1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生物樣品分析中的方法學(xué)驗(yàn)證張劍萍* ,郭澄# (上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科,上海市)中圖分類號R927 文獻(xiàn)標(biāo)識碼C 文章編號1001- 0408 (2008) 3.- 2469- 03摘要 目的:介紹在色譜分析方法中方法學(xué)驗(yàn)證與質(zhì)控的內(nèi)容及其有待發(fā)展的方向。方法:參閱國際上有關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證的指導(dǎo)原則、國家食品藥品監(jiān)督管理局管理規(guī)范,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,對方法學(xué)驗(yàn)證與質(zhì)控的內(nèi)容及存在的問題進(jìn)行綜合分析。結(jié)果:總結(jié)了方法學(xué)驗(yàn)證和質(zhì)控的內(nèi)容,及方法學(xué)驗(yàn)證中存在的可能的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論:已建立的方法學(xué)驗(yàn)證和質(zhì)控內(nèi)容基本完善,但方法學(xué)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況制定。

2、關(guān)鍵詞生物樣品分析;方法學(xué)驗(yàn)證;方法學(xué)質(zhì)控生物樣品分析方法的建立、驗(yàn)證和應(yīng)用是臨床前藥動學(xué)和期臨床試驗(yàn)研究中的重要組成部分, 關(guān)系到藥動學(xué)研究和生物等效性試驗(yàn)研究的科學(xué)性和正確性。其中, 方法學(xué)驗(yàn)證(Met hod validation) 是整個試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠的基本保證,因此其是各個實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP) 的重點(diǎn)內(nèi)容。本文根據(jù)國際上有關(guān)生物分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則, 參照我國國家食品藥品監(jiān)督管理局的管理規(guī)范, 結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研究經(jīng)驗(yàn), 總結(jié)了以色譜分析方法為主的生物樣品分析中方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容及其標(biāo)準(zhǔn)制定中有待發(fā)展的方向,以供同行交流參考。1 意義方法學(xué)驗(yàn)證,又稱方法學(xué)評價、方法學(xué)確認(rèn)等,是整個

3、藥動學(xué)、生物利用度及生物等效性研究的基礎(chǔ)。這是藥動學(xué)研究有別于其他藥理毒理研究的特殊之處。所有藥動學(xué)研究結(jié)果都依賴于生物樣品的測定, 只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。在通過特異性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等研究并建立檢測方法學(xué), 以及得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線后, 在檢測過程中還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)控, 制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線并對質(zhì)控樣品進(jìn)行測定, 以確保檢測方法的可靠性。2 分類及其應(yīng)用范圍按照美國食品與藥品管理局( FDA)分類,方法學(xué)驗(yàn)證分為全面驗(yàn)證( Full validation) 、部分驗(yàn)證(Partial validation) 和交叉驗(yàn)證(Cross validation) 1 。2.1 全面

4、驗(yàn)證對于一個本質(zhì)上的新藥的分析方法, 以及對首次建立的分析方法需要進(jìn)行全面的分析方法的驗(yàn)證, 對代謝物進(jìn)行定量分析的時候也要考慮到進(jìn)行全面的分析方法的驗(yàn)證。2.2 部分驗(yàn)證已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法變更時可考慮做部分分析方法的驗(yàn)證, 部分驗(yàn)證的內(nèi)容可以根據(jù)分析方法變更的程度從只進(jìn)行日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度的考察到接近全面的分析方法的考察,實(shí)際操作中要結(jié)合實(shí)際情況,以達(dá)到客觀、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲心康?確定部分方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容。部分方法學(xué)驗(yàn)證經(jīng)常見于如檢測方法的改變; 血漿樣品采集中抗凝劑的改變; 同一種屬的生物基質(zhì)變化(例如人的血漿改變?yōu)槿说哪蛞? ;同一基質(zhì)的不同種屬變化(例如大鼠血漿到犬血漿) ; 相關(guān)線性濃

5、度范圍的變化; 分析儀器或分析軟件工作站的改變; 樣品采樣量的限制而造成的分析方法過程中的變動(例如兒科中的藥動學(xué)研究) ;聯(lián)合用藥或特殊的代謝產(chǎn)物影響分析方法的選擇性而需要調(diào)整色譜條件等情況的分析方法。2.3 交叉驗(yàn)證比較兩個分析方法的驗(yàn)證參數(shù)。常用于同一物質(zhì)的不同分析方法的改變, 如從高效液相色譜法到液質(zhì)聯(lián)用的變化或兩個及兩個以上實(shí)驗(yàn)室對同一物質(zhì)按同一方案進(jìn)行分析時2 。3 內(nèi)容分析方法中色譜方法比較常用, 在色譜方法中方法學(xué)驗(yàn)證有以下內(nèi)容1 ,3 :3.1 特異性特異性(Selectivity) 要求至少6 個不同個體的空白生物樣品無干擾, 并要求提供空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品加對

6、照物質(zhì)色譜圖、用藥后的生物樣品色譜圖。如果采用內(nèi)標(biāo)方法,還需要提供空白生物樣品加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜圖, 以證明內(nèi)標(biāo)中所含雜質(zhì)不干擾待測藥物的分析。3.2 線性3.2.1 線性范圍確定。根據(jù)生物樣品中藥物濃度范圍, 確定線性范圍。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品, 但計(jì)算時不包括該點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線至少有不包括空白在內(nèi)的6 個點(diǎn)。定量范圍應(yīng)能覆蓋全部待測濃度, 不允許將定量范圍外的濃度推算為未知樣品的濃度。3.2.2 相關(guān)系數(shù)與反算濃度。通過系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)生物樣品進(jìn)行測定, 得到濃度與響應(yīng)值的回歸方程。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求除相關(guān)系數(shù)( r) 值大于0.99 外,還要求經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線反算濃度要在真實(shí)濃度的±

7、;15 %范圍內(nèi), 標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)和最低點(diǎn)在±20 %范圍內(nèi)。為保證生物分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量, 采用何種算法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線尤為重要, 分析方法委員會(Analytical met hodscommit tee) 推薦使用加權(quán)回歸方程檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性(Linear range) 。與普通最小二乘法不同的是加權(quán)最小二乘法(Weighted least squares) 在回歸計(jì)算時增加了1 個權(quán)重因子W , 采用這種方法計(jì)算回歸直線的斜率和截距, 可使生物樣品的測定結(jié)果與理論值的相對偏差在不同的濃度區(qū)間內(nèi)比較均衡4 。對于測定濃度范圍特別寬的少數(shù)情況下, 可采用不同濃度區(qū)間2 條回歸直線組合的

8、方法。3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線各個點(diǎn)的取舍。標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍和濃度點(diǎn)一經(jīng)確定, 在每個分析批次(Batch) 中, 不能為了達(dá)到以上對于線性的要求而對標(biāo)準(zhǔn)曲線各個組成點(diǎn)作舍棄處理。只有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中某點(diǎn)的反算濃度超過真實(shí)濃度的15 % , 才能作舍棄處理, 并要保證舍棄后標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括6 個點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)和最低點(diǎn)不能作舍棄。3.2.4 最低定量限(LLOQ) 。定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)。LLOQ 的確定應(yīng)該測定至少5 個樣品(不包括標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低濃度點(diǎn)) , 保證在真實(shí)濃度的80 %120 %內(nèi), 變異系數(shù)(CV) 不得超過20 % ,并且信噪比應(yīng)大于5 。LLOQ 區(qū)別于檢測限(D

9、etection limit ) , 檢測限只要求信噪比為3 。3.3 精密度與準(zhǔn)確度3.3.1 質(zhì)控樣品濃度確定。一般采用3 個濃度的質(zhì)控樣品,低濃度接近定量下限, 在定量下限的3 倍以內(nèi); 高濃度接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限(一般為高濃度的80 %) ; 中間選擇一個濃度, 每一濃度至少5 個樣品。目前, 國際雜志上有些論文中質(zhì)控樣品濃度的選擇為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)、最高點(diǎn)和中間濃度。3.3.2 精密度(Precision) 。用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差( RSD) 表示, RSD 一般應(yīng)小于15 % ,在LLOQ 及最高定量限(ULOQ) 附近RSD 應(yīng)小于20 %。一日內(nèi)每隔2 h 處理一組低

10、、中、高濃度樣品,共處理5 組,來計(jì)算日內(nèi)精密度。獲得批間(日間) 精密度應(yīng)至少連續(xù)測定3 個分析批次,一般為5 個分析批次,每個濃度至少測定3 個樣品。3.3.3 準(zhǔn)確度(Accuracy) 。指測定生物樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度,用REC( %) 表示,一般要求應(yīng)在85 %115 %內(nèi),在LLOQ 及ULOQ 附近REC 應(yīng)在80 %120 %內(nèi)。3.4 穩(wěn)定性根據(jù)具體情況, 對分析過程中所涉及到的預(yù)處理前、預(yù)處理中及預(yù)處理后的樣品在不同基質(zhì)、不同放置條件下及不同存放時間進(jìn)行穩(wěn)定性(Stabilit y) 驗(yàn)證, 以排除外界因素對測定結(jié)果的影響, 保證分析結(jié)果的客觀性。一般主要考察以下幾

11、個方面:3.4.1 貯備液(Stock solution ) 穩(wěn)定性。驗(yàn)證貯備液在特定溶媒、特定保存溫度下(一般2 個溫度,室溫和冷藏) 、不同放置時間的穩(wěn)定性, 以確定貯備液的保存條件和保存日期。經(jīng)過特定貯存條件的貯備液濃度與新配制的貯備液濃度的偏差( % ,Difference) 不超過5 %。偏差= (新配制貯備液峰面積穩(wěn)定性考察的貯備液峰面積) / 新配制貯備液峰面積×100 %。因?yàn)樗鶞y定的樣品是溶媒中而非生物基質(zhì)中, 故其可接受標(biāo)準(zhǔn)為5 %。3.4.2 待測藥物在生物樣品中的穩(wěn)定性。凍融穩(wěn)定性指制備好的質(zhì)控樣品經(jīng)過3 個循環(huán)的凍融時的穩(wěn)定性變化情況。質(zhì)控樣品冷凍保存24

12、h ,放置于室溫（自然解融至室溫）, 然后再冷凍1224 h , 稱為一個冷凍、解融循環(huán)。短期放置穩(wěn)定性指驗(yàn)證樣品在生物介質(zhì)中室溫放置412 h 的穩(wěn)定性, 一般采用室溫4 h 。長期冷凍放置穩(wěn)定性放置時間的設(shè)置根據(jù)實(shí)驗(yàn)中樣品采集到樣品分析的可能的時間間隔, 一般采用2 、4 、8周。3.4.3 處理好樣品(Processed samples) 穩(wěn)定性。一般指處理好的樣品置于自動進(jìn)樣器到進(jìn)樣時間段樣品的穩(wěn)定性。如果自動進(jìn)樣器不能進(jìn)行溫度控制, 一般考察處理好樣品放置于室溫24 h 的穩(wěn)定性; 如果自動進(jìn)樣器可控制溫度, 則考察設(shè)置溫度下處理好樣品24 h 的穩(wěn)定性。在該項(xiàng)驗(yàn)證中需要注意的是,如

13、采用內(nèi)標(biāo)法, 則內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性也需要同時進(jìn)行考察。在穩(wěn)定性考察中, 每項(xiàng)考察采用低、中、高3 個濃度樣品, 每個樣品平行操作35 份, 其可接受標(biāo)準(zhǔn)定為每個濃度中67 %的樣品與真實(shí)濃度的偏差不超過15 %。偏差= (真實(shí)濃度穩(wěn)定性考察樣品的測得濃度) / 真實(shí)濃度×100 %。3.5 稀釋超出線性范圍的樣品可采用稀釋(Dilution) 的方法, 但是必須對該項(xiàng)進(jìn)行驗(yàn)證,采用相同基質(zhì)進(jìn)行稀釋,最少平行操作6份, 并保證67 %的樣品稀釋后的測定濃度在真實(shí)濃度的85 %115 %內(nèi)。3.6 基質(zhì)效應(yīng)按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會的定義, 基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect ) 指樣品

14、中除目標(biāo)分析物以外的其它成分對待測物測定值的影響, 即基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確測定分析物能力的干擾。在采用質(zhì)譜方法進(jìn)行體內(nèi)藥物定量檢測時, 應(yīng)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn),觀察基質(zhì)對藥物測定的影響。3.7 殘留效應(yīng)在方法評價中, 線性的最高濃度被測試之后, 必須測試試劑空白樣品來評價殘留效應(yīng)(Carryover evaluation) 。其可允許接受的范圍為小于LLOQ 的20 %。3.8 保留時間選定一個濃度的樣品, 選擇不同日期或者不同批次的保留時間(Retention ,采用內(nèi)標(biāo)時用兩者比值) 測定出其平均值。每個批次中樣品的保留時間應(yīng)在此平均值的85 %115 %內(nèi)。4 方法學(xué)質(zhì)控生物樣本分析方法驗(yàn)證完

15、成之后才能開始測定未知樣品。在測定生物樣品中的藥物濃度時應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制, 以保證所建立的方法在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性。質(zhì)量控制內(nèi)容及相關(guān)問題主要涉及以下幾個方面:4.1 系統(tǒng)適用性批次的開始應(yīng)有一系統(tǒng)適用性(System suitability test ,SST) 樣品, 一般用相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度峰面積的無基質(zhì)樣品(溶劑中或流動相中) 來評價柱子理論塔板數(shù)、分離度和保留時間等。4.2 質(zhì)控樣品數(shù)量及可接受標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)應(yīng)用中的精密度和準(zhǔn)確度需要進(jìn)行監(jiān)測, 為達(dá)到此目的需要設(shè)定一定數(shù)量的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的數(shù)量根據(jù)每個批次的樣品總的數(shù)量決定, 一般要求質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5 % , 并遵循

16、4 6 20 原則, 即6 個質(zhì)控樣品中至少有4 個樣品的濃度與真實(shí)值偏差在20 % 以內(nèi),且超出20 %的樣品不是同一濃度。根據(jù)此原則來決定所分析批次是否被接受。2010年版中國藥典規(guī)定：質(zhì)控樣品數(shù)應(yīng)大于未知樣品總數(shù)的5%，不得少于6個。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于15%，低濃度點(diǎn)偏差一般應(yīng)小于20%；最多允許1/3不在同一濃度的質(zhì)控樣品結(jié)果超限。如質(zhì)控樣品測定結(jié)果不符合上述要求，該分析批樣品測試結(jié)果作廢。標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍不能外延，濃度高于定量上限的樣品應(yīng)采用空白介質(zhì)稀釋后測定；低于定量下限的樣品，在進(jìn)行藥代動力學(xué)分析時，Cmax以前的樣品定為零值，以后的樣品定為無法定量。4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

17、的擬訂方法學(xué)應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合, 權(quán)重系數(shù)選擇和擬合優(yōu)度要和方法學(xué)建立過程中的方法學(xué)驗(yàn)證保持一致。4.4 重復(fù)分析當(dāng)色譜分析數(shù)據(jù)與藥動學(xué)規(guī)律存在矛盾, 色譜行為差、儀器故障、序列問題,或者其他目的的時候,分析樣品的批次需要進(jìn)行重復(fù)分析。這種重復(fù)分析是允許的, 但是必須記錄原始數(shù)據(jù)和重復(fù)分析后的數(shù)據(jù),并詳細(xì)注明重復(fù)分析的原因。4.5 分析批次的舍棄處理由于質(zhì)控樣品不符合4 6 20 原則或保留時間不符合要求等原因,批次應(yīng)作舍棄處理,該組數(shù)據(jù)不納入數(shù)據(jù)分析,但是必須記錄舍棄該數(shù)據(jù)的原因。5 注意問題5.1 方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容要根據(jù)實(shí)際情況制定在實(shí)際操作中, 每個試驗(yàn)項(xiàng)目都有其自身的特殊性, 方法學(xué)

18、驗(yàn)證的具體內(nèi)容要根據(jù)具體情況制訂, 首先要考慮到確保方法的科學(xué)性和客觀準(zhǔn)確性, 其次也要考慮到經(jīng)濟(jì)原因、時間因素等。5.2 生物樣品分析方法驗(yàn)證中存在的風(fēng)險(xiǎn)5 方法學(xué)驗(yàn)證的目的是為了達(dá)到客觀準(zhǔn)確的分析結(jié)果, 通過外標(biāo)已知濃度的樣品(Spiked samples) 對生物樣品離體后在采集、運(yùn)輸、儲藏、處理、進(jìn)樣分析過程中可能遇到的情況進(jìn)行考察, 以保證在測定未知濃度的生物樣品時實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。但是外標(biāo)樣品, 即在相同的空白生物基質(zhì)中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品, 與實(shí)驗(yàn)動物或受試者給藥后的真實(shí)的生物樣品(Realsamples) 之間可能存在差異, 這些差異主要存在以下幾個方面: (1) 穩(wěn)定性的改變; (2) 回收率的改變,外標(biāo)樣品和真實(shí)樣品的回收率不同; (3) 不穩(wěn)定代謝物的存在及其對測定結(jié)構(gòu)的影響; (4) 存在結(jié)構(gòu)類似(色譜行為接近) 的代謝