1、Ni-NTA Superflow Cartridge 手冊用于手動(dòng)或FPLC純化His-tag蛋白目錄：包裝內(nèi)容物（4）儲(chǔ)存和穩(wěn)定性（4）安全措施（4）介紹（7）Ni-NTA Superflow Cartridge說明書（7）QIA表達(dá)系統(tǒng)（7）Ni-NTA Cartirdge 接頭（14）天然或變性條件下純化蛋白（15）說明書n 天然條件下清澈的E.coli菌液的制備（16）n 變性條件下清澈的E.coli菌液的制備（18）n 從E.coli細(xì)胞制備6XHis-tag的胞質(zhì)蛋白（19）n 天然條件下從昆蟲細(xì)胞中制備細(xì)胞菌液（20）n 使用注射器手動(dòng)純化6XHis-tag蛋白（21）n 使用自

2、動(dòng)層析系統(tǒng)純化6XHis-tag蛋白（22）問題的解決（23）附錄A：Buffer成分（25）附錄B; Ni-NTA Superflow Cartridge的清潔與再生（27）包裝包含物Cat no. Ni-NTA Superflow Cartridge（1） Ni-NTA Superflow Cartridge（5） 說明書30721 5 130725 100 130760 1 130761 5 130765 100 1技術(shù)支持在QIAGEN，我們?yōu)槲覀兊募夹g(shù)支持的質(zhì)量和有效性而感到驕傲我們的技術(shù)部門是由有廣泛實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員和專家組成的，他們都從事分子生物學(xué)而且熟練使用QIAGEN的產(chǎn)品

3、。如果您有任何問題或?qū)嶒?yàn)中遇到困難關(guān)于Ni-NTA SuperflowCartridge或QIAGEN的產(chǎn)品，請盡快聯(lián)系我們。QIAGEN用戶是我們改進(jìn)和專業(yè)化產(chǎn)品的主要信息來源。這些信息對于我們的科研人員與其他的科學(xué)家一樣重要。因此您如果有什么關(guān)于產(chǎn)品的建議或新的需要和技術(shù)等等請盡快聯(lián)系我們。對于技術(shù)支持和更多的信息請聯(lián)系QIAGEN的技術(shù)服務(wù)部或者當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商儲(chǔ)存和穩(wěn)定性Ni-NTA Superflow Cartridge應(yīng)該儲(chǔ)存在2-8度。不要冷凍。Cartridges在這樣的條件下可以儲(chǔ)存一年而性能不會(huì)發(fā)生任何改變。產(chǎn)品局限性Ni-NTA Superflow Cartridge僅供科研使

4、用。沒有聲明或表述是用來為診斷，預(yù)防或治療疾病而提供信息。所有預(yù)料到的麻煩和注意事項(xiàng)東應(yīng)該使用中注意。對于重組DNA實(shí)驗(yàn)，我們推薦所有用戶參照NIH指導(dǎo)方法，或者其他的可用性指導(dǎo)方針。產(chǎn)品授權(quán)和滿意的保證QIAGEN保證產(chǎn)品的效果在我們的產(chǎn)品文獻(xiàn)中都有描述。顧客對于產(chǎn)品的特殊用途必須決定它的適用性。如果不是由于使用造成的產(chǎn)品性能問題，QIAGEN將會(huì)免費(fèi)更換或退貨。我們有權(quán)更換、更改或是調(diào)整任何產(chǎn)品以增強(qiáng)性能和設(shè)計(jì)。如果QIAGEN產(chǎn)品沒有達(dá)到您的要求，聯(lián)系我們的當(dāng)?shù)丶夹g(shù)部門或是銷售商。我們將相信您的理由或者交換產(chǎn)品-只要您愿意。分離條件應(yīng)用于QIAGEN科學(xué)儀器，服務(wù)產(chǎn)品，干冰用于產(chǎn)品運(yùn)輸。

5、請?jiān)儐柛嗟男畔⒛氵€可以要求得到QIAGEN的條款和條件的副本，他會(huì)在我們的發(fā)票后提供給您。如果您有什么關(guān)于產(chǎn)品說明和性能的問題，請聯(lián)系QIAGEN技術(shù)服務(wù)和當(dāng)?shù)亟?jīng)銷商。安全措施當(dāng)工作時(shí)使用化學(xué)藥品時(shí)，通常要穿實(shí)驗(yàn)服裝，帶一次性手套和護(hù)目鏡。更多的信息請咨詢MSDSs。您可以在網(wǎng)站下載PDF或打印QANGE kit 和kit 組成以下危險(xiǎn)和安全性用語適用于Ni-NTA Superflow Cartridge。包含乙醇和鎳銨酸。傷害性的，感光的，易燃的。危險(xiǎn)和安全用語：R10-22-40-42/43。S13-26-36-4624小時(shí)緊急情況緊急醫(yī)療信息24小時(shí)內(nèi)可以從Poison Informa

6、tion Center Mainz, Germany得到，有英語、法語和德語三種。電話：+49-6131-19240介紹QIAGEN Ni-NTA Superflow Cartridge是預(yù)先裝好Ni-NTA Superflow的1ml和5ml柱子，用來純化6XHis-tagged蛋白，可以使用注射器、蠕動(dòng)泵，或者液相層析系統(tǒng)（例如AKTA或FPLC）Ni-NTA Superflow Cartridge1ml Cartridge5ml Cartridge介質(zhì)Superflow(6%高膠連瓊脂糖)珠子直徑60-169微米柱子體積6.7mmX28mm14.7mmX29.8mm最大承受壓5bar，0

7、.5MPa5bar，0.5MPa典型背景壓力（BufferNP-10,10%甘油）1.0Bar，0.1MPa（1ml/min）2.0Bar，0.2MPa（5ml/min）推薦流速1ml/min（155cm/h）5ml/min（170cm/h）最大流速10ml/min（1560cm/h）40ml/min（1360cm/h）柱連接表3，14頁表3，14頁短期儲(chǔ)存PH穩(wěn)定值(2H)2-142-14長期儲(chǔ)存PH穩(wěn)定值(2H)3-123-12吸附能力至少20mg(1膜20KDa)至少100mg(5膜20KDa)系統(tǒng)兼容性自動(dòng)層析系統(tǒng)（例如AKTA，F(xiàn)LPC，BioLogic，BioCAD，Vision

8、workstation）Cartridge材料聚丙烯連接器1/16”(入口)；M6(出口)Superflow自身最大可以使用的壓力是10Bar。但是，Cartridges的穩(wěn)定性僅在小于5Bar保證高流速可能導(dǎo)致恢復(fù)6XHis-tagged蛋白減少蛋白不同吸附能力不同QIA表達(dá)系統(tǒng)QIA表達(dá)系統(tǒng)以6Xhis tag為基礎(chǔ)，這是一個(gè)親和標(biāo)簽由6個(gè)連續(xù)的His殘基組成。這個(gè)親和標(biāo)能夠被QIAGEN獨(dú)特的專利產(chǎn)品Ni-NTA金屬吸附層析柱顯著的選擇吸附。QIA表達(dá)系統(tǒng)這個(gè)獨(dú)特的特性提供了大量的顯著優(yōu)勢（表一）而并不適合其他親和標(biāo)簽和層析方法表一：QIA表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)和優(yōu)勢特點(diǎn)優(yōu)勢在6XHis和Ni-

9、NTA間高親和性和選擇性吸附在一步法標(biāo)準(zhǔn)純化過程中的禱告純度蛋白6XHis tag與Ni-NTA作用不受基質(zhì)結(jié)構(gòu)約束一步純化能夠在天然和變性條件下使用溫和的洗脫條件吸附、沖洗、洗脫失高度的可再生，對蛋白結(jié)構(gòu)沒有影響純化蛋白可以直接應(yīng)用于下游軟件6XHis tag比其他常用標(biāo)簽小的多標(biāo)簽不會(huì)影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能6XHis tag在生理PH不帶電荷6XHis tag不會(huì)干擾分泌6XHis tag不會(huì)產(chǎn)生抗原性重組蛋白不用事先切除標(biāo)簽Ni-NTA SuperflowNi-NTA Superflow由連接Superflow樹脂的Ni-NTA組成。它將出眾的機(jī)械穩(wěn)定性和顯著的流動(dòng)特性及高效的動(dòng)力吸附

10、能力相結(jié)合。吸附6XHis-tagged蛋白的能力是5-20mg/ml。這種樹脂對于效率生產(chǎn)登記和FPLC的要求允許使用一步法純化6XHis-tag蛋白。Ni-NTA能力出眾，適應(yīng)試劑范圍廣泛，例如2M NaCl，10mM DTT，8M尿素，及許多去污劑（表二）局限性Ni-NTA基質(zhì)不要暴露在高濃度的還原劑中，例如DTT，DTE；高濃度下，這些試劑還原Ni離子還可能阻止吸附6XHIS-Tag蛋白。Ni-NTA基質(zhì)在還原劑中會(huì)變成棕色。很多情況下，-巰基乙醇能夠在濃度不高于20mM時(shí)使用，DTT兼容性證明濃度可以到10mM。EDTA，EGTA或其他任何強(qiáng)螯合劑吸附Ni離子并將他們從NTA上奪走。

11、NTA基質(zhì)缺乏NI時(shí)變白。使用任何還原劑或螯合劑都要當(dāng)心，如果不確定，就在小量的Ni-NTA基質(zhì)上作檢測。高濃度的Buffer包含強(qiáng)的給電子集團(tuán)或者氨基酸例如Arg、Glu、Gly、His，菌液中應(yīng)該盡量避免。細(xì)胞應(yīng)該被溶解。不要用強(qiáng)的螯合劑如EDTA，強(qiáng)的還原劑如DTT，或者離子去垢劑如SDS。雖然有些例子表明這些試劑小劑量的應(yīng)用沒有問題，但是我們還是不推薦使用。更多的詳細(xì)信息，見表二Ni-NTA Superflow試劑的兼容性試劑作用建議緩沖液試劑Tris，HEPES，MOPS二級胺或三級胺會(huì)還原Ni離子可以用低于100mM。推薦使用磷酸鹽螯合劑EDTA，EGTA從基質(zhì)螯和Ni離子低于1m

12、M有成功的先例，但是應(yīng)該小心使用硫化試劑-巰基乙醇DTT，DTE阻止二硫鍵形成。高濃度還原Ni離子高濃度（大于1mM）基質(zhì)可逆的變棕，取決于Ni的還原。低于10mM證明沒有影響純化和增加Ni的脫落低于20mM可以使用。還原條件下不要儲(chǔ)存基質(zhì)低于10mM DTT可以使用。還原條件下不要儲(chǔ)存基質(zhì)去垢劑非離子去垢劑（Triton，Tween，NP40）陽離子去污劑CHAPS陰離子去污劑（SDS、sarkosyl）TritonX-114去除背景蛋白和核酸去除內(nèi)毒素低于2%可用低于1%低于1%不推薦，但是低于0.3%有成功地先例低于2%變性劑鹽酸胍尿素增溶蛋白低于6M低于8M氨基酸GlyGluArgHi

13、s與Ni-NTA吸附，并與6XHis tag 競爭不推薦不推薦不推薦低濃度可用（20mM）于阻止非特異性吸附，高濃度（大于100mM）從Ni-NTA基質(zhì)洗脫6XHis-tagged蛋白其他添加劑NaClMgCl2CaCl2甘油乙醇BugBuster蛋白提取試劑咪唑碳酸氫鈉血紅蛋白銨檸檬酸酸鹽阻止離子間互作阻止蛋白的疏水作用阻止蛋白的疏水作用與Ni-NTA吸附，并與6XHis tag 競爭300mM至2M都可以用小于4M小于5mM小于50%小于20%按推薦使用低濃度可用（20mM）于阻止非特異性吸附，高濃度（大于100mM）從Ni-NTA基質(zhì)洗脫6XHis-tagged蛋白不推薦不推薦不推薦低于

14、60mMCartridge連接器Ni-NTA Superflow Cartridge可以手動(dòng)純化蛋白（用注射器），也可以自動(dòng)純化（使用層析系統(tǒng)，例如AKAT或FPLC系統(tǒng)）。Cartridge進(jìn)樣口和出樣口的尺寸和要求的連接器及手動(dòng)和自動(dòng)純化所需適配器詳細(xì)情況如下表表三 Ni-NTA Superflow Cartridge所需連接器如樣口出樣口Ni-NTA Cartridge1/16” female(AKTA)M6 male(FPLC) 使用注射器手動(dòng)純化1/16”male/luer female(Amersham,code18-1112-51)自動(dòng)純化連接器（AKTA1/16”連接器）不需要

15、Union M6 female/1/16” female(Amersham,code18-1123-94)自動(dòng)純化連接器(M6裝置，F(xiàn)PLC) Union M6 male/1/16” female(Amersham,code18-3858-01)SRTC-2，M6 female(0.5mm i.d.)(Amersham,code18-3856-01)天然或變性條件下的純化在變性還是天然條件下純化6XHis-tagged蛋白取決于蛋白的位置和可溶性，6XHis-tag的特性，下游技術(shù)的要求以及生物活性都必須要保持，因此如果復(fù)性過程是可用的，變性純化和隨后的蛋白折疊復(fù)性就要考慮周全天然條件下純化如

16、果純化首選而且必須在天然條件下，那么6XHis-tagged蛋白必須要溶解。盡管如此，雖然有許多蛋白出現(xiàn)在包涵體，一般還是有一些可溶物質(zhì)能夠在天然條件下純化。潛在的無關(guān)的影響Ni-NTA基質(zhì)的無標(biāo)簽蛋白一般在天然條件下要高于變性條件，這個(gè)反映在首次的洗液中會(huì)出現(xiàn)大量的蛋白。可以用含有低濃度咪唑的裂解液（Lysis Buffer）和清洗液（Wash Buffer）沖洗減少非特異性吸附無特異。有時(shí)6XHIs-tag會(huì)被天然蛋白的三級結(jié)構(gòu)包埋，因此可溶蛋白要求在能夠被 Ni-NTA純化之前要求變性。作為對照，在變性條件下的平行試驗(yàn)應(yīng)該要實(shí)行：如果只能在變性條件下純化，Tag能夠容易的移到蛋白相反的另

17、一端。變性條件下純化許多表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的高水平的重組蛋白都能夠形成不溶的集合體；Ecoli中形成眾所周知的包涵體。變性Buffer包含6M尿素或6M鹽酸胍，通常用來完全溶解包涵體和6XHis-tag蛋白。變性條件下，蛋白中的6XHis tag會(huì)完全暴露因此Ni-NTA基質(zhì)吸附效率會(huì)提高，而且基質(zhì)減少了非特異性吸附，純化效率也會(huì)升高。變性條件下純化的6XHis-tagged蛋白可以直接用來試驗(yàn)，或者復(fù)性再折疊。蛋白復(fù)性和重折疊能夠在Ni-NTA cartridge洗脫之前完成，或在溶液中也可以；建議參考QIAexpressionist說明書：天然條件下Ecoli菌液的制備材料和試劑細(xì)胞顆粒，Bu

18、ffer NPI-10，溶菌酶，Benzonase核酸酶（一級純度，25U/ml，Merck，catno.1.0169.0001）,2XSDS-PAGE樣品Buffer，可選擇儀器：超聲儀Buffer組成參見Appendix A步驟：1、冰上解凍細(xì)胞顆粒，用Buffer NPI-10重懸細(xì)胞，每克濕重用2-5ml需要多少細(xì)胞取決于6XHis-tagged蛋白的表達(dá)水平和使用的表達(dá)系統(tǒng)。Ni-NTA基質(zhì)的吸附能力是蛋白依賴性的，一般為20mg/ml。Buffer NPI-10包含10mM咪唑用來降低無標(biāo)簽蛋白和污染蛋白的吸附，并用少量Wash步驟后增加純度。如果標(biāo)簽蛋白在這些條件下沒有被吸附，咪

19、唑的量因該減少到1-5mM。如果6XHis蛋白顯示出高吸附親和力，那咪唑的濃度可以增至20mM。2、加入溶菌酶終濃度1mg/ml（50000units/ml）和Benzonase核酸酶（3U/ml）冰上孵化30Min選擇性的，可以加入RNase A（10/ml）和DNase I（5/ml），冰上10-15分，或用小容量的鈍的注射器的針頭吸吹數(shù)次溶解。2a、(可選)冰上超聲波破碎 用200-300W的six 10s的脈沖，每個(gè)脈沖間隔10S的冷卻期。3、4度10000Xg離心菌液20-30分，沉淀細(xì)胞殘基，收集上清可能會(huì)有一定比例的細(xì)胞蛋白，包括6XHis-tagged蛋白，仍然未溶而存在于細(xì)胞

20、沉淀。為了得到更多的標(biāo)簽蛋白，材料在變性條件下純化之前必須在變性條件下溶解。4、加入5 2X SDS-PAGE樣品Buffer于5上清中，-20度儲(chǔ)存以備SDS-PAGE5、純化過程見說明書說明書：變性條件下Ecoli菌液的制備材料和試劑細(xì)胞顆粒；2X SDS-PAGE樣品Buffer；Buffer B；可選擇：BufferB/7M尿素和Benzonase核酸酶（7M尿素不變性，8M尿素變性）Buffer組成參見Appendix A步驟：1、冰上15分溶解細(xì)胞顆粒，Buffer B重懸，每克濕重5ml1a、（可選）冰上15分鐘溶解細(xì)胞顆粒，BufferB/7M尿素中重懸，每克濕重5ml，加入B

21、enzonase核酸酶，室溫（20-25度）孵育30分鐘需要多少細(xì)胞取決于6XHis-tagged蛋白的表達(dá)水平和使用的表達(dá)系統(tǒng)。Ni-NTA基質(zhì)的吸附能力是蛋白依賴性的，一般為20mg/ml。2、室溫下窯洞細(xì)胞15-60分鐘或者用漩渦振蕩器輕輕震蕩，注意避免泡沫當(dāng)溶液為半透明時(shí)表明溶解完全。3、室溫10000Xg離心菌液20-30分鐘沉淀菌碎片收集上清（清澈的菌液）4、加入5 2X SDS-PAGE樣品Buffer于5上清中，-20度儲(chǔ)存以備SDS-PAGE5、純化過程見說明書說明書：從Ecoli菌液中制備6XHis-tagged胞質(zhì)蛋白胞質(zhì)蛋白是蛋白分泌到了Ecoli內(nèi)膜和外膜之間的胞質(zhì)中

22、的蛋白。適當(dāng)?shù)姆置谖锸强赡艿?，?dāng)目的蛋白具有N端信號肽時(shí)，他可能在轉(zhuǎn)移時(shí)被切掉。為了使用Ni-NTA純化胞質(zhì)空間的分泌蛋白，6XHis tag必須被加到目標(biāo)蛋白的C末端。N末端的6XHis tag將會(huì)與轉(zhuǎn)移信號一起處理掉。材料和試劑30mM Tris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；500mM EDTA；5mM MgSO4；Buffer NPI-10Buffer成分參見附錄A步驟：1、孵育誘導(dǎo)1升的Ecoli產(chǎn)物2、4000Xg離心20分收集細(xì)胞產(chǎn)物。重懸沉淀于30mM Tris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；每克濕重80ml。保持冰上操作，逐滴加入500mM EDTA至1mM。冰上孵育細(xì)胞5-

23、10分鐘，輕輕震蕩。3、細(xì)胞懸浮液在4度8000Xg離心20分鐘，棄去上清，用同樣體積的冰的5mM MgSO4重懸沉淀。冰盒中震蕩或搖動(dòng)10分鐘。4、4度8000Xg離心20分鐘上清此時(shí)為濃的滲出性液體，其中包含有胞質(zhì)蛋白5、繼續(xù)純化之前需要對上清進(jìn)行透析除去裂解液。說明書：天然條件下從昆蟲細(xì)胞制備細(xì)胞溶液以下步驟對于昆蟲細(xì)胞內(nèi)的6XHis tag蛋白表達(dá)的純化可以作為一個(gè)起始的步驟。盡管如此，進(jìn)一步的優(yōu)化可能是必須的。肅然在昆蟲中的表達(dá)效率一般高于哺乳動(dòng)物的，但是用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)還是有一定的困難。表達(dá)蛋白水平比在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中得到的要顯著的低，一般的少量的細(xì)胞材料就可以了。昆蟲

24、細(xì)胞中總的蛋白含量約為20mg/107個(gè)細(xì)胞。重組蛋白的表達(dá)范圍為0.05%-50%，理論上的蛋白最大產(chǎn)量為10g/107個(gè)細(xì)胞.對于昆蟲細(xì)胞的裂解，Buffer NPI-10中應(yīng)該補(bǔ)充1%的LgepalCA-630（NonidetP40）材料和試劑細(xì)胞顆粒；PBS，Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）Buffer組成參見附錄A步驟：1、用PBS清洗感染的細(xì)胞，1000Xg離心5分鐘收集細(xì)胞2、用Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）溶解細(xì)胞，沒1-2X107用4ml。冰上孵育10分鐘。 裂解Bu

25、ffer應(yīng)該包含有咪唑。對于6XHis-tagged蛋白，小于20mM咪唑不會(huì)影響吸附材料。盡管如此，如果標(biāo)簽蛋白在這些條件下沒有被吸附，咪唑濃度就應(yīng)該 降低到5-10mM3、4度10000Xg離心菌液10分鐘沉淀細(xì)胞碎片和DNA，收集上清 上清中包含6XHis-tagged蛋白4、加入5 2X SDS-PAGE樣品Buffer于5上清中，-20度儲(chǔ)存以備SDS-PAGE5、純化過程見說明書說明書：使用注射器人工純化6XHis-tagged蛋白預(yù)先準(zhǔn)備：使用柱子之前，濾膜過濾（0.2或0345m）或離心菌液(大于10000Xg)保證無雜質(zhì)材料和設(shè)備包含6XHis-tagged蛋白的清澈的細(xì)胞液

26、。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然條件）或BufferB、C、E（變性條件）。所有的Buffe字使用前都因該過濾（0.2或0345m）。 10ml注射器。連接適配器。步驟：1、用BufferNPI-10（天然條件）或Buffer B（變性條件）吸滿注射器，連接合適的適配器，推注射器排除氣體直至液體從適配器底部流出。2、連接注射器與cartridge的入口，把出口的塞子拿掉3、10倍體積Buffer平衡cartridge 不要用高壓強(qiáng)行使Buffer流出。理想流速是1ml/min（1ml cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、移去注

27、射器并填滿清澈的菌液。菌液流速要求與步驟3相同5、用一個(gè)新的注射器和相同的流速（步驟3、4），10倍體積的Buffer NPI-20（天然條件）或Buffer C（變性條件）沖洗（Wash）cartridge。6、用Buffer-NPI 250（天然條件）或Buffer E（變性條件）填滿注射器，使用推薦的流速從cartridge洗脫（Elute）蛋白。蛋白一般會(huì)被5-10倍柱體積液體洗脫說明書：使用自動(dòng)層析系統(tǒng)純化6XHis-tagged蛋白說明書適用于液體層析系統(tǒng)（如AKAT貨FPLC系統(tǒng)）。在平衡，裝載，沖洗，洗脫過程中的背景壓力一般會(huì)由系統(tǒng)產(chǎn)生。不要讓壓力超過5Bar（0.5MPa）材

28、料和儀器包含6XHis-tagged蛋白的清澈的細(xì)胞液。使用柱子之前，濾膜過濾（0.2或0345m）或離心菌液(大于10000Xg)保證無雜質(zhì)。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然條件）或BufferB、C、E（變性條件）。所有的Buffe字使用前都因該過濾（0.2或0345m）。連接適配器。步驟;1、 用BufferNPI-10（天然條件）或Buffer B（變性條件）吸滿系統(tǒng)泵，cartridge連接泵的出口，小心操作，不要讓氣體進(jìn)入系統(tǒng)。2、 移去cartridge出口的塞子，連在系統(tǒng)的管子上3、10倍體積Buffer平衡cartridge 1ml/min（1m

29、l cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、 使用系統(tǒng)泵或superloop載入清澈的細(xì)胞液進(jìn)入cartridge。保證目標(biāo)蛋白吸附在Ni-NTA基質(zhì)上，保留流出的部分作為SDS-PAGE分析5、用Buffer-NPI 20（天然條件）或Buffer C（變性條件）填滿系統(tǒng)泵，沖洗（Wash）cartridge直至A280回到基礎(chǔ)值 保留洗液用于SDS-PAGE分析6、用Buffer-NPI 250（天然條件）或Buffer E（變性條件）從cartridge洗脫（Elute）蛋白蛋白一般會(huì)被5-10倍柱體積液體洗脫。用超過20倍體積的平緩的線性梯度洗液有助于分

30、離蛋白。問題解決方法背景壓力超過5Bar（0.5MPa）a) 柱子阻塞 實(shí)施定位清洗（附錄B） cartridge吸附的菌液可能含有碎片。上柱前濾膜過濾或離心b) 使用了高粘性 Buffer 有機(jī)溶劑或穩(wěn)定裝置例如甘油會(huì)導(dǎo)致背景壓力的增大，降低流速 蛋白未被吸附a）6XHis tag沒有出現(xiàn) 檢查表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。保證閱讀框的準(zhǔn)確性 檢查可能的轉(zhuǎn)移起始端（N末端 tag）或者未成熟的終止端( C末端)b) 6XHis tag量很少 變性條件下純化。把標(biāo)簽轉(zhuǎn)移到蛋白相反的末端c）6XHis tag降解 檢查6XHis tag是否與蛋白相連接D）吸附條件不正確 檢查Buffer的PH。尿素的裂解經(jīng)常

31、導(dǎo)致PH的不穩(wěn)定。在使用前應(yīng)該檢查PH蛋白洗脫在wash BufferA）6XHis tag部分被隱藏 變性條件純化B）Buffer成分不正確 檢查變性Wash Buffer的PH純化過程蛋白突然沉淀A） 溫度太低 室溫下進(jìn)行純化操作B） 蛋白形成聚合體加入促溶試劑如0.1% Triton X-100或Tween-20，20mM-ME，2M NaCl，或穩(wěn)定輔助因子如Mg離子。這些都是Buffer 必須的，能保持蛋白的溶解性蛋白未被洗脫（Elute）A） 蛋白在cartridge中沉淀變性條件洗脫B） 蛋白仍然吸附在cartridge上檢查變性溶液的PH。如果需要調(diào)整到4.5蛋白洗脫包含污染物

32、 污染物是切去標(biāo)簽的蛋白 檢查可能的轉(zhuǎn)移起始端（N末端 tag）或者未成熟的終止端( C末端) 純化過程阻止蛋白的降解，4度操作并使用蛋白抑制劑附錄A：Buffer 成分NPI-10（天然條件Binding/Lysis Buffer，1L）50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 10mM imidazole 0.68g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾當(dāng)從昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞制備清澈的菌液時(shí)，1%lgepal CA-630(Nonidet

33、P40)應(yīng)該加入到LysisBuffer中NPI-20(天然條件Wash Buffer，1L )50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 20mM imidazole 1.36g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾NPI-250（天然條件Elution Buffer.，1L）50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 25

34、0mM imidazole 17.0g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾BufferB（變性條件Lysis/Binding Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾BufferB/7M尿素（變性條件Lysis/Binding Buffer，1L）7M 尿素 394.20g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 1

35、3.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl調(diào)整PH至8.0，濾膜過濾BufferC（變性條件Wash Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl調(diào)整PH至6.3，濾膜過濾BufferE（變性條件Elution Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137