1、實驗三 殼聚糖的酶解法降解及其動力學(xué) 以木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶催化降解殼聚糖，并考察這一酶促反應(yīng)過程的動力學(xué)動力學(xué)一 實驗內(nèi)容殼聚糖殼聚糖OOHNH2HOOOOHNH2HOOOOHNHCOCH3HOOOOHNH2HOO殼聚糖的酶降殼聚糖的酶降解解降解產(chǎn)物低聚殼聚糖可有效地降低血壓、血糖和血脂；增強免疫力和抗疾病的能力；調(diào)節(jié)腸道的微生物生態(tài)平衡等。二 實驗?zāi)康? 了解酶水解殼聚糖的原理和方法2 加深對酶促反應(yīng)過程和其應(yīng)用的認識3 掌握還原糖濃度的測定方法4 掌握反應(yīng)初速度的測定三 實驗主要材料1、木瓜蛋白酶2、殼聚糖3、N-乙酰-D-氨基葡萄糖4、鐵氰化鉀5、紫外分光光度計6、控溫搖床7、離心機8

2、、水浴鍋9、電爐四 實驗步驟 1、殼聚糖溶液的配制、殼聚糖溶液的配制 稱 2 g殼聚糖于250mL燒杯中，加入200 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH=4.6），不斷地進行攪拌，直至完全溶解。 2、木瓜蛋白酶溶液的制備、木瓜蛋白酶溶液的制備 取12 mg的木瓜蛋白酶于5mL離心管中，加入1 mL pH=4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，在旋渦振蕩器上振蕩使其溶解，保存待用。 3、殼聚糖的酶水解、殼聚糖的酶水解將殼聚糖溶液加入錐形瓶中，置于控溫搖床（45，120 rpm）中。20min后，取出1mL，測其還原糖濃度，作為反應(yīng)起始點的還原糖濃度。加入1mL木瓜蛋白酶溶液開始降解。 每隔15min取出1mL

3、，95水浴15min使酶滅活,然后測定還原糖濃度。第2個小時開始每20min取一次樣，測其還原糖濃度。當(dāng)OD值小于0.1時，應(yīng)適當(dāng)稀釋。反應(yīng)2小時后結(jié)束實驗。五 方法還原糖濃度的測定采用Imoto改良法。顯色劑：稱取0.5g鐵氰化鉀，溶解于1L 0.5mol/L的碳酸鈉溶液中，然后存放于棕色瓶中。 （一）還原糖標準曲線的繪制（一）還原糖標準曲線的繪制準確配制配制0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1.0mmol/L和1.2mmol/L的N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準溶液。分別取1.0mL，加入4.0mL顯色劑顯色劑，搖勻。塞上塞子，在沸水浴沸水浴中加熱

4、15min。冷卻，在波長420nm處，以蒸餾水做空白蒸餾水做空白，測定吸光度吸光度A。再取1.0mL 蒸餾水加蒸餾水加4.0mL顯色顯色劑劑，測其420nm處的吸光度A0。計算A=A0-A，得到一系列對應(yīng)不同濃度N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的A值。以A值對N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的濃度作圖，得標標準曲線準曲線。 （二）還原糖濃度的測定（二）還原糖濃度的測定在試管中加入1.0mL 降解后的殼聚糖溶液和4.0mL顯色劑顯色劑，搖勻；塞 上 塞 子 ， 在 沸 水 浴沸 水 浴 中 加 熱15min；冷卻，8000r/min離心離心10min;取清液，在波長420nm處，以蒸餾水做蒸餾水做空白空

5、白，測定吸光度吸光度A。再取1.0mL 蒸餾蒸餾水加水加4.0mL顯色劑顯色劑，測其420nm處的吸光度A0。計算計算A=A0-A，根據(jù)標準曲線方程得出還原糖的濃度。六 實驗結(jié)果的記錄 和數(shù)據(jù)處理Table 1標 準 溶 液 濃 度（mmol/L）00.20.40.60.81.01.2OD420 A=A0-A0 擬合的標準曲線方程 1、標準曲線的繪制、標準曲線的繪制2、殼聚糖酶解反應(yīng)過程結(jié)果記錄、殼聚糖酶解反應(yīng)過程結(jié)果記錄 反應(yīng)時間 （min）01530456080100120140OD420 A=A0-A 稀釋倍數(shù) 還原糖濃度（mmol/L） Table 2 3、繪制酶反應(yīng)進程曲線、繪制酶反

6、應(yīng)進程曲線 根據(jù)Table 2，以測得的還原糖濃度對反應(yīng)時間作圖，得酶反應(yīng)進程曲線，直線線段的斜率就是反應(yīng)初速度。 七 實驗報告 實驗原理、實驗?zāi)康摹嶒瀮x器設(shè)備、實驗流程、現(xiàn)象等結(jié)果記錄和數(shù)據(jù)處理（包括酶反應(yīng)進程曲線和反應(yīng)初速度值）pH甲液X(mL)乙液Y(mL)pH甲液X(mL)乙液Y(mL)3.646.33.74.820.030.03.844.06.05.014.835.24.041.09.05.210.539.54.236.813.25.48.841.24.430.519.55.64.845.24.625.524.5 附：乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配制 甲液 0.2mol/L醋酸乙液 0.

7、2mol/L醋酸鈉根據(jù)要求的pH值，按上表所示，吸取XmL甲液和YmL乙液混勻即得。注意事項注意事項1、酶水解時，取樣后應(yīng)立即滅活酶2、測酶解液還原糖濃度時，有時需稀釋3、細心、耐心4、愛護儀器標準曲線的繪制（Table 1)酶水解反應(yīng)進程曲線（ Table 2，并繪圖)本實驗安排本實驗安排共分7組2人/組試管架 1個試管 20mL 10支（配制標準溶液和裝樣用） 5mL離心管 10個移液管 1mL、5mL各2支玻棒 1根1mL滴管 1只（取樣用）吸耳球 2只燒杯 250mL 2個錐形瓶 250mL 1個（反應(yīng)用）堿性鐵氰化鉀溶液 150mL（顯色劑）每組實驗臺配備（共7組）公用：N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準溶液（1.2mmol/L） 100mL 1瓶量筒