1、人類細(xì)胞表面IgSF相互作用組揭示蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)讀細(xì)胞表面蛋白的相互作用（PPIs）對(duì)于介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊、識(shí)別和應(yīng)答具有重要作用。本研究開發(fā)了一套高通量基于ELISA的細(xì)胞外相互作用組分析平臺(tái)并整合自動(dòng)池化蛋白策略，對(duì)564種人細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白（大部分為免疫球蛋白超家族（IgSF）蛋白）進(jìn)行相互作用組分析，檢測(cè)了所有318,096個(gè)PPI組合。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化同源性分析，發(fā)現(xiàn)約380個(gè)以前未報(bào)告的PPIs，并利用表面等離振子共振和細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中一個(gè)子集。PPIs揭示了生物系統(tǒng)內(nèi)部和生物系統(tǒng)之間相互作用的復(fù)雜龐大的網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)確定了與受體以及“孤兒”受體結(jié)合的新型

2、PPIs。這些PPIs包括在多種細(xì)胞類型上表達(dá)的蛋白質(zhì)，并參與多種過(guò)程（如免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能、分化/增殖、代謝、血管生成和增殖），有助于進(jìn)一步的功能相關(guān)性研究和藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下結(jié)果1    用于 PPI篩選的蛋白質(zhì)的選擇和生產(chǎn)為鑒定人類IgSF蛋白，研究者利用HUGO基因命名委員會(huì)（HGNC）、人蛋白質(zhì)圖譜和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)“誘餌”和“獵物”多聚結(jié)構(gòu)域?qū)⒏信d趣的458個(gè)IgSF和106個(gè)非IgSF蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域（ECDs）和分泌蛋白聚集到細(xì)胞上清中（圖1A和1B），并通過(guò)Western blot驗(yàn)證其表達(dá)。本研究及其它團(tuán)隊(duì)

3、都已證明基于ELISA的細(xì)胞外相互作用組測(cè)定（ECIA）和其他基于ELISA的結(jié)合實(shí)驗(yàn)均能在蛋白量表達(dá)很低的情況下檢測(cè)到PPIs。因此認(rèn)為無(wú)論是否檢測(cè)到蛋白質(zhì)，所有誘餌和獵物都包括在篩選中。 2   自動(dòng)匯集獵物ECIA平臺(tái)的開發(fā) ECIA和其他基于ELISA的檢測(cè)方法允許直接從培養(yǎng)基中檢測(cè)誘餌和獵物蛋白的結(jié)合（圖1B），對(duì)每孔的獵物-誘餌對(duì)進(jìn)行分析。為增加通量，研究者池化三組獵物，并在篩選后對(duì)陽(yáng)性孔去卷積化以鑒定PPIs（圖1B）。用一組已知的PPIs進(jìn)行池化實(shí)驗(yàn)顯示，獵物經(jīng)過(guò)3倍稀釋后也能與PPIs結(jié)合（圖1C）。由于對(duì)誘餌-獵物進(jìn)行雙向測(cè)試，相反方

4、向的陽(yáng)性結(jié)果可以“彌補(bǔ)”池化蛋白策略所導(dǎo)致的假陰性。因此認(rèn)為，池化的優(yōu)勢(shì)（減少結(jié)合反應(yīng)的數(shù)量）遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了假陰性的潛在增長(zhǎng)。為了進(jìn)一步提高通量，研究者優(yōu)化384孔的格式，并利用液體處理機(jī)器人開發(fā)了自動(dòng)化工作流程。apECIA平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)每周測(cè)試55,296對(duì)誘餌-獵物組合。PPI篩選揭示了復(fù)雜的PPIs網(wǎng)絡(luò)。篩選后，對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行去卷積化（圖1B），并排除非特異性PPIs后，發(fā)現(xiàn)495個(gè)陽(yáng)性孔中包含了426個(gè)獨(dú)特PPIs。在每種情況下，三個(gè)去卷積的獵物中只有一個(gè)能夠產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。為了證實(shí)其相互結(jié)合，將陽(yáng)性獵物針對(duì)其同源誘餌一分為三再次測(cè)試。約81%的PPIs（345/426）在IgSF蛋白之間，其余

5、19的PPIs存在于 IgSF與篩選體系中的其他蛋白質(zhì)之間。檢測(cè)的蛋白質(zhì)中有一半與PPIs有關(guān)（254 / 564，45），不參與PPIs的蛋白質(zhì)可能會(huì)被錯(cuò)誤折疊。研究者同時(shí)證實(shí)了此平臺(tái)的靈敏度，許多以極低水平表達(dá)的誘餌或獵物蛋白仍與一種或兩種PPIs結(jié)合，但對(duì)于表達(dá)量極低的獵物蛋白，可能存在假陰性的結(jié)果。在426個(gè)PPIs中，有345個(gè)（81）以前未報(bào)道過(guò)。大多數(shù)PPIs（408/426）形成一個(gè)包含226種蛋白質(zhì)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)（圖1D）。只有涉及18個(gè)PPIs的28種蛋白質(zhì)未連接到此網(wǎng)絡(luò)（網(wǎng)絡(luò)的不同區(qū)域如圖2所示）。98個(gè)蛋白質(zhì)（39）具有1個(gè)PPI，113個(gè)蛋白質(zhì)（44）具有2至5個(gè)PPIs

6、，43個(gè)蛋白質(zhì)（17）具有5個(gè)以上 PPIs（圖1E）。由于45的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出結(jié)合力，因此研究者計(jì)算了每種蛋白質(zhì)結(jié)合x-16個(gè)PPIs的預(yù)期頻率，并比較預(yù)期頻率和實(shí)際觀察到的頻率（圖1F）。實(shí)際觀察到的結(jié)合伴侶數(shù)量顯著大于隨機(jī)預(yù)測(cè)而得的PPIs數(shù)量。 圖1. apECIA篩選概述。A篩選庫(kù)中蛋白質(zhì)子集的示意圖；B篩選流程圖（左），ECIA原理圖和蛋白池化策略（右）；C.未稀釋獵物（單個(gè)獵物）與3倍稀釋獵物（合并獵物）的ECIA;D.在篩選中觀察到的PPIs網(wǎng)絡(luò)，Siglec子家族節(jié)點(diǎn)以彩色突出顯示；E.結(jié)合受體數(shù)目分布的餅圖，與節(jié)點(diǎn)環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)圖疊加；F.實(shí)際觀察到的與PHA預(yù)期頻率的關(guān)

7、系。 3   系統(tǒng)發(fā)育同源性分析（PHA）預(yù)測(cè)PPIs PPIs經(jīng)常發(fā)生在亞家族內(nèi)部和亞家族之間的系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白之間。研究者進(jìn)行多個(gè)序列比對(duì)以鑒定亞家族成員并形成了系統(tǒng)發(fā)育樹。利用apECIA-PHA的組合方法沿著系統(tǒng)發(fā)育樹分析所篩選的數(shù)據(jù)，以預(yù)測(cè)在篩選中可能遺漏的亞家族成員間的PPIs。研究者選擇篩選和PHA預(yù)測(cè)的一個(gè)PPIs子集進(jìn)行SPR驗(yàn)證。理想的PPIs可通過(guò)SPR高度敏感地觀察到明顯的結(jié)合和解離。PPIs的特征性結(jié)合譜表現(xiàn)出高于背景的清晰共振信號(hào)（陰性對(duì)照配體和受體）和濃度依賴性結(jié)合曲線，被認(rèn)為是特異性配體-分析物PPI的標(biāo)志。非特異性PPI

8、s通常表現(xiàn)出一定的偏差，如高背景和非線性濃度響應(yīng)。利用SPR檢測(cè)了在篩選中得到的24個(gè)新型PPIs， 存在23個(gè)特定的配體-分析物相互作用。研究者另外測(cè)試了35種PHA預(yù)測(cè)的PPIs，觀察到 33個(gè)特定的相互作用。在小鼠和跨物種（人類-小鼠）的同源蛋白之間還觀察到了另外三個(gè)PPIs。總之，本研究利用SPR共驗(yàn)證了59個(gè)新型PPIs。 4    apECIA-PHA組合方法揭示多種DCC亞家族間PPIs 軸突導(dǎo)向因子-1受體DCC在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能較為明確，且DCC作為依賴性受體，與結(jié)直腸癌和其他癌癥密切相關(guān)，但在癌癥中的作用尚不清楚。研究者發(fā)現(xiàn)DCC與胰

9、島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（IGFBPL1）結(jié)合，但不與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（IGFBP7）結(jié)合（圖2I和3A）。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，IGFBPL1和IGFBP7在同一簇中，并且在各亞家族成員之間具有最高的氨基酸序列相似性（55）。SPR檢測(cè)分析顯示，DCC均能與IGFBPL1和IGFBP7結(jié)合（圖3C）。PHA顯示 DCC聚集的四種蛋白質(zhì)：PUNC、PUNC e11、再生蛋白（NEO1）和原蛋白（PRTG）（圖3A）。這些蛋白質(zhì)共同作用于多種生理過(guò)程，包括神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌生成和血管生成、炎癥和組織再生、白細(xì)胞遷移、神經(jīng)管和乳腺形成、骨骼和結(jié)締組織發(fā)育以及干細(xì)胞分化。PUNC是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

10、過(guò)程中所表達(dá)的“孤兒”受體。PUNC e11和PRTG結(jié)合細(xì)胞間粘附分子5（ICAM5）（圖3A），該蛋白質(zhì)在大腦中特異性表達(dá)，在突觸形成、穩(wěn)定和細(xì)化中起作用。裂解的ICAM5 ECD通過(guò)細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能，并調(diào)節(jié)腦組織炎癥反應(yīng)。SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)PUNC e11和PRTG可與ICAM5結(jié)合，盡管在篩選中未檢測(cè)到其余DCC亞家族成員中與ICAM5作用的PPIs（圖3C）。在本篩選體系中觀察到一個(gè)或多個(gè)DCC亞家族成員還與WFIKKN2（一種分泌的蛋白質(zhì)，可與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-亞家族成員結(jié)合并調(diào)節(jié)其呈遞給細(xì)胞的狀態(tài)）、乳運(yùn)鐵蛋白（ LTF，一種具有抗菌活性的鐵結(jié)合蛋白）、白細(xì)胞介素6受體亞基（IL

11、-6R，一種細(xì)胞因子受體）和ISLR2 / LINX（在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起作用）。SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有DCC亞家族成員均能與這些蛋白質(zhì)以及篩選得到的其他蛋白質(zhì)結(jié)合（圖3C，3D和3F）。這些結(jié)果表明使用apECIA-PHA方法對(duì)于確定篩選體系外的PPIs具有重要意義，闡釋更加完整的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖3F）。 圖2. PPIs網(wǎng)絡(luò)的區(qū)域選擇。A.選擇包含四個(gè)未連接到網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)PPIs（CD146，CNTN1，NFASC和NrCAM）; B. 主要由免疫系統(tǒng)蛋白組成的區(qū)域; C.生物系統(tǒng)內(nèi)和跨生物系統(tǒng)的PPIs區(qū)；D. 突出顯示亞家族特異性IIA型和IIB型PTPR PPIs的兩個(gè)

12、區(qū)域; E. 突出顯示“孤兒”受體ILDR1和PUNC的PPIs區(qū);  F. 顯示LILR亞家族PPIs的區(qū)域；G.具有非Siglecs（CD33 / Siglec-3）的Siglec PPIs的區(qū); H. Siglec-Siglec PPIs（CD33 / Siglec-3; MAG / Siglec-4a; SN / Siglec-1區(qū); I. 突出神經(jīng)系統(tǒng)蛋白之間以及免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)蛋白間相互作用的PPIs區(qū) 圖3. SPR驗(yàn)證經(jīng)apECIA-PHA確定的DCC亞家族PPIs。A. DCC亞家族PPIs樹狀圖，綠色表示在apECIA篩選中觀察到并由SPR驗(yàn)證的，品紅

13、色表示PHA預(yù)測(cè)并由SPR驗(yàn)證的PPIs; B. PSG PPIs樹狀圖; C. DCC亞家族、IL6-R和ISLR2結(jié)合各種配體的SPR傳感圖; D. IL-6R結(jié)合ISLR2的SPR傳感圖；E. DSCAM和DCC結(jié)合PSG的SPR傳感圖; F. SPR驗(yàn)證的PPIs網(wǎng)絡(luò)。 5    LAR-PTRR亞家族間PPIs 5.1  LAR-PTRR亞家族與SALMs間具有PPIs IIA型酪氨酸磷酸酶受體（LAR-PTPR）的LAR家族包括PTPRF（也稱LAR），PTPRD和PTPRS（圖4A和4B）。LAR-PTPR在突

14、觸組織和功能中起重要作用。突觸前的LAR-PTPR與多個(gè)突觸后配體通過(guò)PPIs介導(dǎo)跨突觸粘附。LAR-PTPRs及其配體突變的小鼠表現(xiàn)出突觸結(jié)構(gòu)和功能的缺陷。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定LAR-PTPR和SALM2 / 3/5之間的多種PPIs（圖4A）。在本篩選體系中觀察到上述已知和其它尚未明確的PPIs（圖2D, 4A和4C）。進(jìn)一步利用SPR檢測(cè) LAR-PTPR與所有SALM的相互作用。除PTPRF-SALM4外，所有LAR-PTPR均與SALM家族結(jié)合（圖4E）。但PTPR-SALM對(duì)在最大響應(yīng)單位（RU）方面存在差異，提示LAR-PTPR和SALM之間的親和力具有一定的范圍（圖4F）。&#

15、160;5.2  LAR-PTRR亞家族與白細(xì)胞介素1受體輔助蛋白（IL1APs）間具有PPIs LAR-PTPR與IL1RAP和IL1RAPL1間跨突出的相互作用，可誘導(dǎo)突觸前和突觸后雙向分化。以往研究認(rèn)為IL1RAP與所有LAR-PTPRs和帶有PTPRD的IL1RAPL1相互作用，此外，研究者還觀察到IL1RAPL1與PTPRS的結(jié)合（圖2D）。IL1RAPL1與IL1RAPL2具有79的序列相似性，IL1RAPL2作為腦中表達(dá)的孤兒受體，生物學(xué)功能尚不明確。在本篩選體系中，研究者觀察到IL1RAPL2與PTPRD和PTPRS結(jié)合（圖2D）。此外，篩選體系以及SPR實(shí)

16、驗(yàn)均表明 IL1RAPL2可與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（FGFR3）相互作用。 5.3  IIB型PTPR與DSCAMs具有PPIs IIB型PTPR在大多數(shù)組織中表達(dá)，并調(diào)節(jié)多種過(guò)程(細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和分化、免疫細(xì)胞發(fā)育等）。IIB型亞家族由PTPRK，PTPRM和PTPRT組成（圖4A和4B），并且多個(gè)配體已經(jīng)明確。研究者在此發(fā)現(xiàn)所有IIB型PTPR與唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子（DSCAM）和唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子樣-1（DSCAML1）結(jié)合（圖4A和4C）。DSCAMs的ECD區(qū)包含9個(gè)Ig樣區(qū)域，緊隨 4個(gè)FN3域，1個(gè)Ig樣域和2個(gè)FN3域（圖4B）。N端與同

17、種抗原結(jié)合，并介導(dǎo)與netrin-1和split-1的結(jié)合，尚為證實(shí)C端ECD區(qū)域的結(jié)合配體。此外，研究者觀察到兩個(gè)DSCAM（DSCAM-CT和DSCAML1-CT）和所有IIA型PTPR的C端結(jié)合（圖4C）。SPR實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了DSCAM-CT和DSCAML1-CT與PTPRT和PTPRM的結(jié)合（盡管PTPRK表達(dá)水平較低）（圖4D）。 圖4. SPR驗(yàn)證IIA型和IIB型PTPR與SALM和DSCAM的結(jié)合。A.樹狀圖突出顯示SALM，DSCAM，IIA型PTPR（PTPRF / S / D）和IIB型PTPR（PTPRT / M / K）的系統(tǒng)發(fā)育性聚類（左），經(jīng)過(guò)SPR

18、驗(yàn)證的PPIs(右)；B.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu); C.顯示PTPRF / S / D和PTPRT / M / K亞家族的PPIs特異性篩選數(shù)據(jù)；D. DSCAML1-CT和DSCAM-CT與PTPRM和PTPRT結(jié)合的 SPR傳感圖; E. PTPRS與SALM和DSCAM-CT結(jié)合的SPR傳感圖; F. PTPRF / S / D與SALM組合的SPR最大RU值。6    免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)間新型PPIs 研究人員在免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)以及孤兒受體發(fā)現(xiàn)了新的PPI（圖2B）。檢測(cè)到孤兒粒細(xì)胞受體CEACAM4的兩個(gè)PPI，分別為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（VEGFR3）和程序性細(xì)

19、胞死亡1配體2（PD-L2）。CEACAM4是在免疫系統(tǒng)，上皮和內(nèi)皮細(xì)胞以及大腦中表達(dá)的癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子亞家族的成員。此外，研究者還觀察到CEACAM1與免疫檢查點(diǎn)受體PD-1（程序性細(xì)胞死亡蛋白1）結(jié)合。PD-1及其配體PD-L1和PD-L2的相互作用抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子生成和細(xì)胞毒性。PD-L2與PD-L1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PD-1，并且在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，提示PD-L2可能在腫瘤逃逸中發(fā)揮作用。SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PD-L1和PD-L2之間的已知PPIs，并觀察到PD-L1的同系結(jié)合（既往未知的PPIs）。通過(guò)對(duì)PD-L1與PD-1結(jié)合（在約400 nM時(shí)接近飽和）的比較，推斷PD-L1同源

20、結(jié)合的親和力低于與PD-1的結(jié)合。這也解釋了在既往PD-1 / PD-L1研究中未發(fā)現(xiàn)此PPIs的原因，暗示多聚蛋白對(duì)低親和力PPIs的檢測(cè)具有重要價(jià)值。 6.1  嗜同性和嗜異性Siglec亞家族PPIs 在此篩選體系中具有最多PPIs的蛋白質(zhì)中有八個(gè)是Siglec亞家族的成員，該蛋白質(zhì)高度受限于免疫系統(tǒng)，對(duì)Toll樣受體（TLR）信號(hào)具有免疫調(diào)節(jié)作用，并在自我和異己識(shí)別中具有重要作用。Siglecs在細(xì)胞上差異表達(dá)，特異性識(shí)別健康細(xì)胞、發(fā)炎或惡性細(xì)胞以及病原體上存在的唾液酸多聚糖。此外，研究者觀察到Siglecs之間的同質(zhì)和異質(zhì)性PPIs網(wǎng)絡(luò)（圖2H）以及與遠(yuǎn)

21、距離蛋白間的PPIs。 6.2  免疫和神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)間的PPIs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞激活分子亞家族（SLAM）表達(dá)于大多數(shù)免疫細(xì)胞中，SLAMs在先天和適應(yīng)性免疫中起共刺激和共抑制分子的作用，并且對(duì)于自身免疫性疾病不可或缺。SLAMF9作為孤兒受體，研究者觀察到其與殺菌通透性增加蛋白（BPI）和IGSF10結(jié)合（圖2C）。BPI是中性粒細(xì)胞衍生的抗生素蛋白，通過(guò)其高度陽(yáng)離子化的N端結(jié)構(gòu)域發(fā)揮殺菌作用。BPI的C端結(jié)構(gòu)域沒(méi)有殺菌活性，能夠與其他蛋白質(zhì)相互作用，并在不同的過(guò)程中發(fā)揮作用。IgSF10也是一種孤兒受體，參與促性腺激素釋放激素表達(dá)（GnRH）神經(jīng)元的遷移

22、。IgSF10在免疫系統(tǒng)中功能未知，而SLAMF9在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能尚不清楚，因此本研究揭示了來(lái)自不同生物系統(tǒng)的兩個(gè)孤兒受體之間的PPIs。 6.3  妊娠特異性糖蛋白（PSG）間的PPIs 妊娠期間，PSG是母體血液中最豐富的滋養(yǎng)層蛋白，可作為滋養(yǎng)層質(zhì)量和胚胎存活力的標(biāo)志，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究表明PSG還具有免疫調(diào)節(jié)、促血管生成和抗血小板聚集功能。研究者觀察到幾種PSG結(jié)合配體，包括血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體（PDGFRA）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FGFR4）、C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員A（CLEC4A）、DCC和DSCAM（圖2I和3B）。但PSG與這

23、些配體的結(jié)合具有一定的選擇性和差異（圖2I）。SPR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DCC和DSCAM與PSG7和PSG9的結(jié)合（圖3E）。這些PPIs為研究PSG在妊娠、免疫調(diào)節(jié)和血管生成中的作用提供了新的候選受體。 6.4  LILR亞家族與BTNL8和髓鞘蛋白間的PPIs 白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（LILRs）是激活性（LILRA）和抑制性（LILRB）受體的一個(gè)亞家族，在炎癥、免疫耐受和分化中表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性和功能。多個(gè)激活和抑制性LILR與butyrophilin-8（BTNL8）的結(jié)合（圖2F）。BTNL是擴(kuò)展的B7分子家族成員，可作為 T細(xì)胞活化的共刺激或共抑制信號(hào)。此外

24、，LILRs也表達(dá)在神經(jīng)元上，并在發(fā)育、突觸可塑性和軸突再生的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。髓磷脂是軸突周圍的保護(hù)性絕緣層，可抑制脊髓損傷后的神經(jīng)元再生。已知三種髓磷脂蛋白Nogo，MAG和OMgp與小鼠中的PirB（兩種小鼠LILRB直系同源物中的一種）相互作用。同時(shí)，觀察到多個(gè)LILRs與兩個(gè)其他髓磷脂蛋白結(jié)合，即髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）和髓磷脂蛋白P0（MPZ）（圖2F）。這些PPIs提示MOLI和MPZ與LILR的結(jié)合可作為神經(jīng)元再生研究的新靶點(diǎn)。 6.5  PVR選擇性與殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）相互作用 多基因殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）是在

25、自然殺傷（NK）細(xì)胞上表達(dá)的激活和抑制蛋白的高度多態(tài)性亞家族，可調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、成熟和激活。NK細(xì)胞最初會(huì)隨機(jī)表達(dá)KIRs，在成熟過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化以調(diào)整殺傷反應(yīng)閾值，并確保從健康細(xì)胞中區(qū)分靶細(xì)胞。本研究觀察到KIR2DL5與脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）結(jié)合（圖2C和5A）。ECIA滴定分析和SPR同樣證實(shí)KIR2DL5與PVR的結(jié)合（圖5C和5D）。為驗(yàn)證在細(xì)胞表面的結(jié)合，將PVR-Fc和KIR2DL5-Fc的熒光四聚體（ECD-Fc：SA-647）分別與轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)KIR2DL5-或 PVR的細(xì)胞共孵育。流式細(xì)胞儀分析顯示兩種配體與表達(dá)同源全長(zhǎng)受體細(xì)胞的結(jié)合具有濃度依賴性（圖5E）。PVR-Fc

26、四聚體不結(jié)合經(jīng)全長(zhǎng)KIR2DL4和KIR2DL1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，全長(zhǎng)KIR2DL4和KIR2DL1與KIR2DL5分別具有87和69的序列相似性（圖5B和5F）。為進(jìn)一步驗(yàn)證PVR對(duì)KIR2DL5的特異性，研究者利用11個(gè)KIRs進(jìn)行了ECIA，PVR與KIR2DL5特異性結(jié)合（圖5G）。由于KIR2DL5與病毒易感性以及抗病毒治療的低應(yīng)答有關(guān)，本研究觀察到的特異性結(jié)合暗示KIR2DL5在免疫應(yīng)答中具有一定作用。 圖5. PVR與 KIR2DL5特異性相互作用。AKIR2DL5和PVR的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)；B.篩選體系中 KIR家族樹狀圖；C.用ECIA滴定KIR2DL5-Fc上的PVR-

27、5AP（左）和PVR-5AP上的KIR2DL5-Fc（右）; D.PVR結(jié)合KIR2DL5的SPR傳感圖和穩(wěn)態(tài)曲線; E.用PVR-Fc：SA-647對(duì)轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)KIR2DL5和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行染色（上），對(duì)使用KIR2DL5-Fc：SA-647的轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)PVR和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行染色（下），并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析；F.用PVR-Fc：SA-647和對(duì)照蛋白對(duì)轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)KIR2DL5，KIR2DL4，KIR2DL1和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析（上），抗His-647染色的流式細(xì)胞儀分析（下）；G. ECIA檢測(cè)具有11個(gè)KIR ECD-Fc誘餌的PVR-5AP（上）， KIR-Fc的抗His

28、蛋白質(zhì)印跡分析（下） 6.6  TrkA選擇性與TIE1相互作用 高親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NTRK1）也稱為TrkA，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有的功能較為明確，然而其在免疫系統(tǒng)中的作用尚未明確。TrkA在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、靜息和活化的B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和成紅細(xì)胞中均有表達(dá)。研究者在篩選體系中觀察到TrkA與酪氨酸蛋白激酶受體TIE1結(jié)合，但不與TIE2結(jié)合（圖2A和6A）。SPR實(shí)驗(yàn)同樣表明TrkA與TIE1結(jié)合，但不與TIE2結(jié)合（圖6B）。接下來(lái)，研究者探討TrkA是否可以同時(shí)結(jié)合NGF和TIE1，利用NGF對(duì)TrkA預(yù)處理，并通過(guò)SPR實(shí)驗(yàn)比較Trk

29、A±NGF與TIE1的結(jié)合（圖6B）。與單獨(dú)的TrkA相比，TrkA：NGF與TIE1的結(jié)合其最大相應(yīng)單位（RU）升高，表明與NGF結(jié)合的TrkA可以與TIE1相互作用。此外，研究者檢測(cè)TrkA-Fc四聚體與轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)TIE1細(xì)胞的結(jié)合，觀察到與轉(zhuǎn)染TIE1細(xì)胞的結(jié)合具有濃度依賴性（圖6C）。這些數(shù)據(jù)表明TrkA與TIE1的相互作用可能在血管生成和/或其他生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。 7    瘦素與ISLR2相互作用 瘦素是一種主要由小腸中的脂肪細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，是維持能量穩(wěn)態(tài)和體重所必需的。瘦素通過(guò)與下丘腦神經(jīng)元亞型中的瘦素

30、受體（LEPR）結(jié)合而發(fā)揮上述功能。瘦素缺乏會(huì)導(dǎo)致各種代謝異常和罕見的遺傳缺陷。然而許多其他類型的細(xì)胞也分泌瘦素，且LEPR在其他神經(jīng)元亞型和非神經(jīng)元細(xì)胞中均表達(dá)，表明瘦素在其他過(guò)程中同樣發(fā)揮作用。本研究觀察到瘦蛋白與神經(jīng)元表達(dá)的ISLR2結(jié)合（圖2A），ISLR2的ECD區(qū)包含七個(gè)LRR，其后是三個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域（圖6D）。為了繪制與瘦素結(jié)合的ISLR2區(qū)域，研究者利用兩個(gè)包含LRR1-7和Ig1-3的ECD截短域，經(jīng)ECIA測(cè)量其瘦素的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘦蛋白可等效地結(jié)合到整個(gè)ECD和LRR1-7，但并不與Ig1-3的結(jié)合（圖6E）。同樣，研究者檢測(cè)瘦素-Fc四聚體與轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)ISLR2細(xì)胞的結(jié)合，觀察到與轉(zhuǎn)染ISLR2細(xì)胞的結(jié)合具有濃度依賴性（