1、第二次分子生物學實驗報告DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定、實驗目的1、 學習和掌握限制性內(nèi)切酶的分類、特性與作用原理，掌握載體和外源目的DNA酶切的操作技術(shù)。2、 學習利用T4DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的DNA片段連接起來，構(gòu)建體外重組DNA分子的技術(shù)，了解并掌握幾種常用的連接方法。3、 掌握利用CaCl2制備感受態(tài)細胞的方法；學習和掌握熱擊法轉(zhuǎn)化E.coli的原理與方法。4、 學習并掌握使用紅白菌落法篩選獲得重組子以及a互補篩選法的原理及方法。5、 學習和掌握使用試劑盒抽提質(zhì)粒的方法；6、 復習瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法；7、 通過對重組子進行重組質(zhì)粒DNA的抽提與酶

2、切鑒定，進一步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的DNA片段，并驗證重組子是期望的重組子。實驗原理1、限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核甘酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶，主要是從原核生物中分離純化出來的。在限制性核酸內(nèi)切限制酶的作用下，侵入細菌的“外源”DNA分子便會被切割成不同大小的片段，而細菌自己固有的DNA由于修飾酶（通常是一種甲基化酶）的保護作用，則可免受限制酶的降解。目前已經(jīng)鑒定出3種不同類型的限制性核酸內(nèi)切酶，即I型酶、II型酶和III型酶。I型酶切割位點是隨機的，至少距識別位點1000bp。田型限制酶的切割位點距識別序列3端為2426bp。II型限

3、制酶的切割位點一般在識別序列上或與之靠近，而且具有序列特異性，故在基因克隆中有特別廣泛的用途。n型核酸內(nèi)切限制酶具有3個基本的特性：在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的；斷裂結(jié)果形成的DNA片段往往具有互補的單鏈延伸末端。限制性核酸內(nèi)切酶對DNA底物的酶切作用是否完全，直接關(guān)系到連接反應、重組體分子的篩選和鑒定等實驗結(jié)果。核酸內(nèi)切限制酶活性的充分發(fā)揮受到以下幾個因素的影響：1) DNA樣品的純度，可采取措施有純化DNA、加大酶的用量、延長酶催化反應的保溫時間，擴大反應體積；2) DNA的甲基化程度，基因工程

4、中必須使用甲基化酶失活突變的菌株；3) 酶切消化反應的溫度；4)DNA的分子結(jié)構(gòu)；5)限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。限制核酸內(nèi)切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重組技術(shù)中限制性核酸內(nèi)切酶主要用在一下幾方面：構(gòu)建重組質(zhì)粒；構(gòu)建基因文庫；DNA分子的雜交；制備DNA放射性探針；繪制DNA分子的限制酶圖譜DNA序列分析；基因定位及DNA同源性研究。2、限制性內(nèi)切酶的酶切反應體外構(gòu)建重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性核酸內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識別位點，即當用一種或者兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA時，能夠得到完整的目的基因。其次，選擇具有相應的單一酶切位點的

5、質(zhì)粒、噬菌體等載體分子作為克隆的載體。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。(1)雙酶切法：如果只在要克隆的目的DNA二端具有不同的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點，而目的基因內(nèi)部沒有相應的識別序列，可用這二種限制性核酸內(nèi)切酶酶切，則目的DNA可產(chǎn)生二種不同的黏性末端。選擇同樣具有這二種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合適載體，酶切后，同樣產(chǎn)生二個不同的黏性末端，當構(gòu)建重組分子時，目的DNA可以一定的方向插入載體中，這樣操作效率高，也利于重組子的篩選。(2)單酶切法：如果目的DNA片段只能用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的片段兩端產(chǎn)生相同的粘性末端或者平末端。選擇具有同樣限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合適

6、載體，在構(gòu)建重組分子時，除了形成正常的重組子之外，還可能會出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或者目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象，因此重組效率較低。如果沒有很好的方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子，篩選重組子會比用雙酶切法構(gòu)建重組DNA分子的工作量大很多。單酶切法和雙酶切法各有優(yōu)缺點，在實際操作時要根據(jù)具體情況來定3、DNA連接酶DNA連接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3'羥基末端與5'磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于連接DNA片段的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coliDNA連接酶

7、只能催化雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。DNA連接酶同限制性核酸內(nèi)切酶一樣，都是在體外構(gòu)建重組DNA分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶可以將DNA分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來源的DNA片段組成新的雜交DNA分子，還必須將它們彼此連接起來。目前有3種體外連接DNA片段的方法：用DNA連接酶連接具有互補黏性末端的DNA片段；用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶

8、給具平末端的DNA片poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA連接酶連接起來；先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端，再用DNA連接酶連接起來。這3種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。4、載體與外源DNA的連接反應外源DNA片段與載體分子的連接，即DNA分子體外重組，主要依賴于DNA連接酶來完成。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5'-磷酸和3'-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶：T4DNA連接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。目的DNA片

9、段與載體DNA片段之間的連接方式主要有以下幾種：(1)互補粘性末端片段之間的連接當載體和外源DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割時，產(chǎn)生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識別序列；如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶(同尾酶)切割時，雖然可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。定向克?。焊鶕?jù)核酸內(nèi)切限制酶的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。十分明顯，如果載體分子和待克隆的DNA分子都是用同一對核酸內(nèi)切酶切割，然后混合

10、起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子?；パa粘性末端連接方案中還有一個問題：片段的多拷貝插入。當需要表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物時，多拷貝的插入，在沒有拼連剪切信號的情況下，將會導致表達困難或紊亂。所以需要用內(nèi)切酶圖譜對單拷貝插入片段進行鑒定和篩選。適當?shù)牟迦肫闻c載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般比例為2:1（插入片段摩爾數(shù)：載體摩爾數(shù)）。（2）平末端及非互補黏性末端片段之間的連接載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補的粘性末端。實際上有許多情況都是例外的，因為有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實驗要用兩種不同的限制酶分別切割載體

11、分子和外源DNA,形成的也多半是非互補的粘性末端或平末端；再如用機械切割法制備的DNA片段，PCR擴增的和化學合成的DNA片段或由RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA片段，也不會具有互補的粘性末端。既然在一定反應條件下，用T4DNA連接酶可以將平末端的DNA片段有效地連接起來，那么對于上面提到的非互補粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈DNA的S1核酸酶處理變成平末端或用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段填補后變成平末端，一樣也可以使用T4DNA連接酶進行有效地連接。不過，平末端DNA片段間的連接作用不僅在效率上明顯地低于粘性末端間的連接作用，而且重組之后一般不能從原位刪除下來。

12、影響DNA連接的因素有溫度、時間、酶量、緩沖體系、DNA末端的性質(zhì)及濃度、DNA判斷的大小等。溫度，理論上最佳溫度是37C,此時酶的活性最高，但37c時粘性末端分子形成的氫鍵配對極不穩(wěn)定，因此我們選擇在1216c進行連接。時間，在最適溫度下，一般粘性末端連接30min即可取得較好的效果，連接60min則更完全些，為了實驗方便有時也在4c下連接過夜。而對于平末端建議在4c下連接，并且時間適當延長。更為普遍的條件是：16c連接過夜酶單位（Takara）在20ml的連接反應體系中，6mg的入DNA-Hind田的分解產(chǎn)物在16c下fanying30分鐘時，有90%以上的DNA片段進行連接的酶量為1U。

13、酶量，連接實驗中DNA的濃度比酶量定義狀態(tài)下低很多倍，所以酶是過量的。Takara的T4-DNA連接酶濃度是350U/ml。緩沖體系（buffer）,Tris-HCl提供連接所需的合適的ph值，DTT提供還原力，ATP促進連接反應的有效進行。DNA濃度，連接反應中DNA的濃度一般為0.11pmol/ml。其中載體濃度過高會增加載體間分子的環(huán)化，而過低則獲得重組分子的效率低，甚至導致載體分子的自身環(huán)化，外源DNA則依據(jù)連接類型的不同加入載體濃度的110倍。5、感受態(tài)細胞的制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體外連接的DNA重組分子導入合適的受體細胞才能大量地進行復制、增殖和表達，將外源重組體分子導入受體細胞的途徑，包

14、括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化(transformation)。細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應遺傳性狀的過程。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān)系較遠的DNA分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表方法之一是CaCl2誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。感受態(tài)是指宿主細

15、胞最容易接受外源DNA片段并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，由受體菌的遺傳性狀決定，同時也受菌齡和環(huán)境因子的影響。感受態(tài)的細胞一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期。重組DNA轉(zhuǎn)化細菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學方法，人工誘導細菌細胞進入一個敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進入細菌內(nèi)。CaCl2誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理是將處于對數(shù)生長期的細菌置于0C,CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，同時鈣離子使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導的感受態(tài)。此時加入DNA,鈣離子又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶(Dnase)的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的

16、外表面上。經(jīng)短暫的42c熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內(nèi)。影響感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化的因素有細胞的狀態(tài)、DNA的質(zhì)量和濃度、試劑的純度等。(1)細胞的生長狀態(tài)和密度：從甘油管中新鮮活化而不是多次轉(zhuǎn)接的菌；培養(yǎng)至指數(shù)前期到指數(shù)期；應為限制-修飾系統(tǒng)缺陷菌株；感受細胞和所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)應匹配。(2)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度：超螺旋構(gòu)想的質(zhì)粒DNA,較其線性構(gòu)想的轉(zhuǎn)化率高10100倍；加入DNA的體積不應超過感受態(tài)細胞的5%,1ng的cccDNA即可使50l的感受態(tài)細胞達到飽和；對于同一類型的載體而言，分子量越大轉(zhuǎn)化率越低。(3

17、)其他藥品、試劑質(zhì)量：氯化鈣應用高純度藥品、超純水配制，過濾除菌、分裝保存；所有試劑、容器、耗材等均需無菌處理；感受態(tài)細胞制備過程均需無菌、冰浴操作。5、a互補利用B-半乳糖普酶篩選系統(tǒng)，跟據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。載體上插入了B-半乳糖普酶的調(diào)控序列和B-半乳糖普酶N端146個氨基酸的編碼序列，而其對應的宿主菌染色體上整合有3-半乳糖普酶C端序列的遺傳信息。當質(zhì)粒載體導入相應宿主菌后，通過a互補作用，形成完整的B-半乳糖甘酶。在加有氨芳青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板上，不含質(zhì)粒pUC19的E.coliDH5a無法生長；含有質(zhì)粒pUC19的E.coliDH5a利用3-半乳糖甘酶分解培養(yǎng)基中

18、的乳糖產(chǎn)生有機酸，pH降低，培養(yǎng)基中的指示劑變紅，菌落變?yōu)榧t色；含有重組質(zhì)粒的E.coliDH5a具有氨芳青霉素抗性可以生長，但質(zhì)粒pUC19中有外源基因插入到多克隆位點，使B-半乳糖普酶N端的基因不能表達，無法實現(xiàn)a互補作用，所以其菌落為白色。利用這種篩選方法可方便地將含目的基因的重組子篩選出來。6、重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒是外源基因通過單酶切（或雙酶切）與用相同的（或二種）限制性核酸內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒載體理解后獲得的，因此在連接處仍保留原限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，用該酶（或二種酶）再次切割重組質(zhì)粒，能把插入片段切離載體，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見有載體片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片

19、段的大小。7、麥康凱培養(yǎng)基蛋白麻、月東提供碳氮源、維生素和生長因子；牛膽鹽和結(jié)晶紫可抑制革蘭氏陽性菌的生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；乳糖為可發(fā)酵的糖類；中性紅是pH指示劑，細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。三、主要儀器和實驗試劑1、儀器與材料LB培養(yǎng)基,NaOH溶液，氨節(jié)青霉素母液（20mg/mL）,無水乙醇，超純水，限制性核酸內(nèi)切酶Hindin及其相應的Buffer,T4-DNA連接酶及其Buffer,麥康凱培養(yǎng)基，100mmol/LCaCl2溶液，Omega質(zhì)粒抽提試劑盒，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液（50X）,上樣緩沖液（10X）,澳化乙錠

20、（EB）。2、實驗試劑恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，漩渦振蕩器，恒溫水浴鍋，Eppendorf管，微量移液器，培養(yǎng)皿，三角瓶，酒精燈，量筒，牛皮紙，接種環(huán)，涂布器，電子天平，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，凝膠成像檢測儀，瓊脂糖凝膠梳子，手套。3、實驗材料E.coliDH5a(pUC19);pUC19質(zhì)粒；入DNA。四、實驗步驟1、酶切在無菌Ep管中按ddH2O、buffe、DNA、限制性內(nèi)切酶的順序依次加入酶切反應的各種成分(各組分的量見Figure1),混勻，4000rpm離心1min,將液體集中于管底。37C,12小時，在-20C冰箱保存。酶切產(chǎn)物電泳檢測酶切效率，各小組向EP觀眾加8

21、口上周得到的酶切反應液，并加2lLoadingbuffer。加樣序號體系組成I自己提取的pUC19II商品入DNA田商品pUC191ddH2O(ul)13.070.064.0210*Buffer(ul)2.010.08.03DNA(ul)4.015.04.04Hindm(5M/ul)1.05.04.0總計(ul)20.0100.080.0Figure1pUC19質(zhì)粒及入DNA酶切反應體系2、連接(1)在無菌Ep管中依次加入連接反應的各種成分(見Figure2),混勻;(2)4000tpm離線1min,集液于管底；(3)在16c的恒溫水浴鍋中反應過夜。ddH2010*LigaseBufferpU

22、C19DNA/Hindm入DNA/HindmT4-DNA連接酶(30U/ul)計含量(ul)3.21.02.03.00.810.0Figure2連接反應體系3、感受態(tài)細胞的制備(1)倒LB平板，劃線活化E.coliDH5a。(2)從LB平板上挑取E.coliDH5a單菌落至5mLLB液體培養(yǎng)基里，37c振蕩培養(yǎng)過夜。(3)以1%的接種量將過夜培養(yǎng)的E.coliDH5a接種于20mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，220rpm培養(yǎng)2-2.5h。(4)將菌液之于冰浴中。(5)分別取1.5mL菌液于2個無菌的1.5mLEp管中，4000rpm離心5min,棄上清液，收集菌體。(6)每支離心管中加入用冰預冷的80

23、040.1mol/LCaCL輕輕懸浮細胞，冰上放置10min,4000rpm離心5min。(7)棄上清液，加入100LCaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min,即為感受態(tài)細胞，分裝至50屋/管。4、轉(zhuǎn)化步驟1感受態(tài)細胞2DNA3冰浴4熱擊5冰浴6復7蘇培養(yǎng)基涂平板I-實100連接物10min90s5miLB:0.9ml/含amp麥康凱培養(yǎng)基，驗組5.0n管，0.5-1h50林l*2、100林l*2、150林l*2、200ul*林l*2n-轉(zhuǎn)50pUC1910min90s5miLB:0.9ml/臺amp麥康凱培養(yǎng)基，化對1.0n管，0.5-1h50l*1昭田-細5010min90s5mi

24、LB:0.9ml/含amp麥康凱培養(yǎng)基，胞對n管，0.5-1h50。*1；麥康凱培養(yǎng)照基，50口*1Figure3平板至置于操作臺上10分鐘后，導致于37c溫箱中培養(yǎng)1620ho5、轉(zhuǎn)化子和重組質(zhì)粒的篩選(1)轉(zhuǎn)化后的細胞在含有氨芳青霉素的LB培養(yǎng)基上為白色菌落，選取六個白色菌落在另一LB培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)。(2)六個菌落中選取三個轉(zhuǎn)接到3mL含氨芳青霉素的LB培養(yǎng)基中，37c振蕩培養(yǎng)過夜。6、重組質(zhì)粒的驗證(1)取菌液3.0mL用試劑盒提取質(zhì)粒。A.將帶有重組質(zhì)粒的菌體接種5ml于含amp的LB培養(yǎng)基上，37°C搖床過夜；B.取15ml菌液，室溫下10000rpm離心1min收

25、集菌體；C.棄培養(yǎng)基，加入250m口solutionI/RNaseA混合液，渦旋震蕩使細胞完全懸浮；D.往混合液中加入2506solutionn,輕輕顛倒混勻，裂解時間不要超過5min；E.加入350lsolution田，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；F.室溫，10000rpm離心10min；G.轉(zhuǎn)移上清液到套有2ml收集管的HiBindDNA結(jié)合柱中，室溫下，10000rpm離心1min,倒去濾液；H.柱子重新裝回收集管，加5004HBBuffer,按上述條件離心，棄去濾液；I.柱子重新裝回收集管，加700lDNAWashBuffer,按上述條件離心，棄去濾液；J.柱子重新裝回收集管，10

26、000rpm離心空柱2min;K.把柱子裝在干凈的Ep管上，加入50(1l日utionBuffer到柱子基質(zhì)中，10000rpm離心1min洗脫出DNA。(2)對有外源基因插入的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割，進行進一步鑒定。(3)37c保溫0.51ho(4)利用空載體pUC19片段和目的基因片段為對照，對沒切后的重組質(zhì)粒的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，從酶切后片段的數(shù)目及大小上進行確認。處理：2口ddH2O,2質(zhì)粒，1lloadingbuffer,輕彈/用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底。五、結(jié)果分析1、酶切結(jié)果電泳檢驗泳道1*345671樣品兒H111OILpUCl。f商品）pLCl。崎品1HJIplKJ

27、UplIMIIin樣量（口”5100嗎50100ngHM)作用M時照T對第對照T(l)T(2)Figure4酶切檢驗上樣順序在電泳圖中，我們第9小組的酶切產(chǎn)物在第14泳道，主要的亮帶有兩條。先從位置上看，較近的一條和第5泳道的pUC19（商品）/Hindin對齊，說明是這條帶是切開的質(zhì)粒，是線性DNA;較遠的一條帶和第4泳道的亮帶對齊，說明這條帶是未被切開的質(zhì)粒，是環(huán)狀DNA。環(huán)狀DNA電泳速率比線性DNA快，這也驗證了“近處條帶是酶切成功的質(zhì)粒，遠處條帶是未切開的質(zhì)?！钡恼f法。再從亮度上看，酶切開的質(zhì)粒的條帶亮度遠遠亮于未酶切開的質(zhì)粒，相比其他組，我們組酶切效果是比較好；但相比商品化質(zhì)粒的酶

28、切效，我們小組的效果不是很好。在第6條帶以后的條帶的遠處都有寬而暗的模糊條帶，而在商品化pUC19的泳道里,沒有，這應該是未分離干凈的RNA;點樣槽處亮帶可能是附著蛋白質(zhì)的DNA片段、染色體片段等。123A5678910111213141517ItFigure5質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果（我們小組的是第14泳道的，第4泳道是未酶切的pUC19,第5泳道是酶切的商品化質(zhì)粒，第1、3泳道為酶切的入DNA）2、轉(zhuǎn)化結(jié)果觀察與分析實驗設組涂仰平板土苴喬2口果I-試驗組含amp的麥康磯土苴加基50林*2平均每個平板17個菌落，具中2個白斑100林*2平均每個平板40個菌落，具中3個白斑150林*2平均每個平板65個菌落，其中5個白斑200林*2平均每個平板100個菌落n-轉(zhuǎn)化對照含amp的麥康磯土苴加基50林*1多于100個菌落，均為紅斑田-細胞對照含amp的麥康磯土苴加基50林*1沒有菌落不含amp的麥康磯培力、基50林*1菌落數(shù)遠遠大于100個，培養(yǎng)基變?yōu)殚冱S色Figure6轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果及分析氨芳青霉素（amp）用于篩選轉(zhuǎn)化進質(zhì)粒pUC19的大腸桿菌。細胞對照組中的大腸桿菌沒有轉(zhuǎn)入pUC19,而氨芳青霉素抗性存在于pUC19上，所以細胞對照組無法在含amp的培養(yǎng)基上生長，但能在不含amp的培養(yǎng)基上生長。在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落有紅斑和白斑兩種，紅斑是轉(zhuǎn)入空載體的，白斑是轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的，這是由