1、 Gateway技術(shù)克隆、表達(dá)新方法 Gateway技術(shù)GatewayGateway技術(shù)：技術(shù)： 一種克隆操作平臺(tái)：把目的基因克隆到入門載體（Entry Vector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（Destination Vector，目的載體）上。Gateway技術(shù)特點(diǎn)： 通過(guò)去除冗長(zhǎng)的亞克隆步驟節(jié)省操作時(shí)間，同時(shí)將目的基因轉(zhuǎn)移到多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，在任何選擇的表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌，酵母，昆蟲，或哺乳動(dòng)物進(jìn)行基因的分析表達(dá)。 Gateway技術(shù)的靈活性：Gateway技術(shù)的原理 Gateway的原理也是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)

2、整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR。這是一個(gè)可逆的過(guò)程，如果在一個(gè)噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導(dǎo)下這兩個(gè)新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB和attP位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來(lái)。這一過(guò)程的方向是受控于兩個(gè)重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。 n整合后的附著位點(diǎn)為整合后的附著位點(diǎn)為n attL（BOP）n attR（POB）n整合位點(diǎn)整合位點(diǎn)-attB attP 切除位

3、點(diǎn)切除位點(diǎn)-attL attRn整合過(guò)程需要整合過(guò)程需要Int和和IHF共同作用共同作用 attB x attP attL x attR 完成構(gòu)建Gateway表達(dá)克隆僅需兩步（1）創(chuàng)建入門克隆,通過(guò)PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門載體。（2）混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體以及Gateway LR Clonase酶，構(gòu)建表達(dá)克隆 BP和LR反應(yīng)示意圖BP反應(yīng)LR反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn):入門載體的構(gòu)建（1）限制性內(nèi)切酶消化和連接進(jìn)入入門載體（2）PCR克隆（定向TOPO克隆至入門載體或與供載體BP重組）PCR定向TOPO克隆PCR定向TOPO克隆流程一：實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1：

4、認(rèn)真閱讀INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL 2;在實(shí)驗(yàn)操作前，先要確保你的基因使用高保真的Taq酶克隆經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，裝入T載體中 3:入門載體質(zhì)粒和目標(biāo)表達(dá)載體質(zhì)粒的抽提。質(zhì)粒的濃度要求比較高，150ng/ul.4:引物設(shè)計(jì)。根據(jù)入門載體序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)通用引物 和含部分接頭的基因特異性引物 引物設(shè)計(jì)：1通用引物 ：attB1 adapter: 5-GGGGACA AGT TTGTACAAA AAAGCAGGCT -3attB2 adapter: 5-GGGGAC CACTTTGTACAAGAA AGCTGGGT -32含部分接頭的基因特異性引物 ：attB1+gene for

5、ward: 5-AA AAA GCA GGC TNN - template-specific sequences-3attB2+gene reverse: 5-A GAA AGC TGG GTN - template-specific sequences-3BP重組裝入入門載體1:添加attB接頭的PCR 以攜帶目的基因質(zhì)粒為模板 ，加含部分接頭的基 因特異性引物,進(jìn)行第一輪PCR2 :取第一輪的PCR產(chǎn)物做模板，加入通用引物，進(jìn)行第二輪3：PCR產(chǎn)物的純化4：BP重組反應(yīng)BP重組反應(yīng)Components Sample attB-PCR product （10ng） 1-7ulpENTR ve

6、ctor (150 ng/ul) 1ul 5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul TE Buffer, pH 8.0 to 10ul 25溫浴1-16h。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可有效增加克隆，但時(shí)間不宜超過(guò)18h ,終止反應(yīng)后，最后取1-5ul BP反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR或驗(yàn)證，然后抽提質(zhì)粒 ，酶切驗(yàn)證。 LR重組裝入表達(dá)載體 根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，了解自己將要裝入的載體的結(jié)構(gòu)，原核表達(dá)，超 表達(dá)，抑制表達(dá)、特異表達(dá)、GUS/GFP表達(dá)等載體，LR重組反應(yīng) Components Sample Entry clone （50-150ng） 1-7 u

7、lDestination vector (150 ng/ul) 1 ul 5X LR Clonase enzyme mix 2 ul TE Buffer, pH 8.0 to 10 ul 25溫浴1-16h。終止反應(yīng)后，最后取1-5ul BP反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌 挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR或驗(yàn)證，然后抽提質(zhì)粒 ，酶切驗(yàn)證。 Gateway技術(shù)的評(píng)價(jià) 一旦構(gòu)建好Gateway入門克隆，蛋白表達(dá)和分析的大門就會(huì)向您敞開。使用Gateway技術(shù)，您可以進(jìn)入到幾乎是無(wú)數(shù)種的表達(dá)系統(tǒng)。因?yàn)闆](méi)有一個(gè)單一的表達(dá)系統(tǒng)適合于每一種蛋白，優(yōu)化基因表達(dá)的最好方法是在多個(gè)系統(tǒng)中分析您的蛋白 Invitrogen 已將Gateway技術(shù)合并到部分最高級(jí)的表達(dá)系統(tǒng)中。無(wú)論選