1、朊病毒結構研究和致病機理分析【精選文檔】朊病毒結構研究和致病機理分析摘要朊病毒病是人和動物的一種退行性腦病，主要包括羊騷癢病，瘋牛病，以及人的克雅氏綜合癥等.其致病因子被認為是一種由正常細胞PrP蛋白經非正常折疊所形成的蛋白質（PrPsc）。PrPsc和PrPc來自于同一基因具有相同的氨基酸序列，但在二級結構和三級結構上有很大的不同。科學界認為朊蛋白是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白關鍵詞:朊病毒 PrPc PrPsc 重組朊蛋白 高級結構 朊病毒(Prion Protein , PrP）是一種蛋白質亞病毒，是只有蛋白質而沒有核酸的病毒，形態(tài)特征為小型蛋白質顆粒,大約有250個氨基酸組成，大小

2、僅為最小病毒的1%.它是由動物機體中高度保守的朊病毒蛋白基因編碼的蛋白質并能在機體的多種細胞中表達，在中樞神經系統(tǒng)及神經元細胞中表達量最高。朊病毒具有兩種不同的分子構象：一種是存在于正常機體或感染動物的細胞中，沒有致病作用，稱為細胞朊蛋白（PrPc）,另一種是僅存在于感染動物的細胞中，稱為朊病毒蛋白（PrPsc)。兩種蛋白的一級結構完全相同，但二極結構及高級結構則有著顯著差異.此種病毒可導致庫魯?。↘urmm）、克雅氏綜合癥（CJD）、格斯特曼綜合癥(GSS）、致死性家族失眠癥（FFI）等常見人類疾病以及羊瘙癢病和瘋牛病等動物疾病1。朊病毒的傳播途徑包括：使用動物肉骨粉飼料、牛骨粉湯；醫(yī)源性感

3、染，如使用腦垂體生長激素、促性腺激素和硬腦膜移植、角膜移植、輸血等。朊病毒特點是耐受蛋白酶的消化和常規(guī)消毒作用,由于它不含核酸,用常規(guī)的PCR技術還無法檢測出來。朊病毒的復制并非以核酸為模板，而是以蛋白質為模板。斯坦利由于發(fā)現PrPSC（一普里朊）和PrPC具有相同的一級結構而具有不同的二級和三級結構，打破了以往蛋白質的一級結構決定高級結構的定律，而獲得了1997年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎2。1982年普魯宰納提出了朊病毒致病的“蛋白質構象致病假說”,以后魏斯曼等人對其逐步完善.其要點為:1、朊病毒蛋白有兩種構象：正常型PrPc和致病型PrPsc，兩者的主要區(qū)別在于其空間構想上的差異。PrPc僅存

4、在螺旋,而PrPsc有多個折疊存在,后者溶解度低，且抗蛋白酶解；2、PrPsc可脅迫PrPc轉化為PrPsc，實現自我復制，并產生病理效應；3、基因突變可導致細胞型PrPc中的螺旋結構不穩(wěn)定，至一定量是產生自發(fā)性轉化，片層增加，最終變?yōu)镻rPsc型，并通過多米諾效應倍增致病3。朊病毒的一級結構PrP前體全長為253個（人)264個(牛）氨基酸，分子質量為3335KD。 PrP前體的N端的22個疏水氨基酸殘基為信號肽序列。C端的23個(人為22個）疏水氨基酸殘基是糖基磷酸肌醇結合位點（GPI）。這兩部分將通過翻譯后修飾水解除去,因此人的成熟PrP僅為中間的第23位第231位氨基酸共209個殘基組

5、成的序列。N端的2395位氨基酸殘基之間有一個富含組氨酸和甘氨酸的八肽重復區(qū)（PHGGGWGO）(5191位氨基酸),第96112位氨基酸序列是PrP的結構控制區(qū)，113135位有一段跨膜區(qū)，135231位之間是3個束狀螺旋區(qū)域4。 成熟的PrP分子有兩個N型糖基化位點，分別為第181位和第197位的兩個天冬酰胺（Asn)殘基，在第179位和第214位的兩個半胱氨酸（Cys)殘基之間有一個二硫鍵，第183位和第192位的2個蘇氨酸（Thr）磷酸化序列一致,第145位的酪氨酸（Tyr）被硫化，第155位的酪氨酸是其磷酸化位點之一(除靈長類及嚙齒類動物之外）,第147位第163位的氨基酸之間有一芳

6、烴回文序列. 此外PrP含有3組不同的短肽重復,第一組為6肽重復結構；第二組為8肽重復結構（PHGGGWGQ）(其中第一個重復是9肽:PQGGGGWGQ）；第三組是2個肽的串聯重復，與前面所提到的芳烴回文序列部分重合，所有這些重復似乎為PrP獨有2。研究發(fā)現PrP序列中的糖基化位點，形成二硫鍵的Cys位點和疏水的跨膜區(qū)最為保守。其次為N端的信號肽水解位點，C端的糖基磷酸肌醇結合位點(GPI）和螺旋結構區(qū)域的序列,八肽重復序列極為保守，均為P（H/Q)GGG（G/)WGQ,但不同物種之間的重復拷貝數有所不同.PrP經過蛋白酶K水解后，其正常的PrPc被完全水解掉，而有侵染特性的PrPsc則被水解

7、掉N端的67個氨基酸殘基和C端的25個氨基酸,變?yōu)榉肿淤|量只有2730KD的PrP2730。據研究推測蛋白酶K的N端切點位于富含G的八肽重復區(qū)域，在8990位點的GW間的肽鍵斷裂。這種具有抗蛋白酶K功能的PrP2730（PrPres）的出現被認為是朊蛋白病毒致病的關鍵5.一般認為PrPc三維結構形似“風箏"，其N端存在著缺乏有序結構的片段，這一結構片段高度柔順,可以在溶液中隨意擺動,猶如風箏的“尾巴”，在其C端則含有3個螺旋,2個反向平行的-折疊及一個二硫鍵，有多處被糖基化、磷酸化、硫基化等化學修飾的氨基酸位點，結構嚴密，形態(tài)固定，構成一個球狀結構區(qū)域，是一個自折疊單位，整體看來形似

8、風箏的頭和軀干。最近提出的BoPrP23-230NMR結構模型與HuPrP23230NMR結構模型高度相似,也說明了朊蛋白病的代表瘋牛病從牛傳染給人的可能5.PrPsc及其經過蛋白酶水解后形成的PrP2730極為難溶，以往的變換紅外光譜（FTIR)和核磁共振（NMR）等方法已不可能研究及預測出其較為準確的三維模型.因此在以上研究出的PrPc的結構模型基礎上,人們試將其中的部分螺旋改為折疊，進而探索其新的PrPsc結構模型。PrPCPrPSC PrPSC在N端切割可以產生PrP27-30，這種分子是一種蛋白酶抗性蛋白,能夠聚集成為棒狀淀粉樣蛋白.二級結構出現a 螺旋 b折疊轉換，PrPC的a螺旋

9、含量達到42， b片層僅占3;PrPSC 的a螺旋含量降到30, b片層達到45；PrP27-30 a螺旋含量則僅為21，而b片層達到54%. 具有大量的折疊的PrPsc溶解度會降低，抗蛋白酶水解能力會增強，在轉變過程中,唯一的二硫鍵仍保持完好，主要轉變部位在第90112位的氨基酸殘基之間6 ，b片層含量的增加可能是聚合成淀粉樣原纖維的最直接原因。Prusiner實驗室的Wille最近提出了PrPsc的二維結晶結構模型.這種模型顯示出跟以往不同的特點是螺旋不是轉變?yōu)檎郫B，而是轉變?yōu)槁菪?，整個二維結晶結構模型呈六邊形結構，N端的螺旋位于六角單元之內，與位于六角形邊上的第二個螺旋和第三個螺旋及位于

10、六角形單元之間的糖基相對稱7.他的這個模型是通過電鏡發(fā)現的，結晶結構只能在高分辨率的條件下被發(fā)現，光譜研究條件下折疊和螺旋是不能被區(qū)分的，所以這點差異在早期的研究中沒有被發(fā)現。朊病毒特殊的理化性質1. 高壓蒸汽滅菌（134138）18分鐘不能使其完全滅活。2。 對紫外線（波長254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高40200倍，但是對237nm的紫外線敏感。3。 對一般的離子輻射和超聲波抵抗力很強。4。 對許多微生物有致死作用的一般化學消毒劑對朊病毒卻無法起到坡壞作用，如37的20%的福爾馬林溶液中可存活28個月。5。 對多種核酸酶（RNA酶和DNA酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。這一點也

11、證明了朊蛋白中不含有核酸。6. 一些蛋白質變性劑或氨基酸化學修飾劑對其具有滅活或抑制作用，如尿素、SDS等處理則使其失去活性。朊病毒獨特的生化特性1。 不形成包涵體，不含非宿主蛋白，不誘生干擾素，對干擾素也不敏感，不干擾其他病毒誘生干擾素,也不受普通病毒干擾。2. 不破壞宿主B細胞和T細胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反應。3. 在電鏡下見不到其病原顆粒，但可檢測出癢病相關纖維（SCeapre Associate Fibrils，SAF)4。 朊蛋白病毒一旦致病，免疫增強劑和免疫抑制劑均不能改變致病過程。5。 朊蛋白病毒（PrPsc）在溫和的清潔提取物中大量聚合成癢病相關纖維(SAF）或短桿結

12、構，即在非變性去污劑中不溶,而細胞朊蛋白（PrPc）則可以完全溶于其中，只以單體或是二聚體形式存在，故用核磁共振(NMR）和X光譜分析就可以檢測到PrPc的三維構象，卻不能辨別PrPsc的構象。6. PrPsc具有相對的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K進行水解時，PrPsc只被水解掉其N端的67個氨基酸殘基，形成PrP2730成為其致病的“先驅”.而PrPc則可被完全水解掉11，故PrPsc的半衰期特別長，而PrPc的半衰期短。7. PrPsc和PrPc都依賴于磷酸肌醇磷脂酶結合位點（GPI）附著在細胞表面,經過磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后,PrPsc不能從膜上釋放，而PrPc則可以.

13、用Trion X114進行相分離后，PrPc處于水相.而PrPsc則處于Trion X114相中。8。 用特異的抗體與朊蛋白反應,PrPsc有血清反應，而PrPc則沒有反應。說明兩者的高級結構是不同的8。阮病毒的致病機理阮病毒是一種只含有蛋白質而不含核酸的分子生物并且只能在寄生宿主細胞內生存。因此，合成阮病毒所需的信息有可能是存在于寄主細胞質中，而阮病毒的作用，僅在于激活在寄主細胞中為朊病毒編碼的基因，使得朊病毒得以復制繁殖。另一種學說認為朊病毒的蛋白質能為自己編碼遺傳信息。這種假說與傳統(tǒng)的分子生物學中的“中心法則”是相違背的，因為朊病毒沒有核酸.于是人們假設朊病毒復制可能的方法，一認為是通過

14、逆轉譯過程產生為朊病毒編碼的DNA或RNA（如為RNA則還需進行逆轉錄)必須存在逆轉譯酶，甚至還要有逆轉錄沒。二為蛋白質指導下的蛋白質合成,即蛋白質本身可作為遺傳信息.宿主細胞的朊病毒蛋白能夠被轉化為錯誤折疊且具有傳染性的PrPsc形式，并最終引發(fā)朊病毒疾病。如今，英國科學家通過開發(fā)出一種新的細胞體系,從而為研究朊病毒蛋白如何被轉化為錯誤折疊的蛋白質提供了新的視點。研究人員認為,這一發(fā)現為朊病毒疾病藥物的研制鋪平了道路。為了更為詳細地研究朊病毒的轉化,倫敦大學學院的R。 Goold和同事開發(fā)的朊病毒蛋白在羧基端表達了一個MYC標簽.它們被轉染進入一個易感朊病毒的小鼠細胞系該細胞系內生的朊病毒蛋

15、白已被“沉默”了。研究人員發(fā)現，被MYC標記的結構在野生型水平上被表達并且正常地局部化，同時在暴露于朊病毒的情況下會完全轉化為MYC標記的PrPsc。為了證實這些細胞在產生具有傳染性的朊病毒，它們的提取物被用來感染小鼠，后者隨后發(fā)展出了神經病理類型的朊病毒疾病.之前的研究表明，重新合成的PrPsc在暴露于傳染物質72小時（或更長)后將會出現。有趣的是，研究人員發(fā)現，一些MYC細胞會在兩個小時內積聚成PrPsc，并且實際上僅僅1到2分鐘的暴露便足以導致轉化。因此研究人員指出，轉化比之前的認識快得多。 質膜暗示了朊病毒轉化的位點，事實上,在細胞暴露于傳染物質僅1分鐘的時間里，PrPsc僅僅出現于質

16、膜上。然而，細胞內的PrPsc在暴露2分鐘后才被發(fā)現，這意味著它被迅速內吞，并輸送進入細胞。實際上,PrPsc在細胞內的位置被發(fā)現依賴于暴露的時間長度，即PrPsc在最早的時間點被特有地置于質膜上,并隨后分布在細胞內部。為了證明朊病毒轉化能夠發(fā)生在質膜上，研究人員抑制了內吞作用，這并沒有防止PrPsc的形成。重要的是，在經過特定磷酸肌醇磷脂酶C或完全破壞脂筏的介質處理后，PrPsc的水平在MYC細胞中顯著下降.因此，最初的朊病毒轉化似乎首先發(fā)生在質膜上，或許也在脂筏中。然而，通過在PrPsc被內吞后加速轉化，細胞內的分隔可能在其中扮演了一個角色9.人工重組朊蛋白的成功，一方面，使原本一直爭論不

17、休的國際學術界，在“朊病毒”假說上有了理論突破。它表明了,蛋白質也能夠進行信息遺傳.因為朊病毒沒有核酸亦沒有能夠自行運作的完整系統(tǒng)，但卻能夠侵入并掠奪周邊細胞，將其也感染成病毒，從而進行大規(guī)模的細胞破壞.于是人們假設朊病毒可能是通過蛋白質指導下的蛋白質擴增,即蛋白質本身可作為遺傳信息。另一方面，“朊病毒”假說得到論證,可能催生出生物醫(yī)學研究的一個新領域蛋白質變化的誘導機制。即在論證了蛋白質本身可作為遺傳信息的基礎上，進一步證明并非只有朊蛋白才可能誘變成朊病毒，別的蛋白質也可能存在相似的轉變，那么，在其它神經退行性疾病，如老年癡呆、帕金森病等是否存在類似機制，引起了人們的廣泛關注。從現實意義來說

18、,它有助于發(fā)展準確可靠的診斷技術，全面監(jiān)測、檢測朊病毒病，特別是做到對瘋牛病和醫(yī)源性感染的早期預防.由于假說得到論證,科學家們現在正著手研制一種快速檢測試劑，以便檢測出進出口的牛羊畜肉上是否含有會使人傳染瘋牛病的“朊病毒”。另外，這一研究成果也是首次建立了實驗動物模型.在小鼠身上進一步試驗，以了解更多朊病毒的相關情況。根據目前報道，因鼠和人的蛋白質結構差異大,存在一定的種屬屏障，人鼠不會互相傳染。參考文獻1。 趙克霞 朊病毒研究新進展 淮南師范學院學報 2002年第3 期第四卷（總第15期)2. 奚正德，馬寶驪 毒朊,感染的一種新的生物學原理-1997年度諾貝爾生理/醫(yī)學獎評析(J）。cell,19