中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)輻照食品鑒定 篩選法2016016 前 言本標(biāo)準(zhǔn)代替237482009輻照食品的鑒定 選法、22142012輻照食品鑒定 光釋光法和011出口輻照食品的鑒別方法 第2部分:單細(xì)胞凝膠電泳法。本標(biāo)準(zhǔn)與237482009相比,主要變化如下:標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 輻照食品鑒定 篩選法”;增加了兩種篩選方法:光釋光法和微生物學(xué)篩選法;增加了0161 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)輻照食品鑒定 篩選法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了三種快速篩選食品是否接受過(guò)輻照的鑒定方法:光釋光法、標(biāo)準(zhǔn)中的光釋光法適用于甲殼類、香辛料和調(diào)味品類產(chǎn)品的輻照鑒定;物、堅(jiān)果、果蔬的輻照鑒定;微生物學(xué)篩選法適用于冷凍畜禽肉和水產(chǎn)品等各類生鮮食品的輻照鑒定。第一法 光釋光法2 釋光(含硅酸鹽類樣品俘獲的輻射能量經(jīng)一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后,以光的形式釋放出來(lái)的現(xiàn)象。品經(jīng)光激發(fā)后檢測(cè)到的發(fā)光量,以光子計(jì)數(shù)率表示。查品初次測(cè)量的正查一樣品用已知?jiǎng)┝枯椪蘸鬁y(cè)量的值(篩查模式下,用于判定樣品輻照與否的括一個(gè)低閾值(一個(gè)高閾值(性疑性0162 白對(duì)照(光刺激時(shí),對(duì)空樣品容器獲得的光子計(jì)數(shù)率。性對(duì)照(參考光源(比如裝有14于樣品容器中得到的光子計(jì)數(shù)率。3 原理富含硅酸鹽類物質(zhì)的樣品能夠儲(chǔ)存射線能量。通過(guò)一定波長(zhǎng)的光再次激發(fā)照射,樣品中儲(chǔ)存的能量可以釋放,產(chǎn)生光釋放光信號(hào)。利用光釋放光檢測(cè)儀測(cè)試光信號(hào)的強(qiáng)度,比較不同光信號(hào)強(qiáng)度的大小,判定樣品是否經(jīng)過(guò)輻照。4 釋光測(cè)量系統(tǒng):包括樣品容器、光激發(fā)源、脈沖刺激儀和同步光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)。量盤(pán):直徑5離輻射源:對(duì)電離輻射源的使用和管理按25306的規(guī)定。5 分析步驟注:樣品在測(cè)量前避光放置。測(cè)量時(shí)使用一次性測(cè)量盤(pán)。辛料和調(diào)味品的樣品制備準(zhǔn)備雙份樣品,均勻鋪在測(cè)量盤(pán)底部,分別檢測(cè)。如果兩次檢測(cè)結(jié)果與判定閾值相比不一致,則將樣品4等分后重新進(jìn)行檢測(cè),取其中最高的兩個(gè)檢測(cè)值作為結(jié)果進(jìn)行判定,依此類推。殼類動(dòng)物的樣品制備將帶殼或去殼樣品放入測(cè)量盤(pán)中,樣品中帶有動(dòng)物腸子時(shí)有利于光釋光信號(hào)的檢測(cè)。如個(gè)體較大,可對(duì)樣品切割;也可取腸子(不少于6根)放入測(cè)量盤(pán)中進(jìn)行測(cè)量。器設(shè)置設(shè)定輻照食品篩查系統(tǒng)的個(gè)體測(cè)量參數(shù)。檢查空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。注:應(yīng)當(dāng)定期或者當(dāng)測(cè)量出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果后,對(duì)容器進(jìn)行空樣品檢測(cè),檢查儀器是否受到污染。查測(cè)量進(jìn)行樣品檢測(cè)并記錄結(jié)果。正測(cè)量篩查測(cè)量后的樣品加蓋保存,防止樣品損失或污染。對(duì)這些樣品再輻照特定劑量(香辛料和貝類食物輻照1輻照后室溫(甲殼類動(dòng)物和其他易腐爛樣品應(yīng)冷藏)避光保存12h,進(jìn)行校正測(cè)量。0163 6 值設(shè)定香料和調(diào)味品的閾值設(shè)定為:002=5000殼類動(dòng)物的閾值設(shè)定為:0002=4000果判斷根據(jù)與閾值的比較,樣品測(cè)量結(jié)果可分為陰性、可疑、陽(yáng)性三種情況,分別進(jìn)行判定。查判定樣品未經(jīng)輻照。正樣品不能被判定為輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是否接受過(guò)輻照,應(yīng)采用輻照食品鑒定的其他確證方法。校正篩查明測(cè)量系統(tǒng)有錯(cuò)誤,應(yīng)當(dāng)取新鮮的原始樣品重新測(cè)量。查能直接判定樣品是否接受過(guò)輻照。正定樣品接受過(guò)輻照。校正查明樣品可能是低敏感性未輻照食品。若要進(jìn)一步確認(rèn)樣品是否接受過(guò)輻照,應(yīng)采用輻照食品鑒定的其他確證方法。校正查明測(cè)量有誤。校正查明樣品可能接受過(guò)高于校正劑量的輻照。應(yīng)當(dāng)重新測(cè)量樣品進(jìn)行判定。查判定樣品接受過(guò)輻照。正定樣品接受過(guò)輻照。校正遠(yuǎn)高于陰性或可疑結(jié)果的篩查明樣品可能未經(jīng)輻照。校正校正差1到2個(gè)數(shù)量級(jí)),表明測(cè)量有誤,需要重新進(jìn)行測(cè)量。0164 第二法 理細(xì)胞包埋在瓊脂中,用裂解試劑溶解細(xì)胞膜,然后在一定的電壓下進(jìn)行電泳。受損的成尾狀分布。染色后,受輻射的細(xì)胞圖譜接近圓形或者輕微拖尾。8 試劑除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的三級(jí)水。甲基亞砜(2化鈉(化鉀(酸氫二鈉(2酸二氫鉀(二胺四乙酸二鈉(10氧化鈉(羥甲基氨基甲烷(4酸(二烷基磺酸鈉(12啶橙(化乙錠(氯乙酸(2酸鋅(油(酸鈉(酸銨(酸銀(硅酸(i(醛(乙酸(化吡啶(脂糖。熔點(diǎn)瓊脂糖。9 試劑配制試驗(yàn)中所用的試劑配制見(jiàn)附錄A。0165 10 平電泳槽。子天平:加熱磁力攪拌器。波爐。孔濾膜:孔徑100m、200m、500m。微鏡載玻片:766磨砂邊。光顯微鏡:100倍400倍;藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)46085于吖啶橙染色觀察;綠色激發(fā)波長(zhǎng)51560于磺化吡啶或溴化乙錠染色觀察。11 髓樣品制備切開(kāi)骨頭,稱取約50入3玻璃棒攪拌,將細(xì)胞懸起,用100集濾液并將濾液置于冰盒上,備用(細(xì)胞懸液可置于冰上放置,時(shí)間不超過(guò)10加入5%10%的胞可置于存26h)。肉組織樣品制備用解剖刀將肌肉組織切成薄片(不能有可見(jiàn)脂肪)。稱取1入5該燒杯置于冰盒中,玻璃棒攪拌5次用500集濾液并在冰盒上放置5用。糧、研缽碾碎,置于小燒杯中,加入3該燒杯置于冰盒中,用玻璃棒攪拌5次用500集濾液并在冰盒上放置150用。研缽碾碎,置于小燒杯中,加入3該燒杯置于冰盒中,用玻璃棒攪拌5次用500集濾液并在冰盒上放置150用。菜(不包括食用菌)將蔬菜的可食部分用解剖刀切成薄片,取4g,加入5研缽碾碎,置于小燒杯中,加入3該小燒杯置于冰盒中,玻璃棒攪拌5次用500集濾液并在冰盒上放置150用。0166 涂載玻片涂布前,應(yīng)將載玻片用甲醇浸泡以除去表面油脂。風(fēng)干后,滴一滴(約50L)涂層瓊脂糖溶液于載玻片上,立即取另一個(gè)載玻片蓋在瓊脂糖上,使瓊脂糖溶液散開(kāi),取下上層載玻片,風(fēng)干30用。埋凝膠取100后取100即蓋上蓋玻片使凝膠鋪展均勻,注意不可產(chǎn)生氣泡。將載玻片置于冰盒上5后用解剖刀尖將蓋玻片從瓊脂糖上剝離。物細(xì)胞5物細(xì)胞15使細(xì)胞溶解,溶解過(guò)程不要碰觸瓊脂糖。濕將載玻片浸入電泳緩沖液中,時(shí)間5泳將載玻片并排放入水平電泳槽,磨砂邊緣朝向陰極。電泳槽中加入電泳緩沖液沒(méi)過(guò)載玻片2溫下電泳20壓2V/閉電源后,將載玻片放入水中5溫下風(fēng)干1h。啶橙、磺化吡啶或溴化乙錠染色將載玻片浸入染色液(吖啶橙染色液、磺化吡啶染色液或溴化乙錠染色液)3干載玻片下多余的水分,熒光顯微鏡觀察。酸銀染色將載玻片置于混合液洗1050恒溫干燥箱干燥1后將載玻片浸入混合液0復(fù)該步驟1次2次,染色時(shí)間50至載玻片呈現(xiàn)棕色。水洗1停止液水洗1后將載玻片室溫放置,自然風(fēng)干。染色后的載玻片不會(huì)褪色,可長(zhǎng)期保存觀察。注:熒光染料易淬滅,染色要迅速;染色液有毒,試驗(yàn)結(jié)束后,應(yīng)對(duì)廢液進(jìn)行凈化處理再行棄置。光觀察吖啶橙染色的載玻片應(yīng)用熒光顯微鏡(46085光激發(fā))觀察,染色化吡啶或溴化乙錠染色的載玻片應(yīng)用熒光顯微鏡(51560色激發(fā))配合590色光觀察硝酸銀染色的載玻片可使用普通顯微鏡觀察。0167 12 果表述通過(guò)顯微鏡觀察,輻照過(guò)的樣品幾乎沒(méi)有完整細(xì)胞,全部是彗星圖像(未受損的細(xì)胞不拖尾或者有輕拖尾(定結(jié)果出現(xiàn)彗星圖像時(shí),結(jié)果報(bào)告為陽(yáng)性,樣品可能經(jīng)過(guò)輻照。未出現(xiàn)彗星圖像時(shí),結(jié)果報(bào)告為陰性,樣品未經(jīng)輻照。13 限制性說(shuō)明實(shí)際上不同樣品產(chǎn)生的彗星形狀會(huì)有明顯差異,而且其他處理過(guò)程也可能影響給輻照食品的判定帶來(lái)困難。故終確定食品是否接受了輻照,需要配合其他輻照食品確證方法進(jìn)行檢測(cè)。第三法 微生物學(xué)篩選法14 術(shù)語(yǔ)和定義內(nèi)毒素(蘭氏陰性菌的菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱,是細(xì)菌細(xì)胞壁上的特有成分,其毒性成分主要為類脂質(zhì)A。只有在細(xì)菌裂解后,內(nèi)毒素才會(huì)釋放出來(lái),可引起宿主發(fā)熱和內(nèi)毒素休克等癥狀。15 原理在適宜條件下,細(xì)菌內(nèi)毒素可激活鱟試劑中的凝固酶原,使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。內(nèi)毒素與革蘭氏陰性菌含量呈正相關(guān),所以可根據(jù)內(nèi)毒素的含量測(cè)定革蘭氏陰性菌的含量。食品經(jīng)過(guò)一定劑量的輻照后,食品中的革蘭氏陰性細(xì)菌基本上被殺死,但殘留的內(nèi)毒素不會(huì)因輻照處理而消失。因此可通過(guò)內(nèi)毒素濃度測(cè)定,計(jì)算被輻照食品中死亡和存活革蘭氏陰性細(xì)菌的總數(shù),同時(shí)對(duì)食品中存活的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù),通過(guò)兩者的差異,可判斷食品是否經(jīng)過(guò)輻照。若兩個(gè)數(shù)值的差異明顯,表明樣品可能接受過(guò)輻照。16 試劑:射用無(wú)熱源生理鹽水。白胨溶液(0168 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(奶瓊脂培養(yǎng)基(晶紫溶液(霉素溶液(蘭氏陰性細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基(準(zhǔn)品內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品(50,純度99%。準(zhǔn)溶液配制內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液:取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品,加入1解為50EU/7 調(diào)溫水浴鍋。壓滅菌鍋。子天平:溫干燥箱。旋振蕩器。熱恒溫培養(yǎng)箱。質(zhì)器:8000r/0000r/8 分析步驟注:樣品應(yīng)在4保存,24不能立即檢驗(yàn),應(yīng)置于存,最長(zhǎng)保存時(shí)間不超過(guò)30d。樣無(wú)菌條件下,在樣品的不同部位取樣,共取10g。將樣品置于無(wú)菌塑料容器中,用一次性針筒加入90000r/成濃度為10保存?zhèn)溆?最長(zhǎng)保存時(shí)間不超過(guò)24h。養(yǎng)基制備制備蛋白胨溶液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏陰性菌選擇性培養(yǎng)基(見(jiàn)附錄C),傾注平板前將融化的培養(yǎng)基于451水浴保溫。據(jù)樣品污染情況,對(duì)樣品溶液(10進(jìn)一步的稀釋,用蛋白胨溶液對(duì)樣品稀釋液按照9到濃度為100溫下,正面向上靜置90個(gè)稀釋度做2個(gè)平板。個(gè)平板覆蓋10平放置,使瓊脂凝固。倒置平板于0169 211培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h1h。擇菌落數(shù)為15300的2個(gè)連續(xù)稀釋度平板計(jì)數(shù)(每克樣品中的革蘭氏陰性菌數(shù)按式(1)計(jì)算:N=cV.1) d(1)式中:N每克樣品中革蘭氏陰性細(xì)菌數(shù),單位為菌落形成單位每克(g);c長(zhǎng)有15個(gè)300個(gè)菌落的2個(gè)連續(xù)稀釋度平板的菌落之和;V每個(gè)平板接種的菌液體積,單位為毫升(第一個(gè)稀釋度的計(jì)數(shù)平板數(shù);第二個(gè)稀釋度的計(jì)數(shù)平板數(shù);d計(jì)數(shù)有效平板的第一個(gè)稀釋度。若只有一個(gè)稀釋度的平板長(zhǎng)有15個(gè)300個(gè)菌落時(shí),則若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15時(shí),則以菌落數(shù)最多的平板的菌落數(shù)作為若所有稀釋度的平板菌落均未長(zhǎng)菌時(shí),結(jié)果表示為未檢測(cè)到革蘭氏陰性菌,試劑溶解與分裝按試劑標(biāo)示量,加入無(wú)熱源生理鹽水溶解,混勻,品稀釋使用96孔板稀釋樣品。每一個(gè)樣品稀釋孔中加入650300合均勻,到10將300續(xù)稀釋,直到最后一個(gè)稀釋倍數(shù)的樣品內(nèi)毒素檢測(cè)為陰性(最終的稀釋倍數(shù)視樣品情況而定。試劑檢測(cè)反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行。以內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)熱源生理鹽水作為陰性對(duì)照。勻。蓋上96孔板蓋子,置于37浴中反應(yīng)1h。果計(jì)數(shù)當(dāng)試劑發(fā)生完全凝集時(shí)記為“+”,部分凝集時(shí)記為“+/-”,未凝集時(shí)記為“-”。毒素定量根據(jù)不同稀釋倍數(shù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)情況確定檢測(cè)鱟試劑的靈敏度。以發(fā)生凝固的最后一01610 個(gè)樣品稀釋溶液的滴度用于計(jì)算,如果完全凝固時(shí),以實(shí)際滴度用于計(jì)算(如果為部分凝固“+/-”時(shí),每克樣品中內(nèi)毒素含量按式(2)計(jì)算:c10t1010T(2)式中:每克樣品中內(nèi)毒素含量,單位為內(nèi)毒素單位每克(EU/g);c標(biāo)準(zhǔn)品中內(nèi)毒素含量,單位為內(nèi)毒素單位每毫升(EU/t樣品的滴度值;T標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)。19 算 時(shí),表示樣品經(jīng)檢測(cè)含有較高的內(nèi)毒素含量,但經(jīng)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較少或者未檢測(cè)出有可培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌。 ,表示樣品經(jīng)檢測(cè)含有較高的內(nèi)毒素含量,且培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌數(shù)目較多。 定該樣品可能