1、.石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用近10年來(lái)，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越廣泛地被用于人類(lèi)疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類(lèi)基因組并非人們想像的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺失，突變和DNA甲基化類(lèi)型改變等時(shí)有發(fā)生，這些改變對(duì)于基因表達(dá)和調(diào)控，以及疾病過(guò)程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。 醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個(gè)可靠的分子生物學(xué)研究的材料來(lái)源。在石蠟切片上進(jìn)行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過(guò)對(duì)DNA或mRNA分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對(duì)形態(tài)學(xué)家較為熟悉的原位分子生

2、物學(xué)技術(shù)，本節(jié)不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿(mǎn)足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要，結(jié)束了DNA研究依賴(lài)于新鮮或冰凍組織和細(xì)胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評(píng)估等方面均具有重要價(jià)值。本節(jié)重點(diǎn)討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學(xué)及其潛在的應(yīng)用前景。一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來(lái)。Goelz等（1985）最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)（表18-5），是用機(jī)械的方法

3、破碎組織，切除多余的石蠟，直接進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性?xún)?nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過(guò)組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過(guò)兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990）對(duì)上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法

4、所取得DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟1切除多余石蠟，暴露組織2將組織切碎（最大徑<0.5mm），稱(chēng)重；3溶于TE9提取液（組織<50mg/5ml,50500mg/10ml）,高速混懸23min；于48放置24h，其制備見(jiàn)表18-6；4再次混懸組織，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h；5用等體積酚-氯仿溶液抽提3次；62.5倍體積乙醇沉淀DNA7-70放置24h89000×g離心1h9沉淀物用70%乙醇洗1次10干燥，TE（pH7.2）溶解。表18-6 TE9 DNA提取液的制

5、備500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500g/ml蛋白酶KPH8.05m組織切片常規(guī)脫蠟、水化第一次溶液A孵育（去上清）第二次溶液A孵育（留上清）氯仿-異戊醇抽提RNA酶和蛋白酶消化酚抽提沉淀（卻除未螺旋化DNA）透析圖18-6石蠟包埋組織DNA提取流程（Drbeau等，1986）溶液A2×SSC100g 蛋白酶K/ml1% SDS不同類(lèi)型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長(zhǎng)數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需要1015g大片段DNA（20kb），因?yàn)殡s交前要進(jìn)行相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長(zhǎng)度的DNA。故DNA提取要求高，

6、小片段DNA存在會(huì)直接影響雜交信號(hào)。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）則可在相對(duì)粗制的小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的DNA很少，0.5g甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡(jiǎn)便的直接水煮法（Slebos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。這些方法不經(jīng)過(guò)酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來(lái)。此提取物可直接用作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮

7、法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴(kuò)增率較低，且重復(fù)性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標(biāo)本中殘留的固定劑等成分對(duì)Taq DNA多聚酶的抑制所致。二、影響DNA提取質(zhì)量的因素1固定劑對(duì)DNA的影響固定劑的類(lèi)型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988）對(duì)甲醛固定過(guò)程中DNA變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對(duì)甲醛反應(yīng)性可分為兩個(gè)階段：早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化；數(shù)天后堿基對(duì)間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過(guò)程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和

8、純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。bramwell等（1988）發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA）可導(dǎo)致DNA明顯降解。Michels運(yùn)輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）處理標(biāo)本不能獲得完整的DNA。乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990）用無(wú)水乙醇固定標(biāo)本48h，最長(zhǎng)達(dá)2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定標(biāo)本平均DNA產(chǎn)量為26.6g,高于新鮮標(biāo)本（19.4g/mm3）。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化后，乙醇固定

9、組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說(shuō)明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。Sato 等（1990）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無(wú)損。其基本方法為：將組織放至4丙酮浸透，移至-20過(guò)夜。然而再用丙酮分別在4和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60真空浸蠟23h，石蠟包埋。結(jié)果顯示，每10mg AMex法處理的濕重組織提高分子量DNA71.4±14.53g，與新鮮組織產(chǎn)量相當(dāng)（70.4±13.76g）。酶切、電泳和雜交反應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多

10、用途組織處理技術(shù)，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類(lèi)型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對(duì)形態(tài)學(xué)、免疫表型和基因改變的相關(guān)性分析。2固定時(shí)間對(duì)DNA的影響固定過(guò)程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發(fā)生反應(yīng)，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實(shí)果真如此，那么固定的時(shí)間是一個(gè)重要的變異因素。然而，Goelz等沒(méi)有發(fā)現(xiàn)固定時(shí)間對(duì)DNA提取質(zhì)量的明顯影響。Dubeau等認(rèn)為組織固定時(shí)間太短或太長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致DNA的降解。該作者對(duì)固定12h到5天不同時(shí)間間

11、隔標(biāo)本的DNA提取顯示，隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8%。Warford等也發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞懸液經(jīng)30min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30%，由此可見(jiàn)，不同標(biāo)本對(duì)不同固定劑所需的最佳固定時(shí)間應(yīng)摸索選定。根據(jù)Dubeau等經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)組織固定應(yīng)在12h以上至110之內(nèi)。3固定溫度等其他因素對(duì)DNA的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié)，其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補(bǔ)多聚核苷酸；加熱到65時(shí)，氫鍵開(kāi)始斷裂；約90時(shí)，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)

12、下，甲醛與酸反應(yīng)很快，通過(guò)羥甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再?gòu)?fù)性。最近，Koshiba等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過(guò)程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過(guò)應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4），可以明顯改善DNA保存。酸性環(huán)境中DNA的降解已有過(guò)深入的研究。一般認(rèn)為，強(qiáng)酸可導(dǎo)致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng)pH達(dá)到2.5以下時(shí)，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn)N-糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強(qiáng)度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，

13、因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機(jī)理及其預(yù)防有待于進(jìn)一步研究。4組織處理過(guò)程對(duì)DNA的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量在100bp1000bp之間，主要分布于1001500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時(shí)間等因素有關(guān)外，可能的原因還有：組織從外科切除到固定之間的時(shí)間長(zhǎng)短不一。當(dāng)組織未固定或固定不充分時(shí)，核酸酶可自由作用；不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；蠟塊貯存的時(shí)間長(zhǎng)短不一。雖然從

14、不同貯存時(shí)間的蠟塊中提取的DNA大小無(wú)絕對(duì)區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標(biāo)本所獲得的DNA分子量大?？赡芟瀴K中仍存在導(dǎo)致DNA降解的因素。組織的浸蠟和包埋溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均可導(dǎo)致DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性?xún)?nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時(shí)泳動(dòng)速率變慢。三、提高DNA提取質(zhì)量的方法1蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標(biāo)本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)乃啦糠智腥ズ笤儆?。盡可能地選用新近標(biāo)本，緩沖福

15、爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。2DNA提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進(jìn)行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時(shí)間和DNA純化等問(wèn)題上取得了進(jìn)展。DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時(shí)間：SDS可增至1%2%，蛋白酶K200500g/ml，最高可達(dá)1mg/ml；作用時(shí)間一般為24天，最長(zhǎng)可達(dá)7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時(shí)震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發(fā)現(xiàn)，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能

16、夠得到令人滿(mǎn)意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者對(duì)DNA提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（4mol/L）尿素和2-巰基乙醇。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。DNA釋放率對(duì)于不同的組織類(lèi)型是有差異的，取決于組織細(xì)胞密度和細(xì)胞外間質(zhì)的多少。對(duì)于細(xì)胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟），通過(guò)24h孵育80%以上DNA可釋放出來(lái)；相同量的DNA釋放對(duì)于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6天時(shí)間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細(xì)胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA釋放率亦為中等。由此可見(jiàn)，對(duì)不同類(lèi)型的組織DNA提取，蛋白酶K的

17、孵育時(shí)間可作適當(dāng)調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對(duì)于Dubeau等提出的DNA提取過(guò)程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因?yàn)榈汀⒅蟹肿恿康暮怂岽嬖趯?duì)限制性?xún)?nèi)切酶的消化和雜交不起作用。Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進(jìn)行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學(xué)修飾的DNA，可通過(guò)攪起完整的DNA而被動(dòng)除去，因而強(qiáng)調(diào)了螺旋化（spooling）在DNA純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)組織固定時(shí)間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號(hào)強(qiáng)，而未螺旋化DNA信號(hào)減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert 等認(rèn)為未螺旋化DNA不影響進(jìn)行

18、點(diǎn)雜交分析。3避免DNA機(jī)械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅(jiān)韌，很難達(dá)到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成35m薄片，使每一細(xì)胞都被切開(kāi)。但是，我們認(rèn)為切片太薄，容易過(guò)多地將DNA切斷，影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用1520m的厚切片。高濃度蛋白酶K消化24天，使能達(dá)到細(xì)胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機(jī)械性勻漿過(guò)程造成的DNA剪切。此外，在NDA釋放出來(lái)以后的提取過(guò)程中，應(yīng)盡可能輕柔操作，避免過(guò)多地移管。若必需移管時(shí)應(yīng)選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0）溶解放4保存即可，若短期不用時(shí)應(yīng)-20凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免DNA降解。

19、四、石蠟包埋組織DNA分析的方法學(xué)由于DNA提取方法的改善和DNA質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學(xué)研究的常用方法是點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）。1點(diǎn)雜交鑒于包埋組織DNA有一定程度的降解，因而點(diǎn)雜交被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便、快速和實(shí)用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall smith等（1988）采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點(diǎn)膜，進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，在3周內(nèi)對(duì)200多病例進(jìn)行篩選，對(duì)陽(yáng)性病例和很難解釋的弱陽(yáng)性斑點(diǎn)，再進(jìn)行原位雜交等方法作進(jìn)一步證實(shí)。2Southern印跡雜交Southern印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地

20、用于基因突變，擴(kuò)增、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern印跡雜交分析有以下幾個(gè)方面值得注意：（1）當(dāng)所分析的酶切片段長(zhǎng)為300500bp時(shí)，包埋組織DNA雜交信號(hào)強(qiáng)度只有相同量標(biāo)準(zhǔn)DNA的10%85%。信號(hào)強(qiáng)度與原始DNA大小呈正相關(guān)，最小片段DNA產(chǎn)生最弱的信號(hào)。（2）包埋組織DNA所致的非特異性背景雜交比標(biāo)準(zhǔn)DNA為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由于不包含到分析基因中兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的小片段DNA存在。（3）由于背景雜交明顯使得信號(hào)模糊，信/噪比縮小。根據(jù)Goelz的經(jīng)驗(yàn)，約有25%石蠟包埋組織不適于作Southern印跡雜交。（4）某些限制性酶切片段的電泳速

21、度比標(biāo)準(zhǔn)DNA稍遲緩?？赡艿脑蚴荄NA直接或間接的化學(xué)改變使某些限制性酶切位點(diǎn)失活和/或單鏈DNA存在。（5）由于小片段DNA的存在，故用作雜交分析的DNA量應(yīng)適當(dāng)增加，以增強(qiáng)雜交信號(hào)。3PCR分析PCR技術(shù)是近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的典范，已被廣泛地用于分子病理學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。此技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡(jiǎn)便、快速、模板DNA要求不高，特別適于石蠟包埋DNA的分析。用于PCR擴(kuò)增的DNA提取比較簡(jiǎn)單，既使少量DNA樣品亦能產(chǎn)生大量特異性DNA拷貝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可獲得滿(mǎn)意的擴(kuò)增，并可用于診斷。但是，為了提高PCR的敏感性和可重

22、復(fù)性，模板DNA應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應(yīng)的成份。此外，切片過(guò)程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。最近，Davis等（1993）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP）分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是應(yīng)用單鏈DNA在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來(lái)分析PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測(cè)出小到一個(gè)堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點(diǎn)突變和基因多態(tài)性。此外，在包埋組織的DNA提取中往往發(fā)現(xiàn)有RNA的存在。這些未加任何保護(hù)而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。然而，此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為Northern印跡雜交分析的可能材料

23、來(lái)源。五、分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用1基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細(xì)胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig）和T-細(xì)胞受體（TCR）基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標(biāo)，這在國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。Southern印跡雜交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義：惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細(xì)胞增生，不能檢出或擴(kuò)增出克隆性基因重排序列；T和B細(xì)胞性腫瘤的區(qū)分：PCR基因重排支持T細(xì)胞源性，而Ig重鏈基因則為B細(xì)胞源性

24、。然而，一部分病例顯示Ig和TCR基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同時(shí)伴有Ig輕鏈（K或人）基因重排則支持B細(xì)胞腫瘤；同時(shí)伴有TCRr或TCRs基因重排則為T(mén)細(xì)胞腫瘤。另外，也可結(jié)合免疫分型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因?yàn)椴煌耆嘏?、不伴有相?yīng)的抗原受體表達(dá)，故免疫表型上往往是單一的。T細(xì)胞性淋巴瘤的診斷，T細(xì)胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無(wú)克隆性標(biāo)記，故對(duì)此類(lèi)淋巴瘤均有必要進(jìn)行基因分型。T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)性B細(xì)胞淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。殘留病變監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識(shí)別骨髓的累及、治療或骨髓移植后殘余病變的檢測(cè)，以及形態(tài)學(xué)上不能察覺(jué)的早期復(fù)發(fā)的診

25、斷。</P< p>某些淋巴瘤/白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類(lèi)型的基因重排標(biāo)記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的t（14：18）易位，Burkitt氏淋巴瘤的t（8：14）、t（8：2）和t（8：22）易位，以及慢?；蚣绷馨籽≈谐Ｒ?jiàn)的t（9：33）易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價(jià)值不大。2癌基因與抗癌基因的研究分子生物學(xué)在腫瘤病理學(xué)中另一熱點(diǎn)是癌基因和抗癌基因的研究。自從1981年Weinberg 等首先報(bào)道人癌基因分離成功以來(lái)，至今已有50多種癌基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因普遍存在于各種生物細(xì)胞中，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達(dá)受

26、到嚴(yán)格調(diào)控；病理狀態(tài)下，癌基因活化，表達(dá)失控，使細(xì)胞原有的正常生物學(xué)性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。據(jù)報(bào)道，癌基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見(jiàn)于造血系統(tǒng)、乳腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。另一類(lèi)基因稱(chēng)抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、Rb、DCC、WT1和NF1等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達(dá)失控，而誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見(jiàn)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。目前，對(duì)人類(lèi)腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測(cè)，已經(jīng)在腫瘤的分類(lèi)、發(fā)病機(jī)理、腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)

27、后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來(lái)，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。（1）癌變機(jī)理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。已有大量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過(guò)度表達(dá)，一種癌基因?qū)Π屑?xì)胞的永生化起重要作用，而另一種則促進(jìn)細(xì)胞的永生化。（2）腫瘤生物學(xué)待業(yè)和預(yù)后的研究：某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是c erbB 2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等（1992）發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中c erbB 2陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)67%以上，單純癌

28、陽(yáng)性率為26.5%，而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c erbB 2 過(guò)度表達(dá)的乳腺癌預(yù)后不良，Schimmelpenning等（1992）也報(bào)告伴有c erbB 2 擴(kuò)增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周?chē)?rùn)。此外，ras P21在乳腺癌中的表達(dá)也有上述趨勢(shì)。（3）輔助診斷和鑒別診斷：bc1-2基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽(yáng)性表達(dá)率在80%以上，而后者幾乎為陰性；ras癌基因突變或過(guò)度表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細(xì)胞肺癌常伴有n myc突變。（4）癌細(xì)胞的組織發(fā)生：paget 氏病可分乳腺外（EPD）和乳腺內(nèi)（MPD）兩種。有關(guān)paget細(xì)胞的起源問(wèn)題仍有爭(zhēng)議。許良中（1993）觀察了c erbB 2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達(dá)，認(rèn)為MPD中的paget細(xì)胞是來(lái)源于腺癌細(xì)胞而不是表皮的角質(zhì)層細(xì)胞。EPP中的paget細(xì)胞也來(lái)源于腺癌細(xì)胞，但這種腺癌細(xì)胞與MPD中的腺癌細(xì)胞不同，因?yàn)閮烧?/p>