1、熒光原位雜交技術(shù)原理儀器耗材試劑及配制標(biāo)本制備探針的制備雜交與檢測注意事項一、原理將熒光素直接標(biāo)記的核酸探針（或生物素、地高辛等標(biāo)記的核酸探針）與標(biāo)本中的靶核酸序列按照堿基互補配對原則進(jìn)行雜交，經(jīng)洗滌后直接（或通過免疫熒光信號擴(kuò)增）在熒光顯微鏡下觀察，從而對靶目標(biāo)中的待測核酸進(jìn)行定性、定位或定量的研究。二、儀器耗材儀器： 熒光顯微鏡及分析軟件， PCR擴(kuò)增儀（變性），370C隔水培養(yǎng)箱(雜交)，濕盒，恒溫水浴箱，冰箱，普通離心機(jī)，小型高速低溫離心機(jī)，移液槍（1000ul,200ul, 20ul，10ul）,玻片盒，通風(fēng)櫥，震蕩混勻器，染色缸、計時器，溫度計，溫濕度顯示器，量筒，酒精燈，燒杯，天

2、平，試劑瓶等。二、儀器耗材耗材： 離心管(50ml,15ml,1.5ml)，PCR管，各種規(guī)格的tip頭，載玻片（帶磨砂的），大蓋玻片（ 方形，用于鏡檢），小蓋玻片（一般用圓形，用于雜交時候封片），封片膠等。三、試劑液體LB，氯霉素，STE，BAC試劑盒，異丙醇，NICK試劑盒，無水乙醇，甲酰胺, 20SSC，2SSC ，70%酒精，90%酒精，100%酒精，BSA，HumanCotI DNA，50%硫酸葡聚糖，0.3%NP40/0.4SSC， PBS緩沖液，0.1%NP40/2SSC，DAPI 染色液等。四、標(biāo)本制備 按第四章人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及收獲及染色體制備收獲外周血中期染色體，調(diào)整懸液濃度

3、（20倍物鏡視野下20-30個細(xì)胞，分裂指數(shù)在4%以上為宜），懸液-200C保存。五、探針的準(zhǔn)備BAC-DNA的抽提標(biāo)記純化1、BAC-DNA的抽提無菌操作臺上，接種BAC菌種7ul于含氯霉素（氯霉素終濃度為30ug/ml）的15ml液體LB培養(yǎng)液中，空氣搖床上37，280rpm，震蕩培養(yǎng)18-20h。4000 rpm，4，離心10min去上清，加入5mlSTE(冰預(yù)冷)重懸4000 rpm，4，離心10min去上清，加入250ul P1 (冰預(yù)冷)重懸轉(zhuǎn)入1.5mlEP管中(冰預(yù)冷5min)加入250ul P2(預(yù)溫)輕輕轉(zhuǎn)6次，室溫靜置5min加入250ul P3(冰預(yù)冷)輕輕轉(zhuǎn)6次，冰上

4、5min13200 rpm，4，離心10min1、BAC-DNA的抽提移上清至新的EP管（冰預(yù)冷），加入700ul異丙醇，混勻13200 rpm，4，離心10min去上清，加入1ml 70%無水乙醇混勻13200 rpm，4，離心10min去上清，加入15ul Nuclease-free water溶解DNA室溫放置2、標(biāo)記探針采用缺口平移標(biāo)記法（NICK試劑盒）在0.5mlEppendorf管中加入： Nuclease-free water 13.5ul dNTP mix （0.1mM） 10ul dTTP（0.1mM） 5ul 10buffer 5ul 模板DNA（1-1.5ug） 6ul

5、 SpectrumGreen 或 SpectrumOrange 或 SpectrumRed dUTP（0.2mM） 2.5ul Nick translation enzyme 8ul 總體積 50ul2、標(biāo)記探針上PCR儀：15 8小時75 10分鐘滅活4保存取標(biāo)記后的探針5ul跑1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，標(biāo)記后探針長度范圍在100-400bp較好（穩(wěn)定，達(dá)到5000bp）3、純化探針在1.5mlEppendorf管中加入： Ecoli tRNA（1ug/ul） 1ul 鮭魚精DNA（10mg/ml） 5ul 8M醋酸胺 6ul 糖元 （10mg/ml） 1ul 4保存。3、純化探針將標(biāo)記好的探

6、針加入上述Eppendorf管，再加入-20無水乙醇200ul，-70放置30分鐘4，15000rpm，離心10分鐘去上清，加入200ul70%乙醇4，15000rpm，離心5分鐘吸去乙醇，立即加入甲酰胺25ul室溫，避光，溶解10分鐘，-20保存六、雜交與檢測外周血玻片準(zhǔn)備雜交體系準(zhǔn)備雜交洗脫結(jié)果觀察1、外周血玻片準(zhǔn)備75烤箱烘烤2小時置于2SSC 中30min依次放入70%，90%，100%酒精中各2min室溫干燥2、雜交體系準(zhǔn)備 在1.5mlEppendorf管中加入 20SSC 1.5ul BSA（1ug/ul） 1ul HumanCotI DNA （1mg/ml） 2ul 探針 3.

7、75ul 甲酰胺 3.75ul 50%硫酸葡聚糖 3ul 總體積 15ul3、雜交PCR擴(kuò)增儀開啟，使溫度達(dá)到80滴加配好的雜交液15ul于雜交區(qū)蓋上蓋玻片，封膠，PCR擴(kuò)增儀80變性2min將玻片置于濕盒，放入37雜交16小時以上4、洗脫雜交次日 70 0.4SSC/0.3%NP40 漂洗2min室溫 2SSC/0.1%NP40 漂洗 1min室溫2SSC 2min室溫70%，90%，100%酒精中脫水各2min室溫干燥加20ul DAPI加到雜交區(qū)，蓋上蓋玻片，復(fù)染10min熒光顯微鏡下觀察結(jié)果5、結(jié)果觀察觀察鏡下熒光雜交信號， 計數(shù)30個細(xì)胞和采集4張圖像。七、注意事項玻片準(zhǔn)備時要注意玻片的干凈和透明度；雜交過程中要保持濕潤；雜交必須對玻片變性溫度進(jìn)行摸索；染色體制備分