書書書中華人民共和國國家標準犌犅食品安全國家標準體外哺乳類細胞染色體畸變試驗（報批稿）發(fā)布實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布書書書食品安全國家標準體外哺乳類細胞染色體畸變試驗范圍本標準規(guī)定了體外哺乳類細胞染色體畸變試驗的基本試驗方法和技術要求。本標準適用于評價受試物的體外哺乳類細胞染色體畸變。術語和定義染色體結構畸變通過顯微鏡可以直接觀察到的發(fā)生在細胞有絲分裂中期的染色體結構變化。如染色體中間缺失和斷片、染色體互換等。染色體結構畸變可分為染色體型畸變（）和染色單體型畸變（）。染色體型畸變染色體結構損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體的相同位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組等改變。染色單體型畸變染色體結構損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組等改變。有絲分裂指數(shù)中期相細胞數(shù)與所觀察的細胞總數(shù)之比值；是反映細胞增殖程度的指標。核內復制在復制的期之后，細胞核未進行有絲分裂就開始了另一個期的過程。其結果是染色體有、倍的染色單體。裂隙染色體或染色單體損傷的長度小于一個染色單體的寬度，為染色單體的最小錯誤排列。試驗目的和原理通過檢測受試物是否誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳類細胞染色體畸變，評價受試物致突變的可能性。在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳類細胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細胞停止在中期分裂相，隨后收獲細胞、制片、染色、分析染色體畸變。儀器和試劑儀器細胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺，離心機。犌犅培養(yǎng)液常用培養(yǎng)液（，），也可選用其他合適培養(yǎng)液。加入抗菌素（青霉素按、鏈霉素），將滅活的胎牛血清或小牛血清按的比例加入培養(yǎng)液。代謝活化系統(tǒng)犛輔助因子的配制鎂鉀溶液氯化鎂和氯化鉀加蒸餾水溶解至。犿狅犾犔磷酸鹽緩沖液（狆犎）磷酸氫二鈉（，），磷酸二氫鈉（，），調至，滅菌或濾菌。輔酶（氧化型）溶液無菌條件下稱取輔酶，用無菌蒸餾水溶解配制成溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖磷酸鈉鹽溶液稱取葡萄糖磷酸鈉鹽，用蒸餾水溶解配制成，過濾滅菌?，F(xiàn)用現(xiàn)配。大鼠肝犛組分的誘導和配制選健康雄性成年或大鼠，體重，約周齡周齡。將多氯聯(lián)苯（）溶于玉米油中，濃度為，按體重無菌操作一次腹腔注射，后處死動物，處死前禁食。也可采用苯巴比妥鈉和萘黃酮聯(lián)合誘導的方法進行制備，經口灌胃給予大鼠苯巴比妥鈉和萘黃酮，劑量均為體重，連續(xù)，禁食后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導。處死動物后取出肝臟，稱重后用新鮮冰冷的氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝（濕重）加氯化鉀溶液，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，在玻璃勻漿器（低于，）或組織勻漿器（低于，）中制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環(huán)境。將制成的肝勻漿在低溫（）高速離心機上以犵離心，吸出上清液為組分，分裝于無菌冷凍管中，每管左右，最好用液氮或干冰速凍后置低溫保存。組分制成后，經無菌檢查，測定蛋白含量（法），每毫升蛋白含量不超過為宜，并經間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于低溫或冰凍干燥，保存期不超過年。犛混合液的制備一般由組分和輔助因子按組成的混合液，無菌現(xiàn)用現(xiàn)配?；旌弦号渲迫缦拢喝∩鲜隽姿猁}緩沖液、鎂鉀溶液、葡萄糖磷酸鈉鹽溶液、輔酶溶液、肝組分，混勻，置冰浴中待用。混合液濃度一般為，實際使用濃度可由各實驗室自行決定，但需對其活性進行鑒定，犌犅必須能明顯活化陽性對照物，且對細胞無明顯毒性。秋水仙素溶液用溶液配制適當濃度的儲備液，過濾除菌，在避光冷藏的條件下至少能保存?zhèn)€月。犿狅犾犔氯化鉀溶液氯化鉀加蒸餾水至。固定液甲醇冰醋酸為，臨用前配制。根據試驗條件，可適當調整冰醋酸的濃度，改善染色體分散度，但不宜過大，導致細胞破裂。姬姆薩（犌犻犲犿狊犪）染液取姬姆薩染料，置乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至，待完全溶解后，再加甘油，放入溫箱中保溫。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時，取份姬姆薩染液原液，與份磷酸鹽緩沖液（）混合，配成其應用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液（，）配制方法如下：）第一液：取磷酸氫二鈉（）溶于去離子水中，配成溶液；）第二液：取磷酸二氫鉀（）溶于去離子水中，配成溶液；）取第一液加于第二液中混勻，即為的磷酸鹽緩沖液。試驗方法受試物固體受試物應溶解或懸浮于適合的溶媒中，并稀釋至適當濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當濃度。受試物應無菌現(xiàn)用現(xiàn)配，否則須確認儲存不影響其穩(wěn)定性。細胞株可選用中國倉鼠肺（）細胞株或卵巢（）細胞株、人或其他哺乳動物外周血淋巴細胞（）。試驗前檢查細胞的核型和染色體數(shù)目，檢測細胞有無支原體污染。推薦使用中國倉鼠肺（）細胞株。劑量劑量設置受試物至少應取個檢測劑量。對有細胞毒性的受試物，其劑量范圍應包括從最大毒性至幾乎無毒性（細胞存活率在的范圍內）；通常濃度間隔系數(shù)不大于槡。最高劑量的選擇當收獲細胞時，最高劑量應能明顯減少細胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)（大于，如毒性過大，應適當增加接種細胞數(shù)）；同時應該考慮受試物對溶解度、和摩爾滲透壓濃度的影響；對無細胞毒性或細胞毒性很小的化合物，最高劑量應達到、或。犌犅對溶解度較低的物質，當達到最大溶解濃度時仍無毒性，則最高劑量應是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。細胞毒性的確定測定細胞毒性可使用指示細胞完整性和生長情況的指標，如相對集落形成率或相對細胞生長率等。應在系統(tǒng)存在或不存在的條件下測定細胞毒性。陽性對照可根據受試物的性質和結構選擇適宜的陽性對照物，應是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復的陽性結果。當不存在外源性代謝活化系統(tǒng)時，可使用的陽性對照物有甲磺酸甲酯（，）、甲磺酸乙酯（，）、絲裂霉素（）、乙基亞硝基脲（，）、硝基喹啉犖氧化物（犖）等。當存在外源性活化系統(tǒng)時，可使的陽性對照物有苯并犪芘（犪），、環(huán)磷酰胺（）等。不加的陽性對照常用絲裂霉素，其常用濃度為。其為的水溶液在下避光保存能存放周。加的陽性對照常用環(huán)磷酰胺，其常用濃度為。其水溶液不穩(wěn)定，應現(xiàn)配現(xiàn)用。陰性對照溶媒應為非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應，不影響細胞存活和活性。首選溶媒對照是不含血清的培養(yǎng)液和水，亦可使用二甲基亞砜（），但濃度不應大于?？瞻讓φ杖绻麤]有文獻資料或歷史資料證實所用溶媒無致突變作用時應設空白對照。試驗步驟細胞培養(yǎng)與染毒試驗需在加入和不加入（的終濃度常為，以細胞毒性試驗結果為準）的條件下進行。試驗前一天，將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中以收獲細胞時，培養(yǎng)皿（瓶）的細胞未長滿為標準，一般以長到左右為佳；如用細胞，可接種個，放培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。試驗時吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、混合液（不加混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中處理。處理結束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用溶液洗細胞次，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于收獲細胞。于收獲前，加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，終濃度為）。當受試物為單一化學物質時，如果在上述加入和不加入混合液的條件下均獲得陰性結果，則需加做長時間處理的試驗，即在沒有混合液的條件下，使受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間延長至。當難以得出明確結論時，應更換試驗條件，如改變代謝活化條件、受試物與試驗系統(tǒng)接觸時間等重復試驗。收獲細胞與制片消化用胰蛋白酶溶液消化細胞，待細胞脫落后，加入含胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋犌犅白酶的作用，混勻，放入離心管以的速度離心，棄去上清液。低滲加入氯化鉀溶液，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入細胞培養(yǎng)箱中低滲處理。固定加入固定液，混勻后固定以上，以速度離心，棄去上清液。重復一次，棄去上清液。滴片加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。染色姬姆薩染液，。閱片在油鏡下閱片，每一劑量組應分析不少于個分散良好的中期分裂相，且每個觀察細胞的染色體數(shù)在狀范圍之內。對于畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。觀察指標染色體數(shù)目的改變非整倍體：亞二倍體或超二倍體。多倍體：染色體成倍增加。核內復制：核膜內的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。染色體結構的改變斷裂：損傷長度大于染色體的寬度。微小體：較斷片小而呈圓形。有著絲點環(huán)：帶有著絲點部分，兩端形成環(huán)狀結構并伴有一雙無著絲點斷片。無著絲點環(huán)：成環(huán)狀結構。單體互換：形成三輻體、四輻體或多種形狀的圖像。雙微小體：成對的染色質小體。裂隙：損傷的長度小于染色單體的寬度。非特定性型變化：如粉碎化、著絲點細長化、黏著等。數(shù)據處理和結果評價數(shù)據處理數(shù)據按不同劑量列表，指標包括觀察細胞數(shù)、畸變細胞數(shù)、染色體畸變率、各劑量組及對照組不同類型染色體畸變數(shù)與畸變率等。裂隙應單獨記錄和報告，但一般不計入總的畸變率。各組的染色體畸變率用檢驗進行統(tǒng)計學處理。犌犅結果評價下列兩種情況可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中為陽性結果：）受試物引起染色體結構畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學意義，并與劑量相關；）受試物在任何一個劑量條件下，引起的染色體結構畸變數(shù)增加具有統(tǒng)計學意義，并有可重復性。試驗報告試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號。試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗開始和結束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術負責人、簽發(fā)日期。試驗摘要。受試物：名稱、鑒定資料、號（如已知）、純度、與本試驗有關的受試物的物理和化學性質及穩(wěn)定性等。溶媒：溶媒的選擇依據為受試物在溶媒中的溶劑性和穩(wěn)定性。細胞株：細胞株的來源、名稱。試驗條件：劑量、代謝活化系統(tǒng)、標準誘變劑、操作步驟等。代謝活化系統(tǒng)：制備所用酶的誘導劑、選用的動物品種和來源、混合液的配方。對照物：陽性對照物的名稱、生產廠家、批號和選用濃度。培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液的名稱、血清類別和使用濃度。接種的細胞密度以及所用培養(yǎng)皿（瓶）的規(guī)格。中期分裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作用時間。處理時間：受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間。制片方法、分析的中期分裂相數(shù)目、結果評價方法。試驗結果。試驗結果應包括細胞毒性的測定、加受試物后的溶解情況及對和滲透壓的影響（如果有影響）。各劑量組和對照組細胞染色體畸變率。本實驗室的陽性對照組和陰性對照組（常用溶媒，如）在本實驗室歷史上的染色體畸變率范圍和檢