1、多靶標基因并行檢測技術(shù)為腫瘤個體化治療提供新模式蔡貞鄭磊摘要隨著人類基因組學(xué)和藥物基因組學(xué)的發(fā)展,腫瘤個體化診療已由愿景變成了現(xiàn)實。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多信號通路激活的復(fù)雜生物學(xué)過程,多靶標并行檢測可一次同時對多個腫瘤個體化診療相關(guān)靶標進行檢測,為臨床醫(yī)生制定適宜的個體化診療方案提供更為全面的信息。本文僅就近年出現(xiàn)的可實現(xiàn)多靶標并行檢測的主要技術(shù)-液相芯片技術(shù)和新一代測序技術(shù)做簡要的述評,并簡述多靶標并行檢測在質(zhì)量控制方面應(yīng)遵循的基本原則。關(guān)鍵詞腫瘤;個體化診療;多靶標并行檢測技術(shù)Multiple target gene detection technologies provide

2、 a new dimension for personalized cancer therapyCAI Zhen, ZHENG Lei (Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, ChinaABSTRACTAlong with the development of human genomics and pharmacogenomics, the personalized diagnosis and treatment of can

3、cer has translated from vision into reality. The occurrence and development of malignant tumors is a complicated biological process involving multiple genes and signaling pathways. Parallel detection technologies are capability of detection of multiple target genes simultaneously, which provide more

4、 comprehensive information for clinical doctors to make personalized treatment program. This article will brie y introduce the new developed multiple target genes parallel detection technology, liquidchip technology and next-generation sequencing technology and discuss the basic principles of qualit

5、y control involved in these technologies.KEY WORDSTumor; Personalized diagnosis and treatment; Parallel detection technology of multiple target genes1腫瘤個體化診療近20年我國惡性腫瘤的發(fā)病率升高約50%,成為疾病死亡原因之首。雖然惡性腫瘤診治近年來已取得長足的進展,但大部分腫瘤患者預(yù)后情況仍無顯著改善。手術(shù)切除、局部放療和輔助化療聯(lián)合應(yīng)用仍是惡性腫瘤的主要治療手段。傳統(tǒng)的腫瘤化療用藥方案主要根據(jù)患者罹患腫瘤的臨床分期和病理分型制定,劑量的個體化

6、差異則根據(jù)體重、體表面積、肝腎功能等做相應(yīng)的調(diào)整。這種用藥策略對不同患者產(chǎn)生的治療效果可分為四種:治療有效而無副作用;有效有副作用;無效也無副作用;無效而有副作用。對于無效或存在嚴重副作用的患者,往往存在一個確診、試藥、換藥、再換藥的過程,這樣不僅造成病情延誤,還增加了患者承受毒副作用及經(jīng)濟損失的幾率。隨著腫瘤生物學(xué)研究的進展,一些與抗腫瘤藥物療效述 評相關(guān)的靶信號通路、靶點基因甚至某一基因的多態(tài)性位點逐漸明確,推動了腫瘤個體化治療的發(fā)展。腫瘤個體化治療是指在患者確診后進行藥物療效相關(guān)的基因檢測,根據(jù)基因檢測的結(jié)果確定個體化治療方案。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehens

7、ive Cancer Network ,NCCN 發(fā)布的幾種惡性腫瘤臨床實踐指南中已明確提到對于惡性腫瘤的病理學(xué)評估不僅要確定組織學(xué)類型、侵犯范圍、明確手術(shù)切緣情況等,還需要進行必要的分子學(xué)診斷檢查,目的是確定是否存在特定的基因突變(如EGFR 、K-ras 等以選擇靶向藥物治療的適宜人群,或?qū)颊哌x擇適宜的治療方法提供參考。但在臨床實踐中,腫瘤醫(yī)生仍常常感到困惑:“我們知道每個患者不一樣而且需要進行個體化治療,但我們怎樣能知道他們有什么不一樣,又如何根據(jù)這些不一樣來實施個體化治療?”隨著人類基因組學(xué)和藥物基因組學(xué)的發(fā)展,腫瘤“分子分型”概念被廣泛認可,并在腫瘤個體化治療中發(fā)揮著越來越重要的作

8、用。與傳統(tǒng)的病理分型不同,惡性腫瘤分子分型是根據(jù)基因特征將患者進行分類。以肺癌為例,傳統(tǒng)病理分型根據(jù)組織細胞形態(tài)分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer ,NSCLC ,后者又可分為腺癌、鱗癌和大細胞癌等;而分子分型則根據(jù)EGFR 、K-ras 、ALK 融合基因狀態(tài),將患者分為不同的亞群,如圖1。針對不同分子分型的肺癌實施針對性治療,可顯著地提高治療有效率12。MD Anderson 腫瘤研究中心就肺癌個體化治療開展的數(shù)個大型前瞻性臨床研究均顯示了個體化治療的可行性及優(yōu)勢34。2多靶標并行檢測的必要性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素作用、多基因參與、多信號

9、通路激活的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程。近年的腫瘤基因研究發(fā)現(xiàn),每個腫瘤均可通過靶標檢測明確其驅(qū)動變異基因,根據(jù)變異基因即可將患者歸為某分子亞型,從而針對性實施治療57。靶向藥物(targeted medicine 針對腫瘤基因開發(fā),通過與癌癥發(fā)生、腫瘤生長所必需的特定分子靶點的作用,阻斷腫瘤細胞內(nèi)控制細胞生長增殖的信號傳導(dǎo)通路殺滅癌細胞,阻止其進展,是目前最先進的用于治療癌癥的藥物。靶向藥物通過特定靶位發(fā)揮治療作用的本質(zhì)特性,決定了任何一種靶向藥物只對部分患者有效。靶標基因檢測是篩選適合特定靶向藥物治療患者的重要手段,已成為實施腫瘤個體化治療的必需部分,但靶向藥物療效產(chǎn)生影響的因素往往涉及到某一特定

10、信號通路中的多個關(guān)鍵基因。在一項對747位接受西妥昔單抗治療的結(jié)直腸癌患者EGFR 通路基因突變進行檢測的研究中,研究者檢測了包括K-ras 、BRAF 、NRAS 和PIK3CA 共71種突變。結(jié)果表明患者總緩解率為24.4%,而K-ras 、BRAF 、NRAS 和PIK3CA 均為野生型患者的緩解率為41.2%8,這一結(jié)果表明通過檢測EGFR 通路系列靶標檢測結(jié)果篩選,能使西妥昔單抗的有效率提高近70%;與檢測單一靶標相比較,檢測信號通路所有成員,對實施個體化治療更有指導(dǎo)意義。而對于NSCLC 患者,表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs 厄洛替尼和吉非替尼是目前治療NSC

11、LC 臨床應(yīng)用最廣的靶向治療藥物,患者肺癌細胞EGFR 基因突變狀態(tài)是這類藥物療效的決定因素。根據(jù)NCCN 非小細胞肺癌臨床實踐指南,NSCLC 患者EGFR 突變陽性者應(yīng)首選TKIs 藥物治療,而EGFR 野生型,選用細胞毒化療。但肺癌細胞如存在K-ras 基因突變會導(dǎo)致TKIs 治療耐藥狀態(tài),如明確患者存在K-ras 突變,則需考慮厄 圖1肺癌個體化治療分子分型Figure 1Molecular pathology of non-small cell lung cancer洛替尼以外的治療方法。此外,NSCLC患者中還存在EML4-ALK突變亞群,EML4-ALK突變陽性患者雖然對EGFR

12、-TKIs耐藥,但ALK抑制劑如克唑替尼對這類患者的一種很有效的治療策略,顯示出非常高的疾病控制率(約90%。故而NCCN指南中明確建議NSCLC患者進行靶向治療應(yīng)檢測以下幾種生物標記物,包括:EGFR、K-ras、EML4-ALK融合癌基因等;此外ERCC1、RRM1等基因mRNA表達水平等可作為化療療效預(yù)測標記物911。綜上而知,單一檢測某項靶標對患者接受治療的指導(dǎo)意義存在明顯局限,通過多通路多靶標并行檢測獲得每位患者腫瘤的全面基因信息,才能為患者制定出針對這些驅(qū)動基因的最佳藥物組合,如圖1所示1224。隨著腫瘤信號通路研究的深入,將有更多與藥物療效相關(guān)的靶標被揭示,并使藥物治療效率進一步

13、提高。3多靶標并行檢測技術(shù)平臺目前常用的基因突變檢測技術(shù)有測序法、DHPLC法、ARMS法和生物芯片技術(shù)等。其中第一代測序技術(shù)、ARMS、DHPLC等都無法實現(xiàn)多個靶標并行檢測而只能分開多次進行,這樣會導(dǎo)致以下問題出現(xiàn):(1使用樣本量成倍遞增;(2增加系統(tǒng)誤差;(3檢測過程耗時,且費用昂貴,難以實現(xiàn)規(guī)?；Ｉ镄酒夹g(shù)(biochip/bioarray和新一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS的發(fā)展使得多種腫瘤個體化診療相關(guān)靶標并行檢測得以實現(xiàn)。3.1生物芯片技術(shù)生物芯片是20世紀90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一,其原理是根據(jù)生物分子間特異性的相

14、互作用,將生化分析過程集成于芯片表面,從而實現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。根據(jù)載體性質(zhì)的不同,可分為固相芯片技術(shù)和液相芯片技術(shù)。前者是將多種待測分子靶標預(yù)置在一款很小的固相支持物上,用于俘獲被測血清中對應(yīng)的待測分子,通過檢測雜交信號,對生物細胞或組織中檢測分析的信息進行定量分析。第一張進入臨床檢查的是Amplichip CYP450 SNP檢測芯片,于2005年通過了FDA批準進入臨床使用,用來檢測患者體內(nèi)決定細胞色素氧化酶活性的多態(tài)性位點以預(yù)測患者藥物代謝水平的高低。目前固相芯片的制備逐漸走向高通量、微量化和自動化,其檢測下限也已達到納克級總RNA水平。這

15、為多靶標并行檢測研究,即在同一個芯片載體上平行地進行多個序列的雜交提供了可能。此外,芯片矩陣面積的微量化也減少了樣品用量,大大減少了系統(tǒng)和批次可能帶來的差異。液相芯片(liquid chip 則以熒光微球為載體,集合流式細胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)芯片技術(shù)于一體,由美國Luminex公司首先提出并研制成功。該技術(shù)利用包覆不同比例紅光及紅外光發(fā)色劑產(chǎn)生的幾百種不同比例顏色(熒光編碼的聚苯乙烯微珠(直徑5.55.6 m,通過標定特定抗體、核酸探針與各種受體等,與biotin標記的待測樣本反應(yīng)后,逐個通過檢測通道并使用雙色激光檢測:紅色激光激發(fā)微珠基質(zhì)上的紅色分類熒光,根據(jù)微珠中的熒光

16、編碼分類,鑒定各個不同的反應(yīng)類型(即定性;綠色激光則激發(fā)綠色報告熒光分子,確定微珠上結(jié)合的報告熒光分子數(shù)量來確定目的分子數(shù)量(即定量,最終對靶標實現(xiàn)實時、定性和定量分析。與固相芯片相比,液相芯片具有操作簡便,標本用量少、線性范圍廣、準確度高的優(yōu)點。此外,液相芯片還可根據(jù)臨床的需要自由選擇不同的檢測靶標進行組合25。目前基于其開發(fā)的應(yīng)用于腫瘤個體化診療的技術(shù)包括分支DNA液相芯片技術(shù)、xTAG液相芯片技術(shù)和MEL 液相芯片技術(shù)。其中分支DNA液相芯片技術(shù)直接采用樣品裂解液檢測待測RNA分子含量,與傳統(tǒng)的基因mRNA檢測技術(shù)-逆轉(zhuǎn)錄PCR相比,省略了DNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及目標片段擴增等步驟,降低了

17、操作過程或多步驟誤差積累對結(jié)果的影響,對于FFPE樣品尤其適用26,27。分支DNA液相芯片可一次并行檢測36種靶標,主要用于化療療效相關(guān)基因RNA表達水平檢測和腫瘤預(yù)后相關(guān)靶標檢測2830。xTAG-液相芯片技術(shù)可同時檢測體細胞基因突變和基因多態(tài)性,具有靈敏度高、特異性好和損耗樣本量少等特點,適用于各種組織樣本和全血樣本等。xTAG-液相芯片技術(shù)一次反應(yīng)可同時檢測96個樣本的70個等位基因,最低可檢測占野生型拷貝數(shù)1%的突變片段31,32。MEL(突變富集液相芯片技術(shù)檢測則特別適用于胸水、血漿等樣本中游離腫瘤DNA或經(jīng)顯微切割的組織切片樣本的體細胞突變檢測33,最低可檢測占野生型拷貝數(shù)0.1

18、%的突變片段。3.2新一代測序技術(shù)DNA測序技術(shù)始于上世紀七十年代,由于測序技術(shù)可較直觀地分辨出基因的核酸突變、插入和重排等變異,在檢測靶基因的核酸序列中具有獨特的優(yōu)勢,在腫瘤靶向藥物的選擇與分子分型等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。第一代測序技術(shù)即雙脫氧鏈末端終止法或稱Sanger測序法是目前應(yīng)用最為廣泛的DNA測序技術(shù),具有讀序列能力較長(大于1 000 bp、準確率高(可以達到99.99%、操作與結(jié)果分析簡易等優(yōu)點。其缺點是操作步驟繁瑣,技術(shù)要求高,且要求檢測樣本中基因突變達到一定比例方可檢出。經(jīng)過30多年的發(fā)展,測序技術(shù)也經(jīng)歷了技術(shù)的演變。近年開展的如火如荼的新一代測序技術(shù)以一次能并行對幾百萬到十

19、億條DNA分子進行序列測定為特點,亦為多靶標并行檢測提供了技術(shù)平臺34。高通量測序平臺的代表有羅氏公司的454測序儀、Illumina公司的Solexa基因組分析儀、ABI的SOLID測序儀和Ion Torrent系統(tǒng),以上幾種測序技術(shù)依賴PCR擴增的信號放大過程,基于邊合成邊測序的原理,突出特點是測序的高度平行化,成千上萬個測序反應(yīng)可在同一系統(tǒng)內(nèi)同時進行,且反應(yīng)體系非常小,可在短時間內(nèi)獲得大量的核酸序列信息。以454測序技術(shù)為例,其基本原理是:首先將核酸樣本打斷成數(shù)百bp的片段,通過在其末端接上接頭形成樣品文庫,并與特別設(shè)計的磁珠相連接,此時每個磁珠攜帶有獨特的核酸片段,再將磁珠進行乳化PC

20、R反應(yīng)(Emulsion PCR,那么每個DNA片段將形成一個獨立的核酸擴增反應(yīng),最后再將帶有擴增產(chǎn)物的磁珠放入特定的微孔板中進行焦磷酸測序與數(shù)據(jù)分析。2010年面市的Ion torrent 測序平臺則基于半導(dǎo)體技術(shù)原理而非光學(xué)原理進行測序,為全球首個后光學(xué)時代的基因組測序平臺35。而Helicos公司的Heliscope技術(shù)、Pacic Biosciences 公司的SMRT技術(shù)被譽為第三代測序技術(shù),真正實現(xiàn)了無需文庫構(gòu)建的單分子測序,不但簡化了基因組測序的流程,且大大降低了所需樣品的量。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展與逐漸成熟,科學(xué)家們不斷在基因組水平上對疾病進行更深入的研究探索,并已在一些罕見

21、病、遺傳病和癌癥的診斷治療中取得突破,相信在不久的將來,高通量測序技術(shù)將會為個體化醫(yī)療提供更豐富有力的診療信息。4多靶標檢測的質(zhì)量控制多靶標檢測往往包括基因擴增PCR和核酸雜交過程,其質(zhì)量控制應(yīng)遵循臨床檢驗,特別是臨床基因擴增實驗室的質(zhì)控原則進行質(zhì)量控制和質(zhì)量管理。除此之外,多靶標檢測還有一些特殊的質(zhì)量控制考慮。分析前往往是樣本檢測中最難控制的環(huán)節(jié)。腫瘤靶標檢測的標本多為組織標本中的DNA或RNA 分子,針對不同檢測方法不同檢測物質(zhì),對于標本采集、運送和采集的過程均有其特殊要求。如用于提取核酸的血液標本,通常要求使用EDTA抗凝的采血管,其它抗凝劑可能會對后續(xù)PCR擴增效率造成影響;又如檢測的

22、靶核酸是RNA時,要求標本必須在保護液中保存運輸以免RNA降解36。所以必須建立標準化流程,并對標本采集和運送人員進行培訓(xùn)。在分析過程中,質(zhì)控品是及時發(fā)現(xiàn)檢測異常的監(jiān)控手段,其合理設(shè)置尤為重要。檢測的各個關(guān)鍵過程均應(yīng)設(shè)置質(zhì)控樣本,包括核酸提取過程、檢測過程和關(guān)鍵儀器性能表現(xiàn)等3738,此外由于檢測靶標的特殊,很多個體化診療靶標基因的表達水平在不同個體中原本就存在很大差異,加之應(yīng)用檢測方法的不同,故而針對不同檢測靶標需設(shè)置嚴密合理的內(nèi)參對照,包括不同種類、不同濃度的內(nèi)參設(shè)置等以保證結(jié)果的可信性。腫瘤個體化診療相關(guān)靶標檢測的分析后質(zhì)量控制,除了可以采用Levey-Jennings質(zhì)控圖和Westg

23、ard 多規(guī)則質(zhì)控方法等常用統(tǒng)計學(xué)分析外,還可以定期回顧分析靶標突變率、靶標突變的人口學(xué)分布等指標是否在研究支持的合理范圍內(nèi)。另外,由于個體化診療尚處于臨床發(fā)展初期,對于一些靶標與疾病或藥物療效的相關(guān)度仍需大樣本臨床觀察,尤其是針對國人的大樣本量數(shù)據(jù)。加強與臨床醫(yī)生的對話,與臨床醫(yī)生一同合理分析報告,對正確地運用檢測結(jié)果很重要。5結(jié)語腫瘤治療正逐步進入個體化治療時代。近年來腫瘤相關(guān)靶標的研究進展非常迅速,新的檢測技術(shù)亦層出不窮。將新研究成果和先進技術(shù)轉(zhuǎn)化并服務(wù)于臨床,必須盡快建立規(guī)范、標準化的臨床檢測方法,并建立配套的質(zhì)量控制體系。參考文獻1 Pao W, Girard N. New driv

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