1、整理ppt1DNADNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用整理ppt2引言引言測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與展望第一代測(cè)序技術(shù)第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)整理ppt3DNADNA序列測(cè)定的意義序列測(cè)定的意義 DNA DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系段的合成和探針的制備、

2、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)等等，都要求對(duì)DNADNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。整理ppt4人類基因組計(jì)劃（人類基因組計(jì)劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于于19901990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類DNADNA中所有基因（超過中所有基因（超過1010萬個(gè)）；測(cè)定組成人類萬個(gè)）；測(cè)定組成人類DNADNA的的3030億堿基對(duì)的序列億堿基對(duì)的序列；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能

3、引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問題。已于該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問題。已于20032003年完成。年完成。人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了科學(xué)工程，它奠定了2121世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。整理ppt5 測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)世紀(jì)50年代。年代。 早在早在1945年年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的報(bào)導(dǎo)，即報(bào)導(dǎo)，即Whitfel

4、d等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核糖核苷酸序列。糖核苷酸序列。19771977年年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。 此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測(cè)此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測(cè)序技術(shù)，包括序技術(shù)，包括Roche公司的公司的454技術(shù)技術(shù)、Illumina公司公司的的SolexaSolexa技術(shù)技術(shù)和和ABI公司的公司的SOLiD技術(shù)技術(shù)。整理ppt6 最近，最近，Helicos公司的單分子測(cè)序技術(shù)、公

5、司的單分子測(cè)序技術(shù)、Pacific Biosciences公司的單分子實(shí)時(shí)公司的單分子實(shí)時(shí)( (Single Molecule Real Time, SMRT) )測(cè)序技術(shù)和測(cè)序技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。分子測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。 測(cè)序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長(zhǎng)讀取測(cè)序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。長(zhǎng)度的方向發(fā)展。整理ppt7整理ppt8化學(xué)降解法 基本原理：利用特異的基本原理：利用特異的選擇性試劑選擇性試劑，專一性的隨機(jī)斷裂專一性的隨機(jī)斷裂DN

6、ADNA成不同長(zhǎng)短的片成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶上的區(qū)帶位置，判斷位置，判斷DNADNA片段末端核苷酸的種類片段末端核苷酸的種類，從而測(cè)出，從而測(cè)出DNADNA的序列。的序列。整理ppt9將雙鏈將雙鏈DNADNA樣品變?yōu)闃悠纷優(yōu)閱捂渾捂?每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素性同位素標(biāo)記標(biāo)記, ,以便顯示以便顯示DNADNA條帶條帶 分別用不同方法處理分別用不同方法處理, ,獲得只差獲得只差一個(gè)核苷酸的一個(gè)核苷酸的降解降解DNADNA群體群體 電泳電泳, ,

7、讀取讀取DNADNA的核苷酸順序的核苷酸順序整理ppt10整理ppt11 化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。通研究人員所掌握，因此用得較多。 而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來自，即所測(cè)序列來自原原DNADNA分子分子而不是酶促合成產(chǎn)生而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。 但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的Sange

8、rSanger法所代替。法所代替。整理ppt12 又稱為又稱為SangerSanger法。法。 原理：利用原理：利用DNADNA聚合酶，以待測(cè)聚合酶，以待測(cè)單鏈單鏈DNADNA為模板，為模板，以以dNTPdNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三雙脫氧核苷三磷酸磷酸（ddNTPddNTP）作為鏈延伸終止劑。）作為鏈延伸終止劑。 在測(cè)序引物引導(dǎo)下，通過高分辨率的變性在測(cè)序引物引導(dǎo)下，通過高分辨率的變性聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳分離，分離，放射自顯影放射自顯影檢測(cè)后，檢測(cè)后，合成

9、鏈合成鏈序列序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列 。整理ppt13整理ppt14 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH整理ppt15 Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。整理ppt16 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于SangerSanger原理，用原理，用熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用，并用成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了大大提高了D

10、NADNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。 目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied (applied biosystems biosystems ，ABI)3730ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于于毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳和和熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)的的DNADNA測(cè)序儀測(cè)序儀。整理ppt17整理ppt183730全自動(dòng)測(cè)序儀整理ppt19 該方法不同于化學(xué)降解法和該方法不同于化學(xué)降解法和SangerSanger法，是利用法，是利用DNADNA雜交原理，將一系列雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片已知序列的單鏈寡

11、核苷酸片段段固定在基片上，把待測(cè)的固定在基片上，把待測(cè)的DNADNA樣品片段變性后與樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。整理ppt20 雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核寡核苷酸芯片苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。不能重復(fù)測(cè)定。 通過幾十年的逐步改進(jìn)通過幾十年的逐步改進(jìn), , 第第1 1代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過超過1000 bp,

12、 1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%, 99.999%, 測(cè)定每千堿基序列的成本是測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5 0.5 美元美元, , 每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000 600000 堿基。堿基。整理ppt21 第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用揮過重要的作用, ,如人類基因組計(jì)劃如人類基因組計(jì)劃(human (human genome project,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA測(cè)測(cè)序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和序技術(shù)。

13、目前基于熒光標(biāo)記和SangerSanger的雙脫的雙脫氧鏈終止法原理的氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測(cè)序儀熒光自動(dòng)測(cè)序儀仍被廣泛仍被廣泛地應(yīng)用。地應(yīng)用。整理ppt22 盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在作，但由于其存在成本高成本高、速度慢速度慢等方面的不等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。足，并不是最理想的測(cè)序方法。 隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代已向我們走來。第一代測(cè)序即功能基因組時(shí)代已向我

14、們走來。第一代測(cè)序方法已經(jīng)不能滿足方法已經(jīng)不能滿足深度測(cè)序深度測(cè)序和和重復(fù)測(cè)序重復(fù)測(cè)序等大規(guī)等大規(guī)?；蚪M測(cè)序的需求，這促使了第二代測(cè)序，模基因組測(cè)序的需求，這促使了第二代測(cè)序，又稱下一代測(cè)序又稱下一代測(cè)序(nextgeneration (nextgeneration sequencing)sequencing)的誕生。的誕生。 第二代測(cè)序技術(shù)包括：第二代測(cè)序技術(shù)包括：454454測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)、SolexaSolexa測(cè)測(cè)序技術(shù)序技術(shù)和和SOLiDSOLiD測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)。整理ppt23 基因組基因組DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA）構(gòu)建構(gòu)建ssDNAssDNA

15、文庫文庫測(cè)序測(cè)序（聚合酶合成測(cè)序聚合酶合成測(cè)序，連接酶合成測(cè)序連接酶合成測(cè)序） 由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行，每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，從而行，每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。DNADNA序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù)，最后經(jīng)過計(jì)算機(jī)序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù)，最后經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的分析就可以獲得完整的DNADNA序列信息序列信息。 整理ppt24 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、熒光熒光素酶素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作

16、用下，將每一個(gè)的作用下，將每一個(gè)的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無和強(qiáng)度，達(dá)到通過檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)序列的目的。序列的目的。整理ppt25硫化酶硫化酶熒光素酶熒光素酶整理ppt26整理ppt27指示器指示器相機(jī)相機(jī)PTPPTP盒盒整理ppt28 454 454測(cè)序法的突測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，目前，目前GS FLXGS FLX測(cè)序系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過測(cè)序系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過400 bp400 bp。雖。雖然然454454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他新一代測(cè)序平臺(tái)要平臺(tái)的測(cè)序成

17、本比其他新一代測(cè)序平臺(tái)要高很多，但對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從高很多，但對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從頭測(cè)序，它仍是最理想的選擇。頭測(cè)序，它仍是最理想的選擇。 缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度。整理ppt29 Illumina公司的新一代測(cè)序儀公司的新一代測(cè)序儀Genome Analyzer最早由最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測(cè)序公司研發(fā)，利用合成測(cè)序( (Sequencingby Synthesis) )的的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。原理：原理： 將基因組將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻的

18、隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即璃表面（即Flow cell），這些），這些DNA片段經(jīng)過延伸和片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億上形成了數(shù)以億Cluster，每個(gè)每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的過可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板的模板DNA進(jìn)行測(cè)序進(jìn)行測(cè)序。整理ppt30整理ppt31整理ppt32整理ppt33 GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的

19、系統(tǒng)需要的樣品量低樣品量低至至100ng，文庫構(gòu)建過程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離，文庫構(gòu)建過程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到250bp，每次運(yùn)行后可獲得超過每次運(yùn)行后可獲得超過20 GB的高質(zhì)量過濾數(shù)的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)。整理ppt34 SOLID通過連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理通過連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：取代傳統(tǒng)的聚合酶連接

20、反應(yīng)。具體步驟包括：文庫準(zhǔn)備文庫準(zhǔn)備擴(kuò)增擴(kuò)增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測(cè)序連接測(cè)序整理ppt35整理ppt36測(cè)序過程測(cè)序過程：整理ppt37整理ppt38 超高通量超高通量是是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前目前SOLID 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生單次運(yùn)行可產(chǎn)生50 GB的序的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。倍人類基因組覆蓋度。整理ppt39整理ppt40 第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用展和應(yīng)用, , 但是由于其但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難關(guān)鍵

21、問題的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。向了更高更新的測(cè)序解決方案。 單分子測(cè)序也就應(yīng)單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。運(yùn)而生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成中科院北京基因組研究所與浪潮成立立“中科院北京基因組研究所中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學(xué)聯(lián)浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室合實(shí)驗(yàn)室”整理ppt41三代測(cè)序技術(shù)是以三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)為特點(diǎn)的測(cè)序技術(shù)v 單分子即時(shí)單分子即時(shí)DNA測(cè)測(cè)序技術(shù)序技術(shù)( (SMRT) )v HeliScope單分子測(cè)序單分子測(cè)序v 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)

22、移的即時(shí)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的即時(shí)DNA測(cè)序測(cè)序v 納米孔單分子測(cè)序技術(shù)納米孔單分子測(cè)序技術(shù)整理ppt42第三代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)1 1、目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp/ s3bp/ s2 2、它實(shí)現(xiàn)了、它實(shí)現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是（延續(xù)性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。 3 3、它的精度非常高，達(dá)到、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%99.9999%。標(biāo)記熒光基因標(biāo)記熒光基因DNA聚合酶作用 顯微

23、鏡下進(jìn)行熒光探測(cè)顯微鏡下進(jìn)行熒光探測(cè) 零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)來實(shí)來實(shí)現(xiàn)即時(shí)觀察和背景熒光干擾現(xiàn)即時(shí)觀察和背景熒光干擾l 小孔的尺寸低于光的波長(zhǎng)，小孔的尺寸低于光的波長(zhǎng)，小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造很小體積的很小體積的檢測(cè)空間檢測(cè)空間l DNADNA鏈周圍游離的熒光標(biāo)記鏈周圍游離的熒光標(biāo)記dNTPdNTP有限，非?？焖龠M(jìn)出于有限，非?？焖龠M(jìn)出于小孔，穩(wěn)定的小孔，穩(wěn)定的背景熒光信號(hào)背景熒光信號(hào)l 熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記dNTPdNTP被摻入到被摻入到DNADNA合合成鏈，其攜帶的特定熒光會(huì)成鏈，其攜帶的特定熒光會(huì)持續(xù)一小段時(shí)間持續(xù)一小段時(shí)間( (熒光光曝?zé)晒夤馄? )D

24、NA聚合酶 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠直接記錄采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠直接記錄到到單個(gè)堿基單個(gè)堿基的熒光，從而克服了第二代測(cè)序必須用的熒光，從而克服了第二代測(cè)序必須用PCRPCR擴(kuò)增出數(shù)千個(gè)拷貝以擴(kuò)增出數(shù)千個(gè)拷貝以增加信號(hào)亮度的缺陷。增加信號(hào)亮度的缺陷。DNADNA聚聚合合酶酶熒光標(biāo)熒光標(biāo)記的記的dNTPdNTP產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光 CCD記錄記錄發(fā)生了堿基延伸反應(yīng)發(fā)生了堿基延伸反應(yīng)平面基板模擬圖平面基板模擬圖 熒光供體熒光供體 DNA DNA聚合酶聚合酶 熒光受體熒光受體 4 4種種dNTPdNTP具體過程具體過程優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 游離的

25、游離的dNTPdNTP不發(fā)光，只有其摻入到新合成的不發(fā)光，只有其摻入到新合成的DNADNA鏈時(shí)才會(huì)發(fā)光，極大地降低了背鏈時(shí)才會(huì)發(fā)光，極大地降低了背景熒光干擾景熒光干擾 此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少DNADNA聚合聚合酶的光損傷作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)了測(cè)序長(zhǎng)度。酶的光損傷作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)了測(cè)序長(zhǎng)度。能量 DNADNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過納米小孔分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過納米小孔, ,利用核酸外切酶的特性來識(shí)別出不同的利用核酸外切酶的特性來識(shí)別出不同的DNADNA堿基堿基 優(yōu)點(diǎn)：納米孔測(cè)序的

26、優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì)優(yōu)點(diǎn)：納米孔測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì)DNADNA進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行標(biāo)記，也就省去了昂貴的熒光試劑和也就省去了昂貴的熒光試劑和CCDCCD照相機(jī)。照相機(jī)。內(nèi)部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組由生物分子組成的納米孔成的納米孔優(yōu)點(diǎn)： 直接測(cè)直接測(cè)RNARNA序列。序列。 既然既然DNADNA聚合酶能夠即時(shí)觀測(cè)，那么以聚合酶能夠即時(shí)觀測(cè)，那么以RNARNA為為模板復(fù)制模板復(fù)制DNADNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以應(yīng)用于第三代的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以應(yīng)用于第三代測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序平臺(tái)。 直接測(cè)甲基化的直接測(cè)甲基化的DNADNA序列。序列。 SMRTSMRT技術(shù)也可利用甲基化堿基特有的熒光信技術(shù)也可利用甲基化堿基特有的熒光信號(hào)來識(shí)別模板號(hào)來識(shí)別模板DNADNA中的甲基化修飾，如中的甲基化修飾，如N6N6甲基腺甲基腺苷、苷、5 5甲基胞嘧啶或甲基胞嘧啶或5 5一羥甲基胞嘧啶一羥甲基胞嘧啶整理ppt49整理ppt50整理ppt51整理ppt52完成全基因組測(cè)序的部分的物種完成全基因組測(cè)序的部分的物種整理ppt53整