1、SILACSILAC研討蛋白質相互作用研討蛋白質相互作用 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-1663SILACSILAC研討蛋白質相互作用研討蛋白質相互作用o1 1：SILACSILAC定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理o2 2：SILACSILAC研討蛋白質相互作用原理研討蛋白質相互作用原理o3 3：SILACSILAC研討蛋白質相互作用文獻研討蛋白質相互作用文獻 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16631 1：SILACSILAC定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理o1.11.1：SILACSILAC定量蛋白質組學的原理定量蛋白質組學的原

2、理o1.21.2：SILACSILAC技術流程技術流程o 1.2.11.2.1：培育基預備：培育基預備o 1.2.21.2.2：細胞標志與測試：細胞標志與測試o 1.2.3: 1.2.3: 實驗處置實驗處置o 1.2.31.2.3：蛋白質分別與質譜分析：蛋白質分別與質譜分析o 1.2.41.2.4：結果方式：結果方式 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16631.11.1：SILACSILAC定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-1663簡介：簡介： SILACSILAC即細胞培育條件下穩(wěn)定同位素標志技術，在細胞

3、培育時，采即細胞培育條件下穩(wěn)定同位素標志技術，在細胞培育時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培育基進展細胞培育，細胞用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培育基進展細胞培育，細胞經傳代培育經傳代培育5-65-6代后，蛋白質將被同位素穩(wěn)定標志，等量混合標志的蛋代后，蛋白質將被同位素穩(wěn)定標志，等量混合標志的蛋白質后分別和質譜鑒定，根據(jù)一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積白質后分別和質譜鑒定，根據(jù)一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積比較進展相對定量和二級譜圖對肽段進展序列測定從而鑒定蛋白質。比較進展相對定量和二級譜圖對肽段進展序列測定從而鑒定蛋白質。技術優(yōu)勢：技術優(yōu)勢： 1 1：高通量，可同時鑒定并

4、定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質；：高通量，可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質； 2 2：定量準確，降低由于樣品制備不同而呵斥的實驗差別；：定量準確，降低由于樣品制備不同而呵斥的實驗差別； 3 3：線性定量范圍廣；：線性定量范圍廣； 4 4：靈敏度更高，蛋白質需求量明顯減少；：靈敏度更高，蛋白質需求量明顯減少； 5 5：標志采用的是體內標志技術，更接近樣品真實形狀。：標志采用的是體內標志技術，更接近樣品真實形狀。 SILAC法。 1、標志：在缺乏Lys和Arg的培育基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培育細胞，使蛋白質被標志成“中型

5、或“重型； 2、細胞處置，如藥物處置； 3、細胞裂解、提取蛋白質； 4、等量混合對照與處置組蛋白質、SDS-PAGE電泳、染色； 5、割取蛋白質條帶，胰蛋白酶消化，質譜分析。1.11.1：SILACSILAC定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理1.2.11.2.1：培育基預備：培育基預備資料：資料： 1 1：LysLys或和或和ArgArg缺陷型缺陷型16401640培育基，培育基， Lys Lys或和或和ArgArg缺陷缺陷型型DMEMDMEM培育基。培育基。 2 2：透析：透析FBSFBS。 3 3：穩(wěn)定同位素標志的：穩(wěn)定同位素標志的LysLys和和ArgArg。L-Lysine(13C6

6、), L-Lysine L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-(13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)15N4), L-Argi

7、nine(13C6,15N4)。培育基制備：培育基制備： 取相應量的穩(wěn)定同位素氨基酸取相應量的穩(wěn)定同位素氨基酸LysLys和和ArgArg各各50mg,50mg,添加到添加到500ml500ml培培育基中，同時添加血清普通是育基中，同時添加血清普通是10%10%和抗生素后，和抗生素后，0.22um0.22um濾膜過濾膜過濾，濾，4 4度保管備用。根據(jù)實驗的需求，可以配制度保管備用。根據(jù)實驗的需求，可以配制“中型和中型和“重型重型培育基。培育基。 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16631.2.21.2.2：細胞標志與測試：細胞標志與測試標志：標志： 普通細胞經過添加同

8、位素的培育基傳代培育普通細胞經過添加同位素的培育基傳代培育5-65-6代后，一天或代后，一天或2 2天傳代一次，細胞中蛋白質的天傳代一次，細胞中蛋白質的LysLys和和ArgArg將被同位素氨基酸取代。將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素添加了穩(wěn)定同位素“中或中或“重型的細胞與重型的細胞與“輕型細胞相比輕型細胞相比細胞生長速度能夠偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，細胞生長速度能夠偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在可以讓透析血清在PBSPBS里面透析，透析膜的孔徑普通為里面透析，透析膜的孔徑普通為10KDa.10KDa.標志測試：標志測試： 在進展正式實驗之前，

9、需求對細胞進展標志測試，測試細胞中在進展正式實驗之前，需求對細胞進展標志測試，測試細胞中蛋白質的蛋白質的LysLys和或和或ArgArg能否被相應的同位素氨基酸取代。收取能否被相應的同位素氨基酸取代。收取 蛋白質后，等量混合，蛋白質后，等量混合，SDS-PAGESDS-PAGE分別，分別，LC-MS/MSLC-MS/MS檢測。檢測。 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16631.2.21.2.2：細胞標志與測試：細胞標志與測試細胞經過傳代培育細胞經過傳代培育7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重型肽段取代重型肽段取代 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400

10、-699-16631.2.3: 1.2.3: 實驗處置實驗處置 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-1663 當標志測試檢測到蛋白質已被同位素氨基酸標志后，可以進展細胞處置，如藥物處置，病毒處置等。1.2.31.2.3：蛋白質分別與質譜分析：蛋白質分別與質譜分析o1：提取“輕型，“中型，“重型細胞蛋白質，等量混合，SDS-PAGE分別，染色。o2：割取蛋白質條帶，胰蛋白酶酶切。o3：LC-MS/MS儀器：LTQ Orbitrap XL)分析，數(shù)據(jù)檢索。 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16631.2.41.2.4：結果方式：結果方式 LC-MS/

11、MS分析結果，將會給出每個肽段的質譜峰圖及定量信息。結果將會已EXCEL表格呈現(xiàn)。 肽段質譜峰圖及表達量：2: SILAC2: SILAC研討蛋白質相互作用研討蛋白質相互作用o2.12.1：SILACSILAC研討蛋白相互作用原理研討蛋白相互作用原理o2.2: SILAC2.2: SILAC研討蛋白質相互作用特點研討蛋白質相互作用特點o2.32.3：SILACSILAC研討蛋白質相互作用方法分類研討蛋白質相互作用方法分類o 2.3.12.3.1：Pull-downPull-down法法o 2.3.2: Tag-CoIP2.3.2: Tag-CoIP法法o 2.3.32.3.3：Bait-CoI

12、PBait-CoIP法法o 2.3.42.3.4：RNAi-Bait-CoIPRNAi-Bait-CoIP 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16632.12.1：SILACSILAC研討蛋白質相互作用原理研討蛋白質相互作用原理 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-1663簡介： SILAC法研討蛋白質間相互作用與傳統(tǒng)的pull down和CoIP法相比，其方法的靈敏度更高、特異性更強.其原理是經過質譜鑒定和分析蛋白質相對量來判別能否是特異性結合，實驗組相對于對照組某個蛋白質量的差別到達統(tǒng)計學的差別時，就斷定這個蛋白質與目的蛋白質有相互作用。2.2

13、2.2：SILACSILAC研討蛋白質相互作用特點研討蛋白質相互作用特點 技術優(yōu)勢目前尋覓蛋白質相互作用最先進的方法，與傳統(tǒng)CoIP或Pull down相比，改技術具有以下特點： 1特異性強，假陽性率低； 2高通量，能同時鑒定出成百甚至上千個蛋白質，能最大限制的尋覓到與目的蛋白質相互作用的蛋白質； 3靈敏度高，液相與質譜連用，肽段分別與質譜鑒定連用，靈敏度比普通質譜高。 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16632.3 SILAC2.3 SILAC研討蛋白質相互作用方法分類研討蛋白質相互作用方法分類o2.3.12.3.1：Pull-downPull-down法法o2.3

14、.2: Tag-CoIP2.3.2: Tag-CoIP法法o2.3.32.3.3：Bait-CoIPBait-CoIP法法o2.3.42.3.4：RNAi-Bait-CoIPRNAi-Bait-CoIPo2.3.52.3.5：上述四種方法比較：上述四種方法比較 輝駿生物：fitgene/ 免費效力熱線：400-699-16632.3.1 Pull down 2.3.1 Pull down 法法原理：原理： 1 1: : 體外表達原核表達，真核體外表達原核表達，真核表達等表達等) )，純化出目的蛋白質，純化出目的蛋白質(tag-bai(tag-bait)t)及目的蛋白質的對照蛋白如及目的蛋白質的

15、對照蛋白如tag,tag,tag-control proteintag-control protein等等).). 2 2: : 用用tag-baittag-bait與標志上與標志上“重重型細胞的蛋白質型細胞的蛋白質pull down,pull down,同時用同時用tagtag-control-control與與“輕型細胞蛋白質輕型細胞蛋白質pull pull downdown。 3 3: : 等量混合兩次等量混合兩次pull downpull down的的蛋白質進展蛋白質進展LC-MS/MSLC-MS/MS分析分析. . 4 4：交差：交差pull down,pull down,用用tag

16、-baittag-bait與與“輕型細胞蛋白質輕型細胞蛋白質pull down,tagpull down,tag-control-control與與“重型細胞蛋白質重型細胞蛋白質pull pull down.down.Methods. 2019 Aug;54(4):387-95. Epub 2019 Mar 52.3.2 Tag-CoIP2.3.2 Tag-CoIP法法原理：原理： 1：用：用“重穩(wěn)定同位素氨基酸重穩(wěn)定同位素氨基酸標志細胞后，轉染代有標簽的目的標志細胞后，轉染代有標簽的目的蛋白質如蛋白質如GFP-bait,已可用其他標已可用其他標簽，如簽，如flag,his,biotin等等)

17、質粒進入質粒進入“重型細胞。重型細胞。 2：提?。禾崛　爸匦秃椭匦秃汀拜p型細胞的輕型細胞的蛋白質總蛋白質，核蛋白，膜蛋白蛋白質總蛋白質，核蛋白，膜蛋白質等，等量混合質等，等量混合“重型蛋白和重型蛋白和“輕輕型蛋白質。型蛋白質。 3：用：用tag標簽的抗體進展標簽的抗體進展CoIP,沉淀下來的蛋白質沉淀下來的蛋白質SDS-PAGE分別后，分別后，LC-MS/MS分析。分析。2.3.3 2.3.3 常規(guī)常規(guī)CoIPCoIP法法原理：原理： 1：“重型穩(wěn)定同位素氨基酸重型穩(wěn)定同位素氨基酸標志細胞后，分別提取標志細胞后，分別提取“輕型細胞輕型細胞和和“重型細胞的蛋白質。重型細胞的蛋白質。 2：“重重“

18、型細胞蛋白質用目的型細胞蛋白質用目的蛋白質抗體進展蛋白質抗體進展CoIP，輕，輕“型細胞型細胞蛋白質用對照抗體進展蛋白質用對照抗體進展CoIP。 3：等量混合步驟：等量混合步驟2重重CoIP下下來的蛋白質或者等量混合來的蛋白質或者等量混合CoIP后的后的Beads, SDS-PAGE分別后，分別后，LC-MS/MS分析。分析。原理：原理： 1 1將細胞用將細胞用“重型同位素氨基重型同位素氨基酸標志，酸標志，“輕型細胞用目的目的蛋輕型細胞用目的目的蛋白質的白質的siRNAsiRNA降低目的蛋白質的表達。降低目的蛋白質的表達。 2 2等量混合等量混合“重型和重型和“輕型輕型細胞的蛋白質，用目的蛋白質的抗體細胞的蛋白質，用目的蛋白質的抗體進展進展CoIPCoIP。 3 3CoIPCoIP后的蛋白質進展后的蛋白質進展LC-MS/MSLC-MS/MS分析。分析。2.3.4 RNAi-CoIP2.3.4 RNAi-CoIP2.3.4