1、T SPOT TB技術(shù)用于輔助診斷結(jié)核臨床病例報道莫凌，孟成艷，張舒，金嘉琳，張文宏作者單位：200040 上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科通訊作者：張文宏，Email：zhangwenhong退修稿：0074基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2005CB523102）近年來，我國結(jié)核病的發(fā)病率有上升趨勢，臨床上經(jīng)常會遇到一些癥狀不典型的結(jié)核病和肺外結(jié)核病，而目前可用于診斷結(jié)核病的方法有限，同時又缺乏快速敏感的實驗室技術(shù)，為結(jié)核病的早期診斷與治療帶來困難。ELISPOT（enzyme-linked immunospot assay,酶聯(lián)免疫斑點法）技術(shù)是一種新型的免疫酶技術(shù)，它是從單細胞水平

2、檢測分泌抗體細胞或分泌細胞因子細胞1。由ELISPOT發(fā)展來的T SPOT TB（結(jié)核感染T細胞斑點試驗）技術(shù)就是通過檢測結(jié)核感染后T淋巴細胞分泌的特異性的細胞因子IFN-來診斷是否存在結(jié)核感染。1ELISPOT技術(shù)原理該方法源于Mahairas等在1996年發(fā)現(xiàn)的一段存在結(jié)核分枝桿菌中名為“RD1”的基因序列2，而在卡介苗菌株和大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏RD1序列。RD1編碼產(chǎn)生兩種蛋白：ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein），ESAT-6和CFP-10作為特異性抗原刺激機體T淋巴細胞產(chǎn)生特異性的細胞因子IFN-。 根據(jù)這一原理，T SPOT技

3、術(shù)利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細胞中存在結(jié)核特異的活化T淋巴細胞，這些淋巴細胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌干擾素而設計的T細胞免疫斑點試驗。外周血單核細胞，結(jié)核特異的混合抗原A和混合抗原B（分別為ESAT-6和CFP-10的部分多肽片斷），對照試劑一起加入預先包被抗干擾素抗體的微孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。當外周血單核細胞中存在針對結(jié)核桿菌的效應T淋巴細胞時，培養(yǎng)液中加入的結(jié)核桿菌特異混合抗原多肽A和B將刺激這些效應T淋巴細胞分泌干擾素。分泌的干擾素被微孔板上的抗體捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標記并針對干擾素不同表位的抗體與被捕獲的干擾素結(jié)合，滯留在微孔板表面。顯色底物溶液在反應部位被酶分解形成不溶性

4、色素沉淀斑點。每一個斑點代表一個干擾素分泌細胞（結(jié)核特異的效應T細胞）。通過對斑點進行計數(shù)可以推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應的效應T細胞，從而對結(jié)核桿菌感染進行輔助診斷。2ELISPOT操作方法采集8ml患者的血液加入含檸檬酸鈉的CPT采血管，分離外周血單個核細胞（PBMC），加入細胞培養(yǎng)液，輕輕重懸細胞。在已包被抗IFN-抗體的微量板的4個孔中，分別加入細胞培養(yǎng)液作為陰性對照，植物血凝素PHA作為陽性對照，結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽A和B，分別含ESAT-6與CFP-10（Oxford Immunote Ltd., Oxford, UK）。然后在每個孔中加入含250000個細胞的上述懸液。把微

5、量板放在37培養(yǎng)16-20小時后，用PBS液洗板4次，加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-單抗，在2-8下孵育1小時。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入顯色底物液BCIP/NBTPLUS，室溫中靜置7分鐘后觀察結(jié)果，并用計算機輔助成像分析系統(tǒng)進行斑點閱讀與統(tǒng)計（ELISPOT試劑盒由上海復星科技有限公司提供）。第一孔為陰性對照孔，第二孔為陽性對照孔，如出現(xiàn)斑點，說明試驗成功。第三，四孔為實驗孔，當測試孔A或B達到以下標準則判定為陽性結(jié)果：（1） 如果陰性對照孔斑點數(shù)為0-5個，測試孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)6。（2） 如果陰性對照孔斑點數(shù)6個，測試孔斑點數(shù)必須2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。3

6、ELISPOT的臨床應用我院傳染科首次將T SPOT TB技術(shù)用于臨床，輔助診斷疑似結(jié)核患者，為結(jié)核病的診斷提供了一項新的技術(shù)，并取得一定成效。現(xiàn)將一例經(jīng)T SPOT TB 技術(shù)鑒別診斷后得到有效治療反應的病例報道如下。31病例報道患者，男，62歲。入院前3月無誘因下出現(xiàn)頸部疼痛,一月前出現(xiàn)左上肢麻木,進行性乏力，伴發(fā)熱，體溫在38度左右，無畏寒，寒戰(zhàn)，無咳嗽，咳痰，無消瘦，盜汗等。入院查體，精神較萎，左側(cè)頸部可捫及腫大淋巴結(jié)，質(zhì)軟，無壓痛。心肺無特殊，腹軟，肝脾肋下未及。頸軟，克氏征（-），布氏征（-），余病理征均陰性。左上肢肌力3級，肌張力可，余肢體肌力，肌張力正常。輔助檢查，血常規(guī)：白細

7、胞9.42×109/L,中性粒細胞72%。腦脊液：白細胞 2×106/L，總蛋白 983mg/L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物 120mmol/L。腦脊液抗酸染色，細菌涂片培養(yǎng)，真菌涂片培養(yǎng)均陰性。頸椎MRI：多發(fā)椎體異常信號伴硬膜增厚（圖1）。頭顱MRI示：雙側(cè)額葉、側(cè)腦室旁多發(fā)斑點狀異常信號（圖2）。高度懷疑頸部與顱內(nèi)異常信號為轉(zhuǎn)移性腫瘤可能大，但骨髓穿刺，腹部B超，腹部CT，頸部淋巴結(jié)活檢均未發(fā)現(xiàn)異常。PPD（-）。圖1：A圖為該患者治療前頸椎MRI：在頸2-4椎體之間有異常信號，并有硬脊膜增厚。B圖為治療后同一部位的MRI：可見原先的異常信號降低，硬脊膜增厚略有

8、減輕。圖2：該患者頭顱MRI?？梢妭?cè)腦室旁有圓形異常信號。32結(jié)果用T SPOT TB檢測該患者血液標本，結(jié)果陽性（圖3）。于是對該患者行診斷性抗癆治療，方案為四聯(lián)（異煙肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇），同時加用甲強龍30mg。治療3天后，患者體溫平，治療一周后，患者頸部疼痛好轉(zhuǎn)，左上肢肌力逐漸恢復，兩周后，患者左上肢肌力基本恢復正常。復查頸部MRI示：原先異常信號減弱，硬脊膜增厚減輕（圖1-B）?；颊叱鲈簳r仍維持四聯(lián)抗癆治療，激素減為強的松20mg ，囑患者隨訪。從該病人的治療反應診斷該患者為結(jié)核性腦脊髓膜炎和椎體結(jié)核。圖3：該病例的ELISPOT結(jié)果。其中第一行為陰性對照孔，第二行為陽性對

9、照孔，第三，四行為實驗孔。圖中可見第3孔中出現(xiàn)大量斑點，為陽性結(jié)果。每個斑點代表一個分泌INF- 的T細胞。用計算機輔助成像技術(shù)進行斑點計數(shù)得到4個孔的斑點數(shù)分別為2，832，401，0。33討論該患者是肺外結(jié)核感染，缺乏典型的結(jié)核中毒癥狀，如消瘦，盜汗等，影像學檢查發(fā)現(xiàn)頸椎，頭顱有異常信號，從形態(tài)學上傾向于轉(zhuǎn)移性腫瘤，但對常見腫瘤的篩查未發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的跡象，腦脊液檢查只有蛋白較高，細胞數(shù)無明顯升高。常見的結(jié)核檢查，如PPD試驗，腦脊液抗酸染色，涂片均為陰性，淋巴結(jié)活檢也未發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染病灶。在這種情況下，我們用ELISPOT技術(shù)對其血液進行檢測，結(jié)果提示陽性。當然，ELISPOT不是診斷結(jié)核的

10、金標準，所以我們不能就此確診為結(jié)核。于是對病人行診斷性抗癆治療，從抗癆治療的反應來看，患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)，由此判斷治療有效，證實該患者為結(jié)核感染診斷成立。目前，臨床診斷結(jié)核的方法有限。結(jié)核菌素試驗（TST）是臨床常用篩查結(jié)核的免疫學方法，雖然操作簡單，觀察結(jié)果方便，但由于其有較高的假陽性和假陰性，對臨床結(jié)核病的診斷意義不大。細菌學是診斷結(jié)核的金標準，但培養(yǎng)需要兩個月的時間，而且陽性率取決于采集標本中細菌的數(shù)量，不利于早期診斷與治療。影像學作為輔助診斷方法，對活動性肺結(jié)核診斷有一定價值，但對肺外結(jié)核診斷存在困難。ELISOPT法作為一種新的酶免疫檢測方法在國外（主要是英國與美國）新近剛開始用于結(jié)核

11、桿菌感染的檢測，它不僅靈敏度高，特異性強3，而且操作簡單，需時少，一般兩天就能看到結(jié)果。在國內(nèi)也已經(jīng)進入試驗性的診斷階段，但尚缺乏大規(guī)模的臨床實驗及評價。Susan等在一項前瞻性、雙盲隊列研究中得到ELISPOT的敏感性為83%，顯著高于皮試的敏感性63%，同時，非結(jié)核病人不會產(chǎn)生假陽性。在小于3歲，合并HIV感染及營養(yǎng)不良的兒童中，皮試的敏感性顯著下降，而ELISPOT的敏感性沒有顯著性改變4。另有研究得到ELISPOT在普通人群中的敏感性為96%，在健康人群中的特異性為100%，在HIV陽性患者中的特異性為92%5。目前該技術(shù)已在國外廣泛用于活動性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染者的診斷，HIV合并結(jié)

12、核感染的檢測，用于區(qū)別結(jié)核感染者與BCG接種以及耐藥結(jié)核菌感染的快速檢測。4總結(jié)綜上所述，ELISPOT作為一種新的檢測結(jié)核感染的酶免疫學方法,其敏感性與特異性顯著高于傳統(tǒng)的TST,而且所需時間少，有利于結(jié)核病的早期診斷與治療意義重大，對隱性結(jié)核感染也有診斷價值。但由于價格昂貴,不如TST操作簡便易行,限制了該方法在臨床的推廣與應用。我院首次將該方法試驗性的用于輔助臨床診斷，并取得一定成效，在臨床癥狀不典型，PPD診斷不明確，涂片及培養(yǎng)均為陰性的疑似結(jié)核病患者中，輔以ELISPOT方法，可以幫助確診結(jié)核感染。參考文獻1侯世芳，許賢豪，劉廣志等，酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）技術(shù)的應用. 中國神

13、經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2002;10（9）:200-202.2 Lalbani A.Spotting latent infection:the path to better tuberculosis control.Thorax 2003;58:916-9183 Philip C, Roger H, Annette F, et al. Large-scale evaluation of enzyme-linked immunospot assay and skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infectection against a gradient of exposure in the Gambia.Clin Infect Dis.2004;38:966-973.4Liebeschuetz S, Bamber S, Ewer K,et al.Diagnosis of tuberculosis in South African children with a T-cell-based assay: a prospective cohort study. Lancet. 2004;364(9452):2196-2203.5