1、大劑量甲氨蝶呤治療兒童急性淋巴細胞白血病         【關鍵詞】  甲氨蝶呤 兒童 急性 淋巴細胞 白血病自從1948年Farber等首次報道甲氨蝶呤前體氨蝶呤可以使急性白血病患兒得到緩解以來，以此為基礎的化療方案應運而生。甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）成為目前應用于白血病、淋巴瘤、頭頸部腫瘤、骨肉瘤以及多種自身免疫性疾病最為廣泛的一種抗代謝藥物，尤其是大劑量甲氨蝶呤（HDMTX）的應用對降低兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）髓外白血病的發(fā)生，提高總體無病生存率起到了重要作用，其療效得到了

2、充分的肯定。1  甲氨蝶呤的作用機制   甲氨蝶呤（MTX）是一種抗葉酸代謝的抗腫瘤藥，其結構與葉酸類似，通過競爭性的抑制細胞中二氫葉酸還原酶（DHFR）的活性，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，與DHFR 有高度的親和力。MTX的作用強度直接依賴于其細胞內濃度、分布和停留時間，其進入細胞的速度受到細胞膜上的還原葉酸鹽載體（RFC）控制1。也有報道稱MTX的次級轉運受到膜聯(lián)葉酸受體調控2。當細胞膜外濃度超過20 mol/L時，也可通過被動擴散方式進入細胞內，發(fā)揮很強的抗白血病作用。   進入細胞內的MTX在多聚谷氨酸鹽合成酶（FPGS）的作用下，谷氨

3、酸殘基再逐個連接上谷氨酸，形成甲氨蝶呤多聚谷氨酸（MTXPG），MTX及MTXPG競爭性抑制DHFR活性，使四氫葉酸產(chǎn)生受阻，一碳單位形成減少，影響核酸和蛋白質的合成。細胞內MTXPG的聚集量和鏈長度是發(fā)生細胞毒性作用的主要因素。另外，作為合成胸苷和嘌呤的必不可少的輔助因子，N5N10亞甲基四氫葉酸和N10甲酰四氫葉酸相應減少，從而抑制了DNA復制導致細胞死亡3。   甘氨酰胺核苷酸轉甲酰酶（GAR）、氨基咪唑甲酰胺轉甲酰酶（AICAR），以及參與嘌呤合成的酶、用于轉運的葉酸和聚谷氨酸也都可以被MTXPG所抑制。所以，甲氨蝶呤通過多種途徑抑制DNA的生物合成，主要作用機制在

4、于MTXPG的產(chǎn)生，包括間接減少葉酸供給和直接抑制依賴于葉酸的酶。   當使用HDMTX使其細胞內濃度達到10 mol/L以上時，便可以抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷DNA 合成中脫氧尿嘧啶核苷轉變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑?，同時也可阻止嘌呤核苷的合成，故也干擾RNA 和蛋白質合成，從而發(fā)揮抗白血病細胞的作用。MTX的半衰期為23 h，在人體內基本不代謝，主要經(jīng)過腎臟排泄，90%在用藥48 h后以原形經(jīng)尿液排出。2  HDMTX在兒童ALL治療中的應用    目前兒童ALL化療后的完全緩解率提升至90%以上，5年持續(xù)完全緩解率達70%80%以

5、上，其中最重要的原因之一在于化療方案的改進。在兒童ALL的化療方案中，MTX的劑量適用范圍波動于208 000 mg/m2之間。1994年Synold等4隨機給予患兒持續(xù)靜脈滴注HDMTX和分次口服低劑量MTX，并檢測其骨髓細胞內MTX和MTXPG濃度，發(fā)現(xiàn)白血病細胞內MTXPG濃度與MTX劑量成正相關，為HDMTX廣泛應用于兒童ALL提供了理論依據(jù)。Freeman等5通過臨床試驗表明應用HDMTX治療的ALL患兒的復發(fā)率較標準劑量治療患兒明顯減少。Evans等6也證實MTX血藥濃度與疾病持續(xù)緩解之間的相關性，MTX平均血藥濃度持續(xù)維持在16 mol/L水平的患兒持續(xù)緩解的可能性更大，HDMT

6、X在ALL的治療中存在濃度與效應的關系。St. Jude 方案7和ALLBFM90方案8也通過HDMTX鞏固治療證實其可以提高BALL 5年疾病無病生存率。Peiter等9在TALL患兒中得到了相同的結論。說明HDMTX在兒童ALL的治療和長期生存中起著重要的作用。   中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸、眼眶等部位是常規(guī)劑量化療藥物不能達到有效殺傷濃度的盲區(qū)，而這些部位也是髓外復發(fā)的高發(fā)部位，故常規(guī)預防髓外白血病是ALL治療成功的關鍵之一。既往采用全顱腦、脊髓放療雖能有效預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，但可并發(fā)認知缺陷、腦白質病、遠期第二腫瘤和內分泌異常等副作用。HDMTX的應用可以明顯提高上述

7、部位的藥物濃度，目前的治療中已盡量減少顱腦放療或不用放療，或用三聯(lián)鞘內注射和HDMTX化療取代放療。目前美國St.Jude兒童研究醫(yī)院正嘗試除復發(fā)者外取消對所有患兒的放療，采用三聯(lián)鞘內注射聯(lián)合HDMTX化療成為預防CNS白血病的主要方法。   文獻報道，當持續(xù)滴注MTX1 g/m2時，腦脊液中MTX濃度可超過10-7 mol/L，此濃度即可以抑制腦脊液中白血病細胞DNA合成，同時如果劑量增加至5.0 g/m2可以替代顱腦放療10。另外，實驗觀察到，當使用1 g/m2劑量，靜脈注射1/3 量后15 min，血漿MTX 濃度可達100 mol/L，23 h 在1037 mol/

8、L，這一濃度可使MTX 穿透血腦、血眼及血睪屏障，殺傷白血病細胞，從而達到防治CNSL的目的11。使用MTX 0.5 g/m2時，腦脊液（CSF）幾乎不能達到0.1 mol/L的細胞毒性濃度12，而3.07.5 g/m2方案，CSF濃度可以達到1 mol/L13 ，33.6 g/m2方案可達10 mol/L14，故通常以MTX 15 g/m2作為HDMTX治療ALL的安全劑量。HDMTX之所以能達到有效地預防髓外白血病的目的，是因為MTX的高水平血藥濃度及有效濃度所維持的時間與MTX的抗白血病強度呈正相關，持續(xù)靜脈滴注可以保持MTX的血藥濃度，使其在細胞內形成高水平的MTXPG，起到強烈的抗白

9、血病作用，故絕大多數(shù)國際先進的兒童ALL治療中心采用連續(xù)24 h靜脈滴注方案。HDMTX治療后24 h的血藥濃度可預測療效，而46 h及70 h后的血藥濃度反映MTX在體內的排泄情況，46 h和70 h后的MTX血藥濃度分別大于0.25 mol/L和大于0.1 mol/L稱為排泄延遲。北京兒童醫(yī)院15比較了連續(xù)6 h與24 h靜脈滴注MTX兩組患兒，結果MTX毒副反應和排泄延遲發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義。浙江大學兒童醫(yī)院16報道MTX 5 g/m2與3 g/m2比較排泄延遲率無明顯增加。故在嚴密監(jiān)測MTX濃度下，MTX 5 g/m2劑量，24 h靜脈滴注治療可以安全進行。  

10、兒童ALL是具有高度異質性的腫瘤性疾病，治療前進行準確的分型和預后分組，制定個體化治療方案是提高患兒長期生存，降低治療相關性毒副作用的重要保障。不同亞型的兒童ALL白血病細胞內的MTX及其形成的MTXPG的蓄積濃度和葉酸代謝途徑的基因表達水平不同，故根據(jù)不同亞型ALL MTXPG的細胞蓄積濃度調整MTX的治療劑量和化療組別，可初步做到個體化治療，并顯著提高兒童ALL的治療效果。Kager等17應用低聚核苷酸微陣列技術研究了葉酸代謝途徑相關基因mRNA表達水平與ALL亞型之間的關系，發(fā)現(xiàn)在超二倍體BALL、TALL、TELAML1和E2APBX1融合基因陽性的BALL中，還原葉酸載體（RFC）、

11、多藥耐藥相關蛋白14（MRP14或ABCC14）、ABCG2轉運體、多聚谷氨酸鹽合成酶（FPGS）等基因表達的水平存在明顯差異，為實施根據(jù)藥物基因組學、藥代動力學進行個體化治療提供了依據(jù)。TALL細胞中FPGS低水平表達，而ABCC1呈高水平表達，ABCC1表達多藥耐藥相關蛋白1，介導MTX泵出細胞外，故可解釋TALL細胞內MTXPG蓄積降低，并可能導致MTX的耐藥。臨床研究也證明TALL要達到MTXPG 95%飽和所需的濃度為48 mol/L，而BALL約34 mol/L18，因此TALL要達到最佳療效需要更大劑量的MTX（通常5 g/m2）。實踐證明MTX 3 g/m2及5 g/m2的劑量

12、能達到標危和高危白血病細胞MTXPG飽和所需穩(wěn)態(tài)血濃度。在超二倍體BALL，介導MTX進入細胞內的跨膜蛋白RFC基因呈高水平表達，可以解釋在超二倍體或DNA指數(shù)大于1.16的BALL中，MTXPG的濃度高于其他BALL，且與5年EFS呈正相關。在TELAML1融合基因陽性的BALL細胞中高水平表達ABCG2基因，ABCG2介導MTX和MTXPG泵出細胞外，而FPGS表達水平降低。E2APBX1融合基因陽性的BALL細胞 RFC基因表達水平減低，故伴有TELAML1和E2APBX1融合基因的ALL細胞內MTXPG的濃度低于其他基因異常者，增加MTX的劑量也可提高療效。在St. Jude XI和A

13、LLBFM 90方案中，E2APBX1融合基因陽性者均包含HDMTX（5 g/m2）在內的鞏固治療，E2APBX1融合基因陽性BALL的5年 EFS分別為89.5%和93%左右7，8。   有關ALL復發(fā)患兒HDMTX的治療效果，Arend等19進行了最新的臨床試驗，269例復發(fā)的B前體ALL患兒（不包括診斷后18月以內復發(fā)者）隨機接受中劑量（1 g/m2，持續(xù)36 h）和大劑量（5 g/m2，持續(xù)24 h）46周期化療。結果表明中劑量和大劑量MTX治療組之間在10年無病生存率方面無明顯差異（P=0.919），大劑量MTX較之中劑量MTX在治療該類復發(fā)患兒中并沒有顯示出優(yōu)越

14、性，故ALLREZ BFM 臨床試驗選擇MTX 1 g/m2持續(xù)滴注36 h為標準治療方案。         3  HDMTX毒性反應及其防范策略   MTX主要作用于S期，對處于對數(shù)增殖期的細胞作用最強，由于MTX作用的非靶向性，HDMTX在發(fā)揮良好抗腫瘤作用的同時，對所有快速分裂的正常細胞將產(chǎn)生嚴重的毒副作用，對多器官系統(tǒng)造成嚴重損害。MTX不良反應的發(fā)生率和嚴重程度直接取決于MTX血藥濃度的高低和持續(xù)時間的長短。HDMTX的主要毒副反應有皮膚粘膜反應、肝腎功能損害、骨髓抑制等。使

15、用HDMTX可以造成較為明顯的皮膚粘膜損害，主要表現(xiàn)為口腔和肛周皮膚潰瘍，如果合并骨髓抑制和嚴重感染，死亡常不可避免。Cheng KKF等20研究HDMTX相關口腔炎的危險因素，發(fā)現(xiàn)口腔炎與使用MTX后66 h的血藥濃度0.2 mol/L及患兒惡心、嘔吐程度2（WHO分級）相關，與肝功能ALT/AST58 U/L及中性粒細胞絕對值1.0×109/L關系不明確，這可能與頻繁嘔吐導致電解質紊亂和減少小便的排泄有關，與臨床上MTX嚴重毒性反應多見于嘔吐頻繁、電解質紊亂、進食少的患兒相符合。   由于MTX主要經(jīng)過腎臟排泄，在酸性條件下易于在腎小管內形成結晶，阻塞腎小管，

16、影響腎臟功能21 。Marika H等22對接受HDMTX治療的25例ALL患兒的腎臟功能隨訪了110年（中位時間6年），發(fā)現(xiàn)隨著隨訪時間延長，腎小球濾過率（GFR）明顯降低（P=0.02），初診年齡和治療中使用有腎毒性的抗生素對GFR沒有影響，但使用兩性霉素B和慶大霉素的患兒更易發(fā)生蛋白尿（P=0.04）。   臨床上可以通過充分水化、利尿、堿化尿液、保持雙通道靜脈滴注、監(jiān)測血藥濃度、合理使用四氫葉酸鈣解救和加強口腔、肛門的護理等措施，降低HDMTX的毒性作用。骨髓抑制是較為嚴重的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為中性粒細胞和血小板的減少，從而可能出現(xiàn)嚴重感染及出血。另外，長期使用大

17、劑量甲氨蝶呤可以引起藥物性肝炎、轉氨酶升高、膽汁淤積型黃疸、凝血功能障礙等。這些損害通常在停藥后即可恢復正常，或是輔以保肝治療、四氫葉酸鈣解救等方式均可以有所減輕。   上世紀60年代中期，四氫葉酸（CF）解救原理的發(fā)現(xiàn)使得HDMTX在惡性腫瘤中的應用得到推廣。CF進入人體后轉化為亞甲基四氫葉酸和N甲酰四氫葉酸，參與胸腺嘧啶核苷酸及嘌呤的生物合成，從旁路越過MTX所阻斷的代謝途徑而起到解救作用。CF在降低HDMTX不良反應的同時，還可增加機體對HDMTX的耐受性，但在一定程度上也解救了腫瘤細胞，因此，CF 解救原則應遵循最大量地殺傷腫瘤細胞而不產(chǎn)生致命的不良反應，不會因此影

18、響下一療程的化療，還要考慮到長期生存的關系。研究認為CF的解救劑量不應超過MTX總量的10%，最理想為MTX的2%3%，目前建議在滴注MTX 3642 h后實行CF解救，劑量為15 mg/m2，每6 h一次，共解救68次，解救時間通常延續(xù)到血藥濃度0.1 mol/L。   藥物靜脈滴注即將結束前的血藥濃度稱為穩(wěn)態(tài)血藥濃度，即MTX結束0 h濃度，直接反映MTX的療效。而48 h和72 h 血藥濃度反映MTX在體內排泄情況。目前公認的MTX中毒血藥濃度為給藥后24 h10.0 mol/L，48 h1.0 mol/L，72 h0.1 mol/L。一般認為給藥后24 h血藥濃度5

19、.0 mol/L，48 h0.5 mol/L較少發(fā)生不良反應23。由于HDMTX在人體內的吸收、分布、生物轉化和排泄等存在很大的個體差異，故不同個體間HDMTX的毒副反應差異很大，而個體發(fā)生MTX毒性反應及其嚴重程度目前尚難預測。因此監(jiān)測MTX的血藥濃度，盡早發(fā)現(xiàn)血漿清除緩慢的患兒，并根據(jù)血藥濃度及時調整CF劑量及解救次數(shù)對于防范HDMTX的毒性反應和提高治療的安全性起著關鍵作用。【參考文獻】  1 Westerhof GR, Rijnboutt S, Schornagel JH, et al. Functional activity of the reduced folate ca

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