒張壓76355。08O53瑚LIG7686454糖化血紅蛋白8481348591330641029258O09空腹血糖MMOLLL1L，28416空腹胰島素MMOLL13454791230407014026尿素氮MMOLLL61L17L6，60330UMOLL8351132L92264380009肌酐036總膽固醇MMOLL5101475281，58甘油三酯MMOLLL13205L146064013049谷丙轉氨酶MMOLL2721437256L1324208373504L谷草轉氨酶MMOLL2Z，131106UMOLL21657567225，41908048尿酸1122758O00UAERUGLMIN4677177跗錄圈1HENOS第7外顯子PCR產(chǎn)物BANII酶切產(chǎn)物分析注共撿出85、163、248BP3砷F段。酶切以后僅見248BP片段為含突變等位基因的純臺子基因型TT少，正常組和糖尿病腎病組各測得1個和2個；完全酶切得到大小為163BP和85BP兩個J段的是不含突變位點的純合子基因型GG；DNALADDER。酶切以后三個片段都有的為雜合F墉九掣，|【；。MARKER為LOOBP附錄表3100例正常人和138例糖尿病患者894GT基因型分布頻率因理論值T5，并與TG基因型中分析，保證每個格子理論值T5，表4100例正常人和138侈L耱尿病患者894GT基因型分布頻率的比較圖2100例正常人和138例糖尿病患者894GT基因型分布頻率的比較附錄表5100例正常人和138倒糖屎病患者894GT等位基因分布頻率表6100例正常人和138例糖尿病患者894GT等位基因分布頻率的比較圖3100例正常人和138例糖尿病患者894GT等位基因分布頻率的比較附錄表7正常對照組基因型頻率的HARDYWEINBERG檢驗表沒有統(tǒng)計學意義。表8糖尿病組基因型頻率的HARDYWEINBERG檢驗表異沒有統(tǒng)計學意義。ST表9糖尿病腎病各危險因素LOGIIC逐步回歸分析結果VARIABLESINTHEEQUATION95OCLFORBSEWALDDFEXPBSIGEXPBLOWERUPPERL404LA病程5581LL25，038000T747L23STEP5LD00CONSTANT7991081287970033361089625100214001132173LSTEP2B病程耶LC14410，504L00L15931，2022T10465CONSTANT4LO10000008085146530L3C病程34810411262001141711561736STEPLHBMC49415I10，715。001L638L2L92202I535FBGZ6了08Z10，5790011306L_112LL000000CONSTANT一LL_505205731280108I00313801U6L7064D病程3228，859STEPHBATC533169LT，083T1錨L24SZ，332LFB62970861184300113461136L，594TG基因型1071512437II037291910697968CONSTANT一1236Z2231307141000，000AVRRIABLESENTEREDONL螨程STEPBVARIABLESENTEREDONSTEP2LBALCCENTEREDVATIABLESOFFSTEP3FBGDVUIAHLESENTEREDOLLSTEP4基醫(yī)型19附錄縮略語的中英文名稱縮略語英文名稱中文名稱HENOSHUMANENDOTHELIALCEIL人內皮細胞型一氧化氮NITRICOXIDESYNTHASE合成酶SNPNUCLEOTIDESINGLEPOLYMORPHISM單核苷酸多態(tài)性DNDIABETICNEPHROPATHY糖尿病腎病UAERALBUMINEXECRETIONRATEURINARY尿微量自蛋白排泄率N0NITRICOXIDE一氧化氮DMDIABETESMELLITUS糖尿病EDTAETHYLENEDTAMINETETRAACETICACID7,胺四乙酸FBGBLOODFASTINGGLUCOSE空腹血糖FINSFASTINGPLASMAINSULIN空腹胰島素HBALCALEHEMOGLOBIN糖化血紅蛋白TCTOTALCHOLESTEROL總膽固醇TGTRIGLYRIDE甘油三酯RFLPRESTRICTIONFRAGMENTLENGTH限制性長度片段多態(tài)性POLYMORPHISMSTRSHORTTANDEMREPEAT簡短串聯(lián)重復PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈反應墨耋苧墮參考文獻BBA1FREEDMANI，TUTTLEB，SPRAYJFAMILIALPREDISPOSITIONTONEPHROPATHDIABETESINAFRICANAMERICANSWITHNONINSULINMELLITUSJDEPENDENTYAMJKIDNEYDIS，1995，2557LO一713DINPIMARWA1DIABETICDISEASE2。NELSONG，KNOWLERC，PETTITTJ，ETKIDNEYINDIANSJDIABETESCARE，1993，161335341AL。NITRICOXIDEND。ETA，BELYAEV3RIPPINJD，PATELSYNTHASEGENEDIABETICANDMAR463POLYMORPHISMSMAR2003154268EPUBNIOXIDE4SHIMIZUR，ETA1ENDOTHELIALTRICT，ONUMAT，KAWAMORISYNTHASEANDOFTHEDIABETICRESC1INPRACT，DEVELOPMENTGENENEPHROPATHYDIABETES2002DEC583179855LINMA1LELEAIN4INTRONOFECNOSWILLNOTINCREASES，QUH，QIUGENERISKIN2THEOFDIABETICDIABETESOFCHINESENEPHROPATHYTYPEPOPULATIONNEPHRON2002AUG914768A1KLDOSEREDUCTASEISASSOCIATED6YAMAMOTOT，SATOT，ETGENEPOLYMERPHISMITHOFDIABETICINWITH1PROGRESSIONNEPHROPATHYJAPANESEPATIENTSTYPEDIABETESMELLITUSDIABETESOBESMETAB2003JAN5151577LEEA1CONTRIBUTIONSTOOFOXIDATIVESTRESSAY，CHUNGSS，ETPOLYOLPATHWAYINDIABETICCATARACT。JFASE8，1999，1323308ANDERSONAINA1DIABETICR，CHRISTIANSENS，ANDERSONJJK，ETNEPHROPATHY1TYPEDIABETESEPIDEMIOLOGIC8L50I9CRAVENFMNITRTCOXIDEINDIABETICP，DERUBERTISR，MELHEMNEPHROPATHYINT。1997，52S46一S53JKIDNEYOF10KOMERSSPARADOXESRANDERSONNITRICOXIDETHEDIABETICINKIDNEY，AMRENALJPHYSIOLJUN2846F112137PHYSI012003LISHIMASAKIHA1ASSOCIATIONOFTHEMISENSEVARIANTY，YASUEY，ETGLU298ASPIFTHEENDOTHELIALNITRICOXIDEWITHSYNTHASEGENEMYOCARDIALAMCOLLCARDIOL，199831156010INFARCTIONJJTASSOCIATIONOFNILRICTHEOXIDE12，NEUGEBAUERS，BABAT，WATANABESYNTHASEWITHANFORINCREASEDRISKTOGENEDIABETICPOLYMORPHISMPROGRESSION21參考文獻IN2TYPENEPHROPATHYAADNAFLDISCOVERY13COLLINSS，BROOKSD，CHAKRAVARTICPOLYMORPHISMFORRESEACHHUMANRESOURSERES，1998，812VARIATIONJGENOMEGENETIC1229一123114張思仲人類基因組的單核苷酸多態(tài)性及其醫(yī)學應用J中華醫(yī)學遺傳學雜志，1999，162119122OFHUMANICATIONSK，MIHM15WATTANAPITAYAKULMJ，YOUNGAPTHERAPEUTICIMPLPHARMENDOTHELIALNITRICOXIDESMTRENDSSYNTHASEGENEPOLYMORPHISCI2001236136816TESAUROPINTRACELLULAROFM，THOMPSONWC，ROGLIANIPROCESSINGENDOTHELIALNITRICOXIDEWITHDIFFERENCESINISOFORMSAS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