1、論 RECK在宮頸癌中的表達(dá)及意義摘要：目的 檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑RECK在宮頸癌組織中的表達(dá)，探討其對(duì)血管生成的影響。方法實(shí)驗(yàn)組 ( 宮頸癌組織 )26 例以及對(duì)照組 ( 正常宮頸上皮、慢性宮頸炎組織 )24 例，應(yīng)用免疫組化法，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及灰度測(cè)量檢測(cè) RECK的表達(dá)，計(jì)數(shù)微血管密度 (MVD)的值。比較二者的差異性。 結(jié)果 RECK的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組的灰度值 (7 ±1 ) 明顯低于對(duì)照組 (657±30 )(P)。 MVD值在實(shí)驗(yàn)組 ( 5 ± 8) 明顯高于對(duì)照組 ( 0± 9)(P關(guān)鍵詞： RECK; 基質(zhì)金屬蛋白酶 ; 宮頸癌 ; 微血管密

2、度惡性腫瘤侵襲正常組織及轉(zhuǎn)移必須突破細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)尤其是基底膜屏障。而基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)在 ECM及基底膜的降解過(guò)程中起到主導(dǎo)作用，能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。 MMP抑制劑作為腫瘤治療的新藥物早已引起人們的重視。 RECK(reversioninducingcysteinerich proteinwith kazal motifs) 基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型MMP抑制劑，其轉(zhuǎn)錄后水平抑制MMP特別是、以及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)與活性，主要抑制腫瘤的血管生成以及侵襲轉(zhuǎn)移1。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等組織的體外實(shí)驗(yàn)研究表明：在惡性腫瘤組織中，RECK的表達(dá)顯著

3、降低，并與腫瘤及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān) ; 但對(duì) RECK與腫瘤的分期及分化程度關(guān)系意見不一致 2，3。本實(shí)驗(yàn)主要探討 RECK在宮頸癌中的表達(dá)情況，及與宮頸癌發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及對(duì)血管生成的作用，為宮頸癌的基因靶向治療建立一個(gè)新的起點(diǎn)。1 資料與方法標(biāo)本來(lái)源 選擇 20XX年 3 月 20XX年 3 月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院、吉林大學(xué)第一院、長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院、省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的 50 例患者的宮頸組織。分為試驗(yàn)組及對(duì)照組。試驗(yàn)組 26 例：經(jīng)病理組織證實(shí)為宮頸癌，術(shù)前患者均未行放療、化療和免疫治療，年齡 33 72 歲，平均年齡 (48 ±) 歲。其中期 19 例，a期 4 例，b期

4、2 例，a期經(jīng) 2 個(gè)療程化療后 1 例 ; 高分化 9 例，中分化 13 例，低分化 4 例 ; 鱗癌 21 例，腺癌 4 例，腺鱗癌 1 例 ; 盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 2例 ; 脈管轉(zhuǎn)移 2 例。對(duì)照組 24 例，包括癌旁組織 16 例、慢性宮頸炎 8 例。兩組在年齡上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。試劑 鼠抗人 RECK蛋白多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 生物制品公司，鼠抗人因子單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司， 其他試劑采用進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。方法?biāo)本采集廣泛性子宮切除或全子宮切除標(biāo)本，立即用4預(yù)冷雙刃刀片從宮頸組織上切取1 cm3 大小組織，投入 10%甲醛溶液中， 4保存，供制備光鏡標(biāo)本

5、用。組織經(jīng)固定、脫水、包埋、5 m連續(xù)切片。實(shí)驗(yàn)方法將切片進(jìn)行 HE染色和免疫組化。用做灰度分析 (IOD) ，半定量計(jì)量 RECK陽(yáng)性率及 IOD 值，計(jì)數(shù) MVD值。結(jié)果判定RECK細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)： 400 倍鏡下觀察，在腫瘤細(xì)胞膜和 /或細(xì)胞質(zhì)有黃棕色或玫瑰紅色顆粒沉著為RECK陽(yáng)性染色。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：基本不著色為0 分，淡為 1 分，適中為 2 分，深為 3 分;著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率 5%為 0分，6%25%為 1 分，26% 50%為 2 分，51%為 3 分。將平均著色程度得分與平均著色細(xì)胞百分率得分相乘為其最后得分：1分為陰性 (-) ，23 分為

6、(+) ， 4 6 分為，>6 分為。 MVD計(jì)數(shù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇或血管腔內(nèi)徑小于8個(gè)紅細(xì)胞直徑且管壁無(wú)肌層者代表 1條單獨(dú)的微血管。先在低倍 ( ×100) 視野下找到腫瘤組織內(nèi)微血管密度最高的區(qū)域 ( 熱點(diǎn) ) ，然后在高倍 ( ×400) 視野下計(jì)數(shù) 5 個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， RECK檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)以 (- 表示，灰度分析以 IOD 均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示， MVD結(jié)果以均值及標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間進(jìn)行獨(dú)立樣本 2 檢驗(yàn)、 t 檢驗(yàn)及雙變量相關(guān)性分析。2 結(jié) 果宮頸癌組織及對(duì)照組中 RECK的

7、表達(dá) RECK在胞漿和胞膜處表達(dá)明顯，宮頸間質(zhì)中有適度表達(dá)，呈廣泛性彌漫 ( 見圖 1) 。RECK在宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)11 例(%)，而在對(duì)照組中呈高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá) 22 例(%)，組間比較有顯著性差異 (P= 2) 。 26 例宮頸癌組織 IOD 為 7 ±1 ， 24 例對(duì)照組為 657 ±30 ，經(jīng) t 檢驗(yàn)，宮頸癌組 IOD 值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t = 5， P=)( 見表 1) 。兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果一致。宮頸癌組織中 RECK表達(dá)與肌層浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系RECK在宮頸癌中表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)經(jīng)組間 2 檢驗(yàn)，(P) 。深肌層間

8、質(zhì)浸潤(rùn)、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其RECK陽(yáng)性表達(dá)率分別顯著低于淺肌層浸潤(rùn)、無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P= 4;P= 7)。不同病理參數(shù)下RECK表達(dá)見表2。表1兩組RECK的表達(dá)表 2 RECK的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系宮頸癌 MVD的表達(dá)情況及與 RECK的相關(guān)性分析 鏡下觀察血管染色結(jié)果，在宮頸癌組織中，微血管排列紊亂，著色不均一，大小不等，形狀不規(guī)則，血管壁厚度不均 ( 見圖 2) ，而對(duì)照組中血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較清晰，形狀規(guī)則，呈圓形或橢圓形，管壁厚度均勻。宮頸癌組中 MVD明顯高于對(duì)照組 (P= 0) 。經(jīng)線性回歸分析，26 例宮頸癌組織 RECK表達(dá)與 MVD值呈負(fù)相關(guān) (r=-,P=

9、 5)( 見表 3) 。表 3 宮頸癌和對(duì)照組中 MVD的表達(dá)及與 REOK的相關(guān)性分析3 討 論RECK基因是由日本學(xué)者ChiakiTakahashi 等人在轉(zhuǎn)染了基因的 NIH3T3細(xì)胞系表達(dá)的 cDNA中分離出來(lái)的轉(zhuǎn)錄抑制基因。 在正常組織或無(wú)腫瘤細(xì)胞系中廣泛表達(dá)， 而在癌基因轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。RECK在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MMP(特別是、的分泌與活性，還可以抑制和從細(xì)胞內(nèi)的釋放，從而抑制腫瘤的血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移4。RECK在正常組織中高表達(dá)，而在各種腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染了Ras等癌基因的細(xì)胞中不表達(dá)。本研究表明， RECK表達(dá)呈彌散狀，呈棕黃色或棕褐色顆粒樣物質(zhì)

10、，主要分布在胞膜和 / 或胞漿中，部分標(biāo)本可見間質(zhì)內(nèi)表達(dá)。 在對(duì)照組中，RECK呈高表達(dá)，而在宮頸癌組織中RECK的陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低(p=)。這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相符。癌基因可以抑制RECK的表達(dá)，說(shuō)明RECK可能是癌基因作用的靶位點(diǎn) 5。Cho 2利用 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑氮胞苷作用于被甲基化的RECK，恢復(fù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)， 結(jié)果 RECK表達(dá)上調(diào)。 說(shuō)明癌組織中 RECK被甲基化從而表達(dá)降低。Rabien 等指出RECK在前列腺癌中的表達(dá)明顯低于前列腺增生組織6。Song 等 3證實(shí)胃癌組織中 RECK的表達(dá)與腫瘤的鏡下生長(zhǎng)(P=) 、淋巴浸潤(rùn) (P=) 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P=) 相關(guān)，隨腫瘤侵襲

11、能力增強(qiáng)而表達(dá)下降。本研究發(fā)現(xiàn)，RECK基因的表達(dá)與宮頸癌FIGO臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)分型、患者年齡無(wú)關(guān)，與癌組織肌層間質(zhì)浸潤(rùn)深度、 盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。浸潤(rùn)深度累及深肌層或更深、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組，RECK表達(dá)明顯下降 (P=這 4,P= 7) 。Oh等 4用攜帶 RECK基因的載體轉(zhuǎn)染HT 1080 人纖維肉瘤細(xì)胞并將其接種到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤中血管密度降低，血管出芽受到抑制，血管腔增大?；蚯贸芯堪l(fā)現(xiàn)， RECK基因的適量表達(dá)可以抑制血管的生成。研究表明，RECK作用的過(guò)程在于血管的成熟過(guò)程，而不是血管生成過(guò)程。有研究表明，和通過(guò)增強(qiáng)RECK表達(dá)介導(dǎo)的時(shí)間依賴機(jī)制抑制基質(zhì)微血

12、管上皮細(xì)胞 (hMVEC)的遷移。加強(qiáng)了Crk和 C3G之間的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致Rap1基因活性增加，與Rap1表達(dá)不活躍的細(xì)胞株相比，hMVEC穩(wěn)定表達(dá)。說(shuō)明、Rap1基因能上調(diào)RECK的表達(dá)，使血管遷移減少7。本研究表明，RECK表達(dá)陽(yáng)性組織中微血管結(jié)構(gòu)清晰， 管腔增大且形狀規(guī)則，呈橢圓或圓形， 著色較深。 而宮頸癌組織的微血管管壁菲薄且著色不均， 管腔狹小且形狀不規(guī)則 ; 宮頸癌組織中 MVD值明顯高于對(duì)照組，相關(guān)性分析表明 MVD值與 RECK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)說(shuō)明 RECK的表達(dá)可以抑制腫瘤血管的生成， 與國(guó)外報(bào)道相似。總之，本研究表明宮頸癌組織中 RECK的表達(dá)水平顯著降低， RECK低表達(dá)

13、的腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移能力， 其表達(dá)與宮頸癌 MVD有密切關(guān)系，故二者可望成為早期診斷宮頸癌及判斷預(yù)后新的指標(biāo)。對(duì) RECK基因的深入研究不但有利于更進(jìn)一步了解腫瘤的生物學(xué)行為， 還可以為研究抗腫瘤藥物提供新的思路。【參考文獻(xiàn)】1 Toshimichi A，Mitsuhiro Tmetalloproteinasefamilyexpression， Cheng SQ,et values of matrixin humancolorectalcarcinoma J.Surg Res ，20XX;146(1) ：2 Cho CY，Wang JH，Chang HC,et inactivatio

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