1、科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)題目 動物細(xì)胞融合日期2013.03.07姓名十 系年級 2011級生物基地 學(xué)號 土實(shí)驗(yàn)一利用聚乙二醇為媒介物進(jìn)行細(xì)胞融合摘要細(xì)胞融合(cell fusion)是在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細(xì)胞?；具^程包括細(xì)胞融合形成異核體 (heterokaryon)、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的雜種細(xì) 胞。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種：生物方法(病毒)、化學(xué)方法(聚乙二醇PEG、 物理方法(離心，震動，電刺激)。某些病毒如：仙臺病毒、副流感病毒和新城 雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白(fusion protein、，可介導(dǎo)病毒同宿

2、主細(xì)胞融合， 也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。 化學(xué)和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中便可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合。關(guān)鍵詞細(xì)胞融合；人工誘導(dǎo)；PEG刖言人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不 僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣 泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。 基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì) 胞稱為同核體(homokaryon );來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體(heterokaryon )。細(xì)胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究，而且

3、還有重要的應(yīng)用價值，在植物育種方面 已經(jīng)成功的有蘿卜+甘藍(lán)、粉藍(lán)煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細(xì)胞融合另 一個重要應(yīng)用就是制備單克隆抗體， 單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和 運(yùn)載藥物，具有準(zhǔn)確，高效，簡易，快速等優(yōu)點(diǎn)。因此，融合細(xì)胞的研究為生物 學(xué)無論在基礎(chǔ)理論上或生產(chǎn)實(shí)踐上開辟了一條新的道路。這一技術(shù)已成為研究細(xì) 胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解動物細(xì)胞融合的常用方法及原理。2. 掌握利用PEG為介導(dǎo)物對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)融合的方法。3. 觀察動物細(xì)胞融和過程中細(xì)胞的行為和變化。二. 實(shí)驗(yàn)原理化學(xué)融合劑聚乙二醇（polyethylene glyc

4、ol, PEG是乙二醇的多聚化合物，是存 在一系列不同分子量的多聚體。PE柯誘導(dǎo)細(xì)胞間的融合，主要有兩方面的原因： 第一，PE師以破壞和干擾各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜 脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散， 進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排， 再加上膜脂雙層的相互親 合以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時相互合并在一起 , 使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通 ,從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。第二，PEG 可與水分子借氫鍵結(jié)合，在高濃度的 PEG 溶液中自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生 質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，引起細(xì)胞融合。為了發(fā)揮 PEG 促進(jìn)細(xì)胞融合的效力，必須采 用較高濃度的 PEG 溶液，但在高濃度

5、 PEG 溶液下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著 的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是 PEG 融合技術(shù)的關(guān)鍵。利用PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合，其融合效果受以下幾個因素的影響：1. PEG勺分子量：細(xì)胞融合效果與PEG勺分子量成正比，但PEG勺分子量越大， 對細(xì)胞的毒性就越大。在實(shí)驗(yàn)時常常采用的 PEG子量一般為8001000。2. PEG勺濃度：細(xì)胞融合效果與PEG勺濃度成正比，但PEG勺濃度越高，對細(xì)胞 的毒性就越大。在實(shí)驗(yàn)時常常采用的 PEGS度一般為4060%。3. PEG勺pH值：經(jīng)驗(yàn)證，PEG勺pH值在8.08.2之間融合效果最好。4. PEG勺處理時間：處理時間越長，融合效果越好，

6、但對細(xì)胞的毒害也就越大。 故一般將處理時間限制在 15分鐘。5. 融合時的溫度：由于生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也 與溫度成正比。為了獲得更好的融合效果 ,在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng) 提高處理的溫度。對于哺乳動物的細(xì)，一般采用的溫度為3840 C。本實(shí)驗(yàn)所用 材料為雞的血細(xì)胞，這是因?yàn)?:1）.雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對融合細(xì)胞進(jìn)行鑒 別；2）.實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得。細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn) 行鑒別。細(xì)胞內(nèi)只有一個核，為未融合細(xì)胞；有二個至多個核，為融合細(xì)胞。三 實(shí)驗(yàn)材料1. 材料用 Alsever 液懸浮的雞血紅細(xì)胞2. 器材 普通光學(xué)顯微鏡、離心機(jī)、

7、離心管、滴管、載玻片、蓋玻片。3. 試劑Alsever 液（pH7.4）、0.85%生理鹽水、GKN 液、50% PEG四 實(shí)驗(yàn)步驟1. 取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液（4°C下保 存）。（已由老師完成）2. 取上步中所得懸液 1ml+4ml 0.85%的 NaCl 溶液，進(jìn)行以下離心處理：1200r/min 離心 5min。3. 將上步的沉降血球（去上清液后，約 0.1-0.2ml）,加入GKN液至1-2ml,使 之成10%勺細(xì)胞懸液。4. 取上述10%勺血球懸液1ml,加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000000個， 即

8、1.5X 107個/ml。5. 取步驟4中所得懸液，按以下三種方式進(jìn)行混勻，滴片，2-3min后觀察：（1）1ml+0.5ml 50%的PEG液（這一管標(biāo)記為1號）（2）0.5ml+0.5ml 50%的 PEG液 （這一管標(biāo)記為 2 號）；（3）0.5ml+1ml 50%的 PEG液 （這一管標(biāo)記為 3 號）。觀察在不同PEG液濃度下的細(xì)胞融合情況，并說明，細(xì)胞融合率是否隨著PEG 液濃度的升高而逐漸提高。五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 細(xì)胞融合觀察:初步相接範(fàn)為一體發(fā)生變形2. 不同PEG濃度下，細(xì)胞融合率的比較：據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察比較：1ml+0.5ml 50%的PEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融合率與 0.5ml+0.5m

9、l 50%的PEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融合率都很低，而0.5ml+1ml 50%的PEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融合 率明顯高于前兩組。于是，可得出結(jié)論：在一定的 PEG濃度范圍內(nèi)，隨PEG濃度 的升高，細(xì)胞的融合率隨之升高。六. 結(jié)果分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，雞血紅細(xì)胞之間出現(xiàn)了不同程度的融合現(xiàn)象，并且隨著 PEG濃度的升高，融合率也隨之提高?？傮w來說融合率還是不錯的。主要原因如 為：PEG的分子量、濃度、與PH值較為適合誘導(dǎo)細(xì)胞的融合，與雞血紅細(xì)胞懸 濁液接觸時間適宜， 向混合液中吹氣泡，使PEG與雞血紅細(xì)胞充分接觸，以至 于達(dá)到了比較高的細(xì)胞融合率。由于PEG的作用，一些細(xì)胞發(fā)生變形，因?yàn)?PEG有凝集作用，紅細(xì)胞發(fā)

10、生 多細(xì)胞的凝集反應(yīng)。七. 注意事項1. 放置離心管的時候一定要對稱放置，這樣才能轉(zhuǎn)起來，保證不偏；2. 開啟離心機(jī)的時候一定要將蓋子蓋上，保證安全；3. 在制備雞血紅細(xì)胞時要反復(fù)離心洗滌制備的雞紅細(xì)胞液以清洗掉雜質(zhì)；4仔細(xì)標(biāo)記好試管，以免出錯；5. 鏡下觀察時要注意區(qū)分重疊細(xì)胞和融合細(xì)胞；6. PEG加到細(xì)胞懸液中2-3min后，用滴管向內(nèi)部吹氣，使PEG與細(xì)胞懸液均勻 混合，以達(dá)到比較高的融合率；7. PEG對細(xì)胞融合的作用效果與毒害作用隨著分子量的增加而增大，實(shí)驗(yàn)中由于不要求對融合的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)，可以選擇分子量較大的PEG本實(shí)驗(yàn)中PEG分子量為4000。8. PEG對細(xì)胞融合的作

11、用效果和毒害作用隨著濃度的增加而增大。在實(shí)驗(yàn)過程中一般采用40%-60%濃度的PEG溶液，PEG的濃度以50%為好。9. PEG的PH值應(yīng)控制在8.08.2之間。八. 實(shí)驗(yàn)心得通過本次實(shí)驗(yàn)，我懂得了聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理和方法， 并成功的完 成了實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞融合是生物學(xué)中一項基本的實(shí)驗(yàn)技能，是未來從事有關(guān)生物方面 的研究所必備的基本素養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，我體會到了其中的樂趣，也激發(fā)了我 對科學(xué)研究的熱情。上了這次實(shí)驗(yàn)課，我受益匪淺。PS:單克隆抗體的制備及應(yīng)用單克隆抗體的制備1、 免疫動物 免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按

12、照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。2、 細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟， 在平皿內(nèi)擠壓研磨， 制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。3、 選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成 DNA 而死亡。未融合的

13、淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。4、 雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單 克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免 疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后

14、，及時進(jìn)行凍存。5、 單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。(1) 體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射 0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。(2) 體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大 提高了抗體的生

15、產(chǎn)量。單克隆抗體的應(yīng)用1 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑作為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強(qiáng)、純度高、均一性好等優(yōu)點(diǎn)， 廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫分析、免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)。并且單克隆抗體的應(yīng)用，很大程度上促進(jìn)了商品化試劑盒的發(fā)展。目前，應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于： 病原微生物抗原、抗體的檢測； 腫瘤抗原的檢測； 免疫細(xì)胞及其亞群的的檢測； 激素測定； 細(xì)胞因子的測定。單克隆抗體對抗原的識別， 與多克隆抗體有很大的不同。 不同試劑盒因使用的單克隆抗 體不同，識別抗原的位點(diǎn)不同， 導(dǎo)致檢測結(jié)果有一定差異。因此， 標(biāo)準(zhǔn)化問題還需要進(jìn)一步 研究。2 蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)(如 Speharose 2B、4B、6B等)上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原可 與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后， 改變洗脫