1、.植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本步驟一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制 將大量元素配制成10倍的母液，使用時(shí)再稀釋10倍。按照配方表中用量依次分別稱取擴(kuò)大10倍的：NH4NO3 8.250g 、KNO3 9.500g 、KH2PO4 0.850g 、 MgSO47H2O 1.850g 、CaCl22H2O 2.20g，所有藥品稱取完畢后用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS微量元素母液的配制 將微量元素配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別依次

2、稱?。篗nSO4 4H2O 1.1150g 、ZnSO47H2O 0.4300g 、 H3BO3 0.3100g 、KI 0.0415g 、CuSO45H2O 0.00125g、 CoCl26H2O 0.00125g，用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS鐵鹽母液配制 將鐵鹽配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：稱 FeSO47H2O 1.390g和Na2EDTA 1.865g，把FeSO47H2O和 Na2EDTA

3、2H2O分別置于200ml蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解（磁力攪拌器，邊加熱，邊攪拌）。保持加熱，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不斷攪拌，接近沸騰時(shí)停止加熱，待溶液冷卻后加蒸餾水到最終容積500ml，置于棕色細(xì)口瓶中，用力振蕩12min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名。在室溫下避光保存一段時(shí)間令其充分反應(yīng)后，再置于4冰箱中保存?zhèn)溆谩?、MS有機(jī)化合物母液的配制 將有機(jī)化合物配制成100倍的母液，使用時(shí)再稀釋100倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大100倍的：肌醇 5.000g 、維生素B1 0.025g 、煙酸 0.025g 、甘氨酸 0.100g 、維

4、生素B6 0.005g 、蔗糖 15.000g ，用蒸餾水依次溶解并定容至500ml后，轉(zhuǎn)入500ml細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存?zhèn)溆?。二、植物激素的配置常見激素：二氯苯氧乙酸?，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）、激動(dòng)素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6芐氨基嘌呤（6BA）、赤霉素（GA3）、1、生長(zhǎng)素類： （1）、生長(zhǎng)素類在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織（2）、常見生長(zhǎng)素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被

5、廣泛用于生根，2，4D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時(shí)間不要太久。 （3）、溶解方法：稱25mg吲哚乙酸（IAA），用少量1mol/L NaOH或95酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容至25ml，搖勻。 （4）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存2、細(xì)胞分裂素 組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長(zhǎng)素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官形成。 （1）、常用的細(xì)胞分裂素有： 6芐氨基嘌呤（6BA）、激動(dòng)素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ ） （2）、溶解方法：稱2

6、5mg 6芐氨基嘌呤（6BA），用少量（1ml）1mol/L HCL預(yù)溶解，再加蒸餾水定容25ml，搖勻。（3）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素（GA3） （1）、溶解方法：用少量95酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容。 （2）、保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存 （3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解 （4）、滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌4、脫落酸 （1）、溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 （2）、保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存三、培養(yǎng)基的制備與滅菌（一）、培養(yǎng)基的制備1、將所需的各種母液和植物激素按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿

7、等放在指定位置。2、取燒杯一個(gè)內(nèi)盛200ml蒸餾水，按照培養(yǎng)基配方所需量依次取母液加入燒杯，攪拌，按相應(yīng)培養(yǎng)基稱量蔗糖和瓊脂，并添加到燒杯中，在電爐上加熱待瓊脂完全融化后加蒸餾水定容至所需體積。3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為5.6-5.8（可將其調(diào)為6.0），趁熱把培養(yǎng)基分裝到廣口瓶中，封好瓶口，待滅菌。（二）、培養(yǎng)基的滅菌滅菌溫度及滅菌時(shí)間：121（1.06kg/cm2）下滅菌20分鐘。（如是實(shí)驗(yàn)所用菌材滅菌，如無(wú)菌水及器械，則是121（1.06kg/cm2）下滅菌30分鐘），此時(shí)可將需要滅菌的實(shí)驗(yàn)儀器一起滅菌。1、檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過

8、少時(shí)應(yīng)加水。把分裝好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。2、蓋上鍋蓋，注意按照說(shuō)明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫度和時(shí)間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。3、滅菌時(shí)間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。4、在培養(yǎng)基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口，放置在水平桌面上自然冷卻。四、無(wú)菌操作技術(shù)和接種1、接種前，用75%酒精棉球擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面，將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺(tái)臺(tái)面，打開超凈工作臺(tái)紫外燈及接種房間紫外燈，照射約30min，然后關(guān)閉紫外燈。打開房間換氣扇及微開超凈工作臺(tái)的玻璃擋板，通風(fēng)20min后，即可進(jìn)行無(wú)菌操

9、作。（此步由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé)）2、接種室滅菌過程中同時(shí)對(duì)外植體進(jìn)行表面滅菌。先將接種材料在流動(dòng)的自來(lái)水下涮洗干凈，吸干水份后切成大約70mm長(zhǎng)的片段放進(jìn)500ml燒杯中，用蒸餾水沖洗2次，倒掉蒸餾水后倒入0.1%的升汞水消毒，將材料淹沒浸泡約10分鐘（期間用鑷子攪拌幾次）。3、把在消毒液中的接種材料轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上。用無(wú)菌鑷子將已完成滅菌的接種材料轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無(wú)菌水清洗3次，每次不少于1分鐘，洗時(shí)不斷搖動(dòng)燒杯以確保完全除去消毒液。最后一次清洗后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌托碟上，將接種材料切成一定大小（花托0.5cm2、莖段0.5-1cm）。4、取下培養(yǎng)瓶的蓋子用火燒灼瓶口。用鑷子將外植體輕輕插入到瓊脂上，立即蓋上蓋子。5、操作完后將鑷子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是將浸于酒精中的器械取出后置于酒精燈火焰上充分灼燒，待冷卻后方可使用。6、將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱里，在要求溫度下培養(yǎng)，觀察記錄五、所需實(shí)驗(yàn)儀器及額外藥品電子分析天平、PH測(cè)試儀器、電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、移