1、熒光染料CFSE檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的研究丘凌1,何珊2,黃瑞13, 張雁云2,3(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,江蘇蘇州215007;2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院健康科學(xué)中心;3.上海第二醫(yī)科大學(xué)上海市免疫學(xué)研究所,上海200025摘要:目的評(píng)價(jià)熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE用于淋巴細(xì)胞及其亞群增殖狀況追蹤的效果。方法利用熒光染料CFSE作為細(xì)胞標(biāo)記,結(jié)合熒光標(biāo)記的抗體,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群體外增殖情況。結(jié)果該方法不僅可以測(cè)定淋巴細(xì)胞及其亞群的增殖情況,而且可以估算細(xì)胞分裂的周期。結(jié)論熒光染料CFSE是一種可以監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群增殖狀況的很好的示蹤劑。關(guān)鍵詞

2、:熒光染料CFSE;流式細(xì)胞儀;淋巴細(xì)胞增殖中圖法分類號(hào):R392-33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1009-881X(200501-0022-02Determination of Lymphocyte Proliferation by Fluorescein B ased Dye CFSEQIU Ling,HE Shan,HUANG Rui,et al(Department of Microbiology,Medical C ollege of Suzhou University,Suzhou,215007Abstract:ObjectiveT o evaluate the role of ca

3、rboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSEin the deter2 mination of lym phocyte proliferation.MethodsCFSE staining combined with fluorescent antibody labeling and flow cy2 tometry are used to detect the proliferation kinetics of lym phocytes and their subsets after stimulation of colonel st

4、imulators in vitro.R esultsThe results show that this technique is not only applicable to proliferation analysis of lym phocytes and their subsets,but can estimate the rounds of cell division using flow cytometry.ConclusionCFSE is an excellent stain to be used to analysis the lym phocytes and their

5、subsets proliferation.K ey w ords:fluorescein based dye CFSE;flow cytometry;lym phocyte proliferation羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料,具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán),使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物1。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí),CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中,因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣,在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中,各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)

6、度呈對(duì)半遞減,利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光1 (F L1檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析2。本研究通過對(duì)克隆刺激劑引起淋巴細(xì)胞及其亞群的增殖,對(duì)CFSE 檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的意義進(jìn)行評(píng)價(jià)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑G ibco產(chǎn)品;胎牛血清(FCS購于浦東高橋牧工商有限公司;淋巴細(xì)胞分離液(Lym phoprep購于AXIS2 SHIE D(挪威;二甲亞砜(DMS O和PS均購自Sigma 公司(美國;CFSE購自M olecular probes公司(美國;PE標(biāo)記的抗小鼠B220單克隆抗體(mAb采用BD Phamengin產(chǎn)品。1.2方法22Chin J Hem orh.2005;1

7、5(1收稿日期:2004-09-29作者簡介:丘凌(1977-,女,湖南衡陽人,碩士研究生。3導(dǎo)師 小鼠后,取脾臟置于細(xì)胞篩網(wǎng)內(nèi),脾臟在含2.5%FCS 的P BS 溶液中,經(jīng)研磨吹打后制成細(xì)胞懸液。以Lym phoprep 用密度梯度法分離得到小鼠脾臟的單個(gè)核細(xì)胞。以P BS 洗滌兩次后,細(xì)胞重懸于含2.5%FCS 的P BS 中。濃度為5m M CFSE 的二甲亞砜溶液以P BS 1:50倍稀釋后,取25L 加入至濃度為1×107/m L 的上述細(xì)胞懸液1m L 中。充分混勻后放入37細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15min 。用冷P BS 終止反應(yīng), 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示未加入LPS 刺激培養(yǎng)的

8、對(duì)照組中其單個(gè)核細(xì)胞CFSE 熒光強(qiáng)度一致,沒有發(fā)生明顯的增殖改變,表現(xiàn)為一個(gè)單峰;而加入LPS 共同培養(yǎng)的刺激組單個(gè)核細(xì)胞則發(fā)生了顯著的增殖,表現(xiàn)為一系列CFSE 熒光強(qiáng)度呈對(duì)半遞減的子峰;根據(jù)子峰的個(gè)數(shù)可推測(cè)這群細(xì)胞大致經(jīng)歷了5次分裂(見圖1。小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞在LPS 刺激下B 淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖,配合PE 標(biāo)記的抗小鼠B220mAb 染色,通過流式細(xì)胞儀可針對(duì)單個(gè)核細(xì)胞中的B 細(xì)胞增殖進(jìn)行進(jìn)一步的分析,結(jié)果顯示B 細(xì)胞顯著增殖,表現(xiàn)為經(jīng)歷不同分裂周期的若干個(gè)細(xì)胞群(見圖2。圖1LPS 刺激的脾單個(gè)核細(xì)胞分裂增殖分析A 1未經(jīng)LPS 刺激的單個(gè)核細(xì)胞B 1經(jīng)LPS 刺激的單個(gè)核細(xì)胞CFSE

9、 標(biāo)記顯示細(xì)胞分裂周期(1-5圖2LPS 刺激72h 的B 細(xì)胞分裂增殖B220-PE mAb 標(biāo)記顯示B 淋巴細(xì)胞,CFSE 標(biāo)記顯示細(xì)胞分裂周期(1-53討論體外實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)細(xì)胞分裂增殖最為常用的方法是H 32胸腺嘧啶摻入法。這種方法客觀、精確、 特異性良好,因而被廣泛使用。但是該檢測(cè)方法所反應(yīng)的細(xì)胞增殖情況是一個(gè)細(xì)胞群分裂的總體水平,而單個(gè)細(xì)胞的分裂狀況則無法給出。例如,一群細(xì)胞總體分裂一次與這群細(xì)胞中三分之一的細(xì)胞分裂兩次,采用H 32胸腺嘧啶摻入法測(cè)定所得的結(jié)果是一樣的3。本文采用熒光染料CFSE 作為細(xì)胞標(biāo)記物,它能穩(wěn)定地存在于細(xì)胞核中且不會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡4。在細(xì)胞分裂增

10、殖過程中,標(biāo)記的CFSE 可平均分配到子代細(xì)胞中,使熒光在細(xì)胞分裂過程中被逐漸稀釋,因而熒光強(qiáng)度也逐漸減弱。本研究結(jié)果也證實(shí),未經(jīng)LPS 刺激的小鼠單個(gè)核細(xì)胞增殖緩慢,CFSE 熒光強(qiáng)度未見明顯變化;經(jīng)LPS 刺激的細(xì)胞增殖旺盛,其平均熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞的分裂而(下轉(zhuǎn)第35頁Ts表達(dá)主要有T2、T4、T5、T7,而SHI21細(xì)胞主要表達(dá)有T1、T2、T3、T4。但兩者相比較,pp G alNAc2Ts表達(dá)水平有一定差異,而表達(dá)種類則明顯不同。糖生物學(xué)研究已揭示,O2聚糖合成起始反應(yīng)中T1、T2、T3催化第一個(gè)UDP2G alNAc2Ts的轉(zhuǎn)移反應(yīng),次后才可由T4、T7等催化后續(xù)的UDP2G al

11、NAc2Ts轉(zhuǎn)移。故本實(shí)驗(yàn)揭示在第一個(gè)UDP2G alNAc2Ts轉(zhuǎn)移反應(yīng)中,兩種細(xì)胞有不同,但后續(xù)反應(yīng)中則都以T4為主。K562和SHI21細(xì)胞株均表達(dá)0G nT、3G nT1、3G nT5、3G alT2,但表達(dá)量不同。K562細(xì)胞表達(dá)OG nT、3G nT1、3G nT5,其中OG nT、3G nT1表達(dá)量較3G nT5高。SHI21細(xì)胞表達(dá)OCnT、3G nT1、3G nT5,其中3G nT5表達(dá)量較OG nT、3G nT1高。至于糖基轉(zhuǎn)移酶在白血病細(xì)胞侵襲侵潤中的作用,將有待在以后的研究中探討。參考文獻(xiàn)1殷紅,陳子興,岑建農(nóng),等1三丁酸甘油酯對(duì)白血病細(xì)胞株SHI21體外作用的研究J.

12、中華血液學(xué)雜志,2004,25(11:66266512Schachter H,Brockhausen I.The biosynthesis of serine(threo2nine2N2acetylgalactosamine2linked carbohydrate m oietiesA.In:Allen H J,kisailus EC(eds.G lycoconyugate,com2position,S tructure and FunctionM1New Y ork,Basel,H ongkong:Marcel Deker Inc,1992.26333113陳惠黎.惡性腫瘤中糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的

13、改變A.見:陳惠黎主編.糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能M.第1版1上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997110610814Nishikawa A.Determination of N2acetylglucosaminytrans2ferase,andin normal and hepatoma tissue of ratsJBiocltim Biophys Acta,1990,1035:31313815Y ao M.E levated activity of N2acetylglucosammytrans ferasein human hepatocellular carcinomaJ1J cancer C

14、lin Oncol, 1998,124:273016Cuo H B.Relationship between metasis ass ociated phenotypesand N2giycan structure of sur face glycoproteins in human hep2 atocercinoma cellJ1Jcanoe Res Clin Oncol,2001,127:23123617李晟,陳子興,王瑋,等.明膠酶A在急性白血病細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義J1中華內(nèi)科雜志,2003,42(10:684687.(上接第23頁逐漸減弱。CFSE的這種特性在判斷細(xì)胞增殖時(shí)彌補(bǔ)了H

15、32胸腺嘧啶摻入法存在的缺陷,并且配合熒光標(biāo)記的單抗,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以更進(jìn)一步分析特定細(xì)胞群體的分裂增殖過程,估算細(xì)胞分裂周期5。本研究配合使用PE標(biāo)記的抗小鼠B220 mAb即證實(shí)了B淋巴細(xì)胞群發(fā)生顯著增殖。熒光染料CFSE是一種很有價(jià)值的細(xì)胞標(biāo)記物,不僅用于細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn),也可用于追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的分裂增殖過程。隨著對(duì)CFSE特性研究的深入,其應(yīng)用前景必定更為廣泛和深入。參考文獻(xiàn)1H oefel D,G rooby W L,M onis PT,et al.A com parative study ofcarboxy fluorescein diacetate and carboxy

16、 fluorescein diacetate succinimidyl ester as indicators of bacterial activityJ.J M i2crobiol Methods,2003,52:379388.2Angulo R,Fulcher DA.Measurement of Candida2specifc blas2togenesis:com paris on of carboxy fluorescein succinimidyl ester labelling of T cells,thymidine incorporation,and C D69ex2 pressionJ.Cytometry,1998,34:143151.3Ly ons AB,Parish CR.Determination of lym phocyte division byflow cytometryJ.J Immunol Methods,1994,171:131 137.4Dumitriu IE,M ohr W,K olow os W,et al.5,62carboxy fluo2rescein diacetate succinimidyl ester2labeled apoptotic andnecrotic as well as detergent2treated cell