1、第一頁(yè)，共47頁(yè)。高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn) （1）高壓高壓：150-350105 Pa：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過(guò)色譜柱，載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。必須對(duì)載液施加高壓。 （2）高速高速：通常小于：通常小于1h。（可達(dá)。（可達(dá)1-10mL/min30mL/h。）（。）（3）高效高效：大于：大于30000塔板塔板/米米普通填充柱效普通填充柱效1000塔板塔板/m.近來(lái)研近來(lái)研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。究出許多新型固定相，使分離效

2、率大大提高。 （4）高靈敏高靈敏：10-9g （紫外檢測(cè)）、（紫外檢測(cè)）、10-11g （熒光檢測(cè)）（熒光檢測(cè)） 第二頁(yè)，共47頁(yè)。第三頁(yè)，共47頁(yè)。第四頁(yè)，共47頁(yè)。理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理effeffnLH/ 2212)(54. 5)(16WtWtnRReff0ttkR2)1(kknneff理第五頁(yè)，共47頁(yè)。（填充柱）：uCuBAHGC/（毛細(xì)管柱）或uCuBH/pdA2pdAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL第六頁(yè)，共47頁(yè)。為什么？）（忽略縱向擴(kuò)散項(xiàng)：,uCAHHPLCRtnHuuHscm

3、u，但柱效，時(shí)，/1min/1mlu 選擇兼顧柱效和分析時(shí)間，dpA2dpA柱效，nHAdp?0uDCHmdd第七頁(yè)，共47頁(yè)。第八頁(yè)，共47頁(yè)。ssmmCCCCuCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易產(chǎn)生氣泡mmDTCDT第九頁(yè)，共47頁(yè)。pedH2uDdCHsfss2uDdCHmpsmsm2uDdCHmpmm2第十頁(yè)，共47頁(yè)。22114kknRuCAH流動(dòng)相采用粘度小、低流速的勻的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK溫影響?。┵|(zhì)和固定相性質(zhì)（受柱：調(diào)整流動(dòng)相種類、性0ttVVKVCVCWW

4、kRmsmmssms?。┑呐浔龋ㄊ苤鶞赜绊戄^：調(diào)整流動(dòng)相和固定相k第十一頁(yè)，共47頁(yè)。第十二頁(yè)，共47頁(yè)。根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：1 液 液分配色譜法流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶，有一個(gè)明顯的分界面。溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式：smmsVVkCCK第十三頁(yè)，共47頁(yè)。液-液分配色譜與氣-液分配色譜異同：同：分離的順序決定于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保留值大。異：液相色譜中流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)的影響很大，氣相色譜中流動(dòng)相性質(zhì)對(duì)分配系數(shù)影響不大。第十四頁(yè)，共47頁(yè)。液液色譜法中，為避免固定液流失，對(duì)于親水性固定液常

5、采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性，這種情況稱為正相液-液色譜法。若流動(dòng)相極性大于固定相極性，則稱為反相液液色譜法。其出峰順序與正相液液色譜法相反。色譜分離過(guò)程中，由于固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解，以及流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊，固定液不斷流失而導(dǎo)致保留行為的變化，柱效和分離選擇性變壞等不良后果，為更好的解決固定液從載體上流失的問(wèn)題，將各種不同的有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相，從而產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。！反相化學(xué)鍵合相色譜法，在高效液相色譜法中應(yīng)用廣泛。第十五頁(yè)，共47頁(yè)。2 液 固色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑。這是根

6、據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子（S）對(duì)吸附劑活性表面的競(jìng)爭(zhēng)吸附。若溶劑分子吸附性更強(qiáng)，則被吸附的溶質(zhì)分子將相應(yīng)地減少。吸附劑對(duì)分配系數(shù)大的組分吸附力強(qiáng)，相應(yīng)的保留值也大。 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高的選擇性。缺點(diǎn)：非線性等溫吸附會(huì)引起峰拖尾現(xiàn)象。第十六頁(yè)，共47頁(yè)。3 離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法是將一種離子對(duì)色譜法是將一種 ( 或多種或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相與溶質(zhì)分子電荷相反的離子反的離子 ( 稱為對(duì)離子或反離子稱為對(duì)離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中，加到流動(dòng)相或固定相中，使其與

7、溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。溶質(zhì)離子的保留行為。流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子X(jué)+（或帶負(fù)電荷的離子）與固（或帶負(fù)電荷的離子）與固定相或流動(dòng)相中帶相反電荷的對(duì)離子定相或流動(dòng)相中帶相反電荷的對(duì)離子Y-結(jié)合，形成離子對(duì)化結(jié)合，形成離子對(duì)化合物合物X+ Y- ，然后在兩相間進(jìn)行分配。，然后在兩相間進(jìn)行分配。 YX Y -K-XY有機(jī)相水相水相X第十七頁(yè)，共47頁(yè)。平衡常數(shù) KXY水相水相有機(jī)相YX-YXKXY溶質(zhì)分配系數(shù) DX水相水相有機(jī)相YKX-XYYXDX離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法（流動(dòng)相和固定

8、相）正相離子對(duì)反相離子對(duì)反相離子對(duì)極性流動(dòng)相（含Y-）（甲醇-水，乙腈-水等）試樣離子X(jué)+疏水性離子對(duì)X+Y-X+Y-在固定相表面分配吸附。第十八頁(yè)，共47頁(yè)。容量因子k1水相YKVVDkXYMSX滯留因子：Rs=1/(1+k)=us/u, tR=L/us）水相11 (YKuLtXYR可用于生化試樣（核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿及藥物等分離?？稍陔x子對(duì)生成時(shí)，引入紫外吸收或熒光基團(tuán)，從而提高檢測(cè)靈敏度。第十九頁(yè)，共47頁(yè)。4. 離子交換色譜法離子交換色譜法是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。凡是在溶劑中

9、能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。5. 離子色譜法用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。洗脫反應(yīng)則為交換反應(yīng)的逆過(guò)程.第二十頁(yè)，共47頁(yè)。6 空間排阻色譜法空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨

10、流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子， 首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。 可用于在流動(dòng)相中可溶的，分子質(zhì)量差別在10%以上的分子。第二十一頁(yè)，共47頁(yè)。液 - 液色譜法、鍵合色譜法及離子對(duì)色譜法固定相所用的擔(dān)體可分為如下幾類： 全多孔型擔(dān)體是顆粒均勻的多孔球體。 100m表層多孔型擔(dān)體 又稱薄殼型微珠擔(dān)體。從開(kāi)始的直徑為 30 40 m 的實(shí)心核 ( 玻璃微珠 ) ，表層上附有一層厚度約為 1 2m 多孔表面 ( 多孔硅膠 ) 。 目前多為5-10

11、m的全多孔微粒擔(dān)體，缺點(diǎn)：固定液機(jī)械涂附在擔(dān)體上，固定液流失不可避免。為克服此缺點(diǎn)，出現(xiàn)新型固定相化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相 第二十二頁(yè)，共47頁(yè)。(3) 化學(xué)鍵合固定相 即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面。根據(jù)在硅膠表面 ( 具有 Si OH 基團(tuán) ) 的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型 ( Si O C ) ；硅氧硅碳鍵型 ( SiOSiC ) 硅碳鍵型（ SiC ）和硅氮鍵型（ SiN ）四種類型。 化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)： . 表面沒(méi)有坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多； . 無(wú)固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； . 可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地

12、改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測(cè)器和餾分的收集。 第二十三頁(yè)，共47頁(yè)?；瘜W(xué)鍵合相色譜應(yīng)用第二十四頁(yè)，共47頁(yè)。第二十五頁(yè)，共47頁(yè)。第二十六頁(yè)，共47頁(yè)。第二十七頁(yè)，共47頁(yè)。2 液固吸附色譜法固定相采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。分為全多孔型和薄殼型。目前多為5-10m全多孔型硅膠微粒3 離子交換色譜法固定相（ 1 ）薄膜型離子交換樹(shù)脂即以薄殼玻珠為擔(dān)體，在它的表面涂約 1% 的離子交換樹(shù)脂而成。 （ 2 ）離子交換鍵合固定相用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在惰性擔(dān)體表面。4 排阻色譜法固定相（ 1 ）軟質(zhì)凝膠如葡聚糖凝膠、

13、瓊脂糖凝膠等，適用于水為流動(dòng)相。 （ 2 ）半硬質(zhì)凝膠如苯乙烯二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠（交聯(lián)聚苯乙烯凝膠）是應(yīng)用最多的有機(jī)凝膠，適用于非極性有機(jī)溶劑。 （ 3 ）硬質(zhì)凝膠如多孔硅膠、多孔玻珠等，多孔硅膠是用得較多的無(wú)機(jī)凝膠。 第二十八頁(yè)，共47頁(yè)。第二十九頁(yè)，共47頁(yè)。高效液相色譜儀典型結(jié)構(gòu)示意圖第三十頁(yè)，共47頁(yè)。（） 往復(fù)式柱塞泵 當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開(kāi)，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開(kāi)，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變

14、化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。第三十一頁(yè)，共47頁(yè)。（2）氣動(dòng)放大泵 其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動(dòng)大面積（ SA ）活塞 A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 105Pa的氣體就可得到壓力為 250 105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。第三十二頁(yè)，共47頁(yè)。2 梯度洗提梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過(guò)載液中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素(容量因子

15、和選擇性因子），以提高分離效果。梯度洗提可以分為低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱。高壓梯度 ( 或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：將溶劑用高壓泵增壓后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，混合后送入色譜柱。第三十三頁(yè)，共47頁(yè)。第三十四頁(yè)，共47頁(yè)。第三十五頁(yè)，共47頁(yè)。 第三十六頁(yè)，共47頁(yè)。液相色譜儀操作視頻資料液相色譜儀操作視頻資料第三十七頁(yè)，共47頁(yè)。如何應(yīng)用高效液相色譜對(duì)試樣分離、分析：因綜合考慮各種因素：試樣的性質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、溶解度等化學(xué)和物理性質(zhì)）。液相色譜分離類型的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍。實(shí)驗(yàn)室條件（儀器、色譜柱等）1.第三十八頁(yè)，共47頁(yè)。液相

16、色譜分離類型選擇參考表第三十九頁(yè)，共47頁(yè)。簡(jiǎn)單分析教材中提到的實(shí)例，解釋原因。第四十頁(yè)，共47頁(yè)。第四十一頁(yè)，共47頁(yè)。1.色譜柱柱容量（柱負(fù)載）：分析型色譜柱柱容量：指在不影響柱效能情況下最大進(jìn)樣量。通常進(jìn)樣量小于1mg/g吸附劑，保留值k和柱效H不隨進(jìn)樣量改變而變化。超過(guò)此進(jìn)樣量，色譜柱超載，柱效大幅度降低，峰形變寬，分離度變差，保留值也發(fā)生變化。進(jìn)樣量越大柱效越低，分離度越差，是制備色譜主要限制之一。制備色譜柱柱容量：指在不影響收集物純度前提下最大進(jìn)樣量。制備柱允許過(guò)載，但柱效降低不宜過(guò)半或容量因子中減少超過(guò)10%。第四十二頁(yè)，共47頁(yè)。第四十三頁(yè)，共47頁(yè)。2. 液相制備色譜方法A、欲分離組分呈現(xiàn)一個(gè)單峰n在分析型HPLC上進(jìn)行試驗(yàn)，n利用色譜分離基本方程，通過(guò)k、，n值的優(yōu)化提高分離度。n增加進(jìn)樣量直到色譜峰發(fā)生重疊，在柱負(fù)荷極限內(nèi)，擴(kuò)大柱徑，以提高允許最大試樣量，并擴(kuò)大輸液泵流量，分離出純組分。n若要獲得更大量的純物質(zhì)，可使柱超載運(yùn)行，此時(shí)產(chǎn)生峰重疊，按中心切割法收集少量餾分，以分析