1、HBV變異對乙肝病毒標(biāo)志物和DNA定量的影響    nbsp;nbsp;摘nbsp;nbsp;要nbsp;nbsp;目的：nbsp;了解無錫地區(qū)HBV前CC基因變異情況,探討基因變異對乙肝病毒標(biāo)志物(HBVM)及HBVnbsp;DNA定量的影響。方法：nbsp;HBVM用時間分辨熒光定量試劑檢測;HBVnbsp;DNA定量PCR以德國Rochenbsp;Lightcyclernbsp;熒光定     奚華新， 蔣躍明   江蘇大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)    摘  要

2、60; 目的： 了解無錫地區(qū)HBV前CC基因變異情況,探討基因變異對乙肝病毒標(biāo)志物(HBVM)及HBV DNA定量的影響。方法： HBVM用時間分辨熒光定量試劑檢測;HBV DNA定量PCR以德國Roche Lightcycler 熒光定量擴增儀檢測;HBV DNA前CC測序使用 德國Roche Mag NA Pure LC 全自動核酸提取，加樣系統(tǒng); 美國Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。結(jié)果： 92例乙肝患者血清中有41例(446)發(fā)生前CC區(qū)nt1896位變異,41例中有34例HbeAg陰性,7例HbeAg仍為陽性;以nt1

3、896位是否變異分組,變異組和未變異組HBV DNA定量無顯著性差異。結(jié)論： nt1896位變異導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)陰,HBV病毒變異對HBVM有決定性的影響,但該變異對HBV復(fù)制無影響。        關(guān)鍵詞  DNA序列分析; 基因變異; HBVM DNA定量         Affection of Gene Mutation to Serological Markers     &#

4、160;  and Quantity of DNA of Hepatitis B Virus        XI Huaxin, JIANG Yueming        (1.The Blood Center of Wuxi,Wuxi Jiangsu 214021; 2.Wuxi Hospital for Infectious Disease,Wuxi Jiangsu 214007, China)    

5、    Abstract  Objective: To report HBV preCCgene mutation in wuxi area,to determine the affection of gene mutation to serological markers and quantity of DNA hepatitis B virus.Methods： Serological markers of hepatitis B virus were detected by timeresolved fluorescence immunoassay

6、. Quantitative analysis of HBV DNA PCR was performed by Roche Lightcycler fluoresencent quantitative amplification analyzer which made in Germany. HBV DNA preCCgene fragments were directly sequenced by Roche MagNA Pure LC automatic nucleic acid getting, sampling system made in Germany and Beckman Co

7、ulteCEQ8000Genetic Analysis System made in the U.S. Results： Fortyone from nintytwo(4192)patients had preCCgene mutation at site at nt1896.there thirtyfour HBeAg were negative and seven HBeAg were positive.Gene mutation at site at nt1896 didnt affect virus replication. Conclusion： How HBeAg getting

8、negative was dependant on nt1896 site gene mutation.Gene mutation at site at nt1896 didnt affect hepatitis B virus replication.        Key words  DNAgene fragments analysis;Gene mutation;Serological markers of hepatitis B virus;Quantitative analysis of HBV DNA

9、        HBV感染在臨床可產(chǎn)生不同的肝臟疾病譜,過去多以HBV免疫學(xué)標(biāo)志物來判斷病毒感染狀況1。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)肝臟疾病譜不僅與宿主的免疫有關(guān),也與病毒本身密切相關(guān),即HBV 本身也存在變異。對HBV變異的判斷,最可靠和精確的方法是從病人體內(nèi)檢出HBV DNA,用DNA測序法來確定病毒的變異,目前對于HBV的變異的研究比較集中在關(guān)于前C區(qū)及S基因區(qū)的變異。本文結(jié)合92例乙肝患者的PCR定量、免疫學(xué)標(biāo)志物定量結(jié)果以及DNA前CC區(qū)測序結(jié)果報道如下。    &#

10、160;   1  材料與方法        11  分析對象        本組92例為無錫地區(qū)2004年1月10月在無錫市傳染病醫(yī)院門診及住院的乙肝患者,均為HBVDNA陽性病人。        12  檢測方法        121  乙肝病毒標(biāo)志HBs

11、Ag、抗HBs、HBeAg、抗Hbe和抗HBc以美國PE1235automatic immunoassay system 檢測,試劑為上海新波產(chǎn)的兩對半時間分辨熒光定量試劑。        122  定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)HBV DNA定量PCR  以德國Roche Lightcycler熒光定量擴增儀檢測,試劑為深圳匹基產(chǎn)HBV DNA熒光定量試劑。        123  HBV DNA前CC區(qū)測序  使用

12、德國Roche MagNA Pure LC全自動核酸提取、加樣系統(tǒng),獲得HBV DNA模板; 在美國PE9600擴增儀擴增:94預(yù)變性3 min,94 30 s,50 30 s,72 30 s,循環(huán)35次; 用Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物; 純化產(chǎn)物用Beckman測序試劑盒進行測序反應(yīng):96 20 s,55 20 s,604 min,循環(huán)30次,終止測序反應(yīng),然后在美國Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA 的序列和圖譜。所測HBV DNA序列的堿基位置:nt17372483,所測長度:74

13、6 bp,上游引物序列及位置:5GAGTTGGGGGAGATTAG3(17371756),下游引物序列及位置:5AAAGTTTCCCACCTTATGAGTC3(24832462);引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。        124  統(tǒng)計學(xué)處理  采用t檢驗和2檢驗。        2  結(jié)  果        21序列結(jié)果 

14、       序列結(jié)果見表1。表1  主要前CC區(qū)基因變異位置與意義        22  1896位圖譜        1896位正常圖譜見圖1,突變圖譜見圖2。        23  HBVM與1896位變異        H

15、BVM與1896位變異結(jié)果比較見表2。        24  1896位變異與e抗原相關(guān)性        1896位變異與e抗原相關(guān)性見表3,經(jīng)過2檢驗P<0005,e抗原的表達與1896位變異密切相關(guān),也就說明e抗原轉(zhuǎn)陰主要是由1896位變異引起的。        25  變異與病毒復(fù)制      &

16、#160; 以nt1896變異分組,兩組病毒DNA定量見表4,差異無顯著性(P>005)。說明該變異不影響病毒復(fù)制。        3  討  論        表1中HBV DNA 1827位ntca突變達88, 表2  HBVM與1896位變異表3  1896位變異與e抗原相關(guān)性表4  病毒與DNA定量相關(guān)性基本體現(xiàn)無錫地區(qū)HBV DNA單核苷酸多態(tài)性突變水平,意義目前不詳。1896位ntga突變

17、達446(4192),據(jù)國外報道,這種變異大多發(fā)生在亞洲東部及南歐地區(qū),發(fā)生率可以高達4760,而在美國只有10左右,胡耀仁等2報道寧波乙肝患者1896位變異率為4258,本文結(jié)果與報道相近。由于1896位ntca突變(鳥嘌呤腺嘌呤),使原來編碼色氨酸的前C區(qū)第28個密碼子(TGG)轉(zhuǎn)變?yōu)榉g終止密碼子(TAG),因而前C蛋白的翻譯中斷,HBeAg不能產(chǎn)生,檢測會出現(xiàn)陰性結(jié)果,從表3中可見,與變異有關(guān)HBeAg轉(zhuǎn)陰有34例,從而證實1896位變異與HBeAg轉(zhuǎn)陰具有密切相關(guān)性。2005位ntta突變和2074位nttc突變因為是密碼子的第三堿基發(fā)生突變,翻譯的氨基酸仍是原來的氨基酸,屬同義突變

18、。        圖譜分析是測序儀利用4種熒光染料分別標(biāo)記終止物ddNTP,通過電泳將各個熒光標(biāo)記片段分開,經(jīng)激光掃描,光柵分光,區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,在 CCD攝影機上同步成像。圖1顯示1896位正常為G,圖2顯示1896位發(fā)生突變?yōu)锳。        從表3可以看出(由表2中統(tǒng)計而來),1896位變異組共有41例,其中34例e抗原陰性,說明與1896位變異有密切關(guān)系(P<0005);有7例e抗原仍為陽性,可能與體內(nèi)仍存在野生株復(fù)制

19、的情況有關(guān)。在51例1896位未變異一組,其中13例e抗原陰性,而HBV DNA定量顯示有病毒的復(fù)制,與理論結(jié)果不符,原因可能與其他位點變異有關(guān)。        從表4中可以看出以nt1896位變異分組,兩組病毒DNA定量無顯著性差異(P>005),說明1896位變異會導(dǎo)致HBeAg不能產(chǎn)生,檢查陰性結(jié)果,但不能反映HBV復(fù)制減輕和消失,而仍有HBV前C區(qū)變異病毒的存在和復(fù)制,結(jié)論與文獻相符3。        李伯安等4認為單獨的血清學(xué)標(biāo)志檢測不能反映肝臟的病變程度,也不能良好反映病毒的復(fù)制。        臨床上對不同肝臟疾病譜的認識,有必要結(jié)合二對半結(jié)果和PCR DNA定量以及基因測序結(jié)果,才會對乙肝病毒的感染狀況有一個比較準確的判斷,才能對癥治療,取得較好的治療效果。由于前CC區(qū)1896位的變異,導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)陰,不能就此而否定病毒的復(fù)制。        測序結(jié)果表明,HBV病毒基因變異對HBVM結(jié)果產(chǎn)生根本性的影響,它們是基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系,即基因型決定表現(xiàn)型,但病毒復(fù)制繼續(xù)進行。